Un modello murino standardizzato con un flusso di lavoro a tre persone per studiare il rifiuto acuto cellulare e mediato dagli anticorpi nella xenotrapiantialità

Sommario

Questo studio stabilisce due modelli standardizzati di xenotrapianto murino per replicare specificamente il rigetto cellulare acuto e il rigetto acuto mediato da anticorpi. Questi modelli rappresentano una piattaforma affidabile per indagare i meccanismi del rigetto immunitario degli xenotrapianti, valutare strategie immunosoppressive e far progredire la ricerca preclinica sugli xenotrapianti.

Abstract

Nonostante i recenti progressi nella xenotrapiantazione, il rifiuto acuto rimane un ostacolo importante alla sua applicazione clinica. Il rigetto cellulare acuto (ACR) e il rigetto acuto mediato dagli anticorpi (AMR) sono le principali risposte immunitarie che portano a un fallimento precoce dell'innesto nei riceventi di xenotrapi. Sebbene modelli animali di grandi dimensioni come primati non umani e maiali geneticamente modificati abbiano fornito preziose informazioni, il loro utilizzo è limitato da costi elevati, vincoli etici e significativa variabilità sperimentale. I modelli di piccoli animali offrono un'alternativa pratica e riproducibile agli studi meccanicistici del rigetto immunitario. In questo studio sono stati sviluppati due modelli standardizzati di xenotrapiante murino per imitare specificamente ACR e AMR. Per garantire la riproducibilità e minimizzare la variabilità legata all'operatore, è stato implementato un protocollo chirurgico strutturato a tre persone con un flusso di lavoro in catena di assemblaggio, consentendo una generazione costante del modello con alta efficienza e qualità. I modelli risultanti non solo replicano le principali caratteristiche immunopatologiche del rigetto clinico degli xenoinnesti, ma offrono anche una solida piattaforma per indagare i meccanismi immunitari e valutare strategie immunosoppressive mirate. Questi modelli aiuteranno ad accelerare lo sviluppo preclinico delle terapie di xenotrapiantamento.

Introduzione

Lo xenotrapianto è emerso come una delle strategie più promettenti per affrontare la carenza di organi donatori per il trapianto. Negli ultimi anni, i rapidi progressi nelle tecnologie di editing genetico, nelle strategie di regolazione immunitaria e nell'ingegneria biomedica hanno portato a progressi significativi in questo^{campo 1}. Negli ultimi tre anni, numerosi team di ricerca in tutto il mondo hanno condotto studi clinici su xenotrapianto nell'uomo, inclusi due casi di trapianto di cuore di maiale geneticamente modificato presso l'Università del Maryland, uno studio di trapianto di rene di maiale presso il Massachusetts General Hospital e uno studio di trapianto di timorene presso la New York^University 2,3,4,5 . Nonostante questi progressi senza precedenti, il rigetto immunitario rimane la principale sfida che limita l'applicazione clinica dello xenotrapiantamento. Anche con organi donatori geneticamente modificati altamente ottimizzati e regimi immunosoppressivi combinati, il rigetto rimane un ostacolo importante. Gli studi attuali indicano che il rigetto acuto rappresenta un ostacolo critico nella xenotrapianti, classificato principalmente in rigetto cellulare acuto (ACR) e rigetto acuto mediato dagli anticorpi (AMR). L'ACR è principalmente mediata dalle cellule T, caratterizzate da un'estesa infiltrazione di cellule T nell'innesto, che porta a danni tissutali e compromissione funzionale. I suoi meccanismi sottostanti coinvolgono la presentazione xenogenica dell'antigene, l'attivazione delle cellule T e il rilascio di citochine^{infiammatorie 6,7}. Al contrario, la RAM è guidata da anticorpi specifici del donatore già formati o appena generati. Questi anticorpi si legano alle cellule endoteliali all'interno dell'innesto, scatenando l'attivazione del complemento e una forte risposta immunitaria, portando infine a lesioni microvascolari, trombosi e insufficienza dell'innesto ^8,9,10. Pertanto, una comprensione più profonda di questi meccanismi di rigetto e lo sviluppo di strategie immunoregolatrici più precise sono essenziali per far avanzare lo xenotrapianto dalla ricerca preclinica all'applicazione clinica a lungo termine.

Per affrontare la sfida del rifiuto acuto nella xenotrapiantazione, è essenziale tornare alla ricerca fondamentale e agli studi preclinici per chiarire i meccanismi immunologici sottostanti. I modelli animali di grandi dimensioni, in particolare primati non umani (NHP) e maiali geneticamente modificati, sono stati ampiamente utilizzati nella ricerca sugli xenotrapianti grazie alle loro strette somiglianze anatomiche e fisiologiche con gli esseri umani. Questi modelli forniscono approfondimenti fondamentali sui meccanismi di rigetto immunitario e sulle strategie immunomodulatrici. Tuttavia, la loro applicazione è significativamente limitata da costi elevati, considerazioni etiche e complessità delle cure post-operatorie a lungo termine. Inoltre, la sostanziale variabilità delle risposte immunitarie tra i singoli NHP influisce sulla riproducibilità dei risultati^sperimentali 11,12,13. Sebbene i modelli animali di grandi dimensioni rimangono indispensabili per la traduzione clinica, i loro limiti in fattibilità e coerenza sperimentale sottolineano l'urgente necessità di modelli animali di piccolo dimensioni più economici, scalabili e meccanicisticamente rilevanti.

A causa di queste sfide, i modelli animali di piccole dimensioni hanno acquisito crescente importanza nella ricerca sugli xenotrapianti grazie al loro basso costo, ai cicli sperimentali brevi e alla facilità di applicazione su larga scala. Questi modelli non solo forniscono una piattaforma essenziale per studiare i meccanismi di riflusso immunitario, ma fungono anche da ponte fondamentale tra gli studi in vitro e gli esperimenti su grandi animali, facilitando un'esplorazione più precisa delle strategie immunoregolatrici. In questo studio sono stati stabiliti due modelli standardizzati di xenotrapiante murino che imitano specificamente ACR e AMR. Per garantire riproducibilità e coerenza, è stato implementato un protocollo chirurgico standardizzato a tre persone e un approccio semplificato e in catena di montaggio alla generazione dei modelli. Questo flusso di lavoro standardizzato minimizza la variabilità dipendente dall'operatore, risultando in modelli di trapianto cardiaco altamente uniformi. Questi perfezionamenti forniscono una piattaforma affidabile per indagini meccanicistiche e la valutazione di nuove strategie immunosoppressive. Questo protocollo è particolarmente adatto ai ricercatori che conducono studi su piccoli animali sui meccanismi immunitari di xenotrapianto e nella valutazione di strategie immunosoppressive. Offre vantaggi come basso costo, alta riproducibilità e un flusso di lavoro standardizzato, fornendo una base sperimentale affidabile per studi successivi su grandi animali e preclinici.

Protocollo

Questo protocollo può essere eseguito da un singolo operatore o da un team di tre persone, con ogni membro responsabile rispettivamente del prelievo del cuore donatore, della preparazione del ricevente e dell'anastomosi del cuore donatore. L'intera procedura viene completata in 10 minuti, consentendo una generazione rapida, ad alta velocità e standardizzata del modello.

Gli esperimenti sugli animali in questo studio sono stati approvati dal Comitato per la Cura e l'Uso Istituzionale degli Animali (IACUC) dell'Ospedale di Fuwai, Accademia Cinese delle Scienze Mediche (Approvazione n. 0108-1-70-ZX(X)-41). Tutte le procedure sono state eseguite in rigorosa conformità con le normative sul benessere animale e le linee guida etiche per garantire il rispetto degli standard pertinenti. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione preoperatoria

1. Preparazione dei polsini
   1. Utilizzare tubi di poliimide per fabbricare i bracciali per la chirurgia di trapianto. Per il bracciale arterioso, selezionare tubi in poliimide con diametro interno di 0,3–0,5 mm e tagliarli in segmenti da 2 mm sotto stereomicroscopio (ingrandimento 10×–20×).
   2. Taglia parzialmente la sezione di morsa di ogni segmento a metà circonferenzialmente per formare un'estensione simile a un manico. Per il bracciale venoso, si seleziona un tubo di poliimide con diametro interno di 0,4–0,7 mm e taglialo in segmenti da 3 mm. Allo stesso modo, taglia parzialmente la sezione della pinza a metà in circonferenza per creare un'estensione simile a un manico.
      NOTA: Immergi i polsini in etanolo al 75% per 30 minuti, poi risciacqua accuratamente con soluzione salina normale.
2. Preparazione dei topi: utilizzare come donatori ratti neonatali Sprague-Dawley (SD) di età compresa tra 10 e 12 giorni, e topi C57BL/6 o Balb/c tra 7 e 8 settimane come ricevitori. Per garantire cure adeguate e ridurre lo stress, trasporta i ratti donatori neonatali insieme alla madre. Alloggiare tutti gli animali in un ambiente specifico privo di patogeni (SPF).

2. Prelievo del cuore da donatore

1. Fissazione e anestesia
   1. Anestetizzare i ratti neonatali tramite iniezione intraperitoneale di 30 μL/g tribromoetanolo (Jitianbio, JT0781) (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati).
   2. Una volta completamente anestetizzato, posizionare il ratto in posizione supina e fissarlo sotto uno stereomicroscopio. Disinfetta l'area toracoaddominale usando palline di cotone imbevute di povidone e iodio.
      NOTA: Maneggiare il tribromoetanolo con guanti e protezione per gli occhi in un'area ventilata; Evita il contatto con la pelle e l'inalazione.
2. Eparinizzazione
   1. Disinfetta l'area toracoaddominale usando palline di cotone imbevute di povidone e iodio. Sposta delicatamente l'intestino di lato usando un cotton fioc per esporre la vena cava inferiore.
   2. Iniettare soluzione salina eparinizzata (0,2–0,5 mL) nella vena cava inferiore utilizzando una siringa per insulina, seguita da una compressione delicata del sito di iniezione con un batuffolo di cotone per prevenire il sanguinamento.
      NOTA: Indossare guanti e protezione oculare durante la preparazione o iniezione di soluzione salina eparinizzata; Smaltire le siringhe come rifiuti taglienti. Prepara soluzione salina eparinizzata sciogliendo una fiala di eparina di sodio di grado medico (125 mg) in 100 mL di soluzione salina normale.
3. Arresto cardiaco
   1. Incisci il diaframma, taglia la parete toracica bilateralmente e ritragila per esporre completamente il cuore. Rimuovi il timo. Recidere la vena cava superiore per alleviare la pressione e perfondere 1 mL di soluzione dell'Università del Wisconsin (UW) nell'aorta per indurre l'arresto cardiaco.
   2. Continua la perfusione finché il cuore non cambia dal rosso al pallido. Contemporaneamente, posiziona una garza imbevuta di soluzione salina gelida sul cuore per abbassare la temperatura e prevenire la disidratazione.
      NOTA: Taglia la garza sterile in pezzi da 1 cm × 1 cm e pre-immergile in soluzione salina gelida prima dell'uso.
4. Prelievo del cuore donatore
   1. Legare la vena cava superiore e inferiore con una sutura di seta 8–0, poi tranciarle. Taglia l'aorta all'arco aortico e recidi l'arteria polmonare nella sua biforcazione.
   2. Infine, legare tutte le vene polmonari con un 8-0 sutura di seta ed escludere il cuore donatore. Conserva temporaneamente il cuore raccolto in soluzione salina gelida per la conservazione.

3. Preparazione del destinatario

1. Anestesia
   1. Anestetizzare il topo ricevente con lo stesso metodo e posizionarlo in posizione supina per stabilizzarlo.
2. Disinfezione
   1. Rimuovere i peli dalla zona del collo con una crema depilatoria, seguita da una disinfezione cutanea con povidone-iodio.
3. Incisione cutanea
   1. Effettuare un'incisione longitudinale di 2 cm circa 1 cm a destra della linea mediana sul collo usando forbici oftalmiche. Esegui una dissezione contusiva per rimuovere gradualmente gli strati di grasso e muscolari sottocutanei ed espellere la ghiandola submandibolare.
      NOTA: Durante l'estinzione della ghiandola submandibolare, i vasi sanguigni basali devono essere legati con una sutura di seta 8–0 o cauterizzati con una penna elettrocauterizzante per prevenire l'emorragia.
4. Preparazione della vena giugulare esterna
   1. Dopo aver esposto la vena giugulare esterna, cauterizzare singolarmente i rami utilizzando un recinto elettrocauterizzato impostato in modalità di coagulazione bassa (5–10 W). Secondo posto 8-0 suture di seta vicino all'estremità distale della vena per la legatura.
   2. Usa forbici microchirurgiche per tagliare la vena giugulare esterna tra le due legature. Inserire la vena giugulare esterna attraverso il bracciale venoso, spingere il bracciale alla base della vena e fissarlo con una pinza vascolare.
   3. Rimuovere le legature con forbici microchirurgiche e lavare il sangue residuo nella vena usando soluzione salina eparinizzata. Everti la vena giugulare esterna sopra il bracciale usando una pinza microchirurgica e fissala con un 8-0 Sutura di seta.
      NOTA: Usa con attenzione la penna elettrocauterizzante e fai attenzione a evitare ustioni. La vena giugulare esterna ha più affluenti che devono essere isolati e sigillati con cura per minimizzare l'emorragia.
5. Preparazione dell'arteria carotide
   1. Eseguire una dissezione contusa posteriore al muscolo sternocleidomastoideo per localizzare la guaina carotidea. Apri la guaina carotide e separa con attenzione l'arteria carotide comune dalla vena giugulare interna e dal nervo vago.
   2. Legare e trasettare l'arteria nello stesso modo della vena. Inserisci l'estremità inferiore dell'arteria tranzata attraverso il bracciale arterioso, evertila e fissala in posizione.
      NOTA: L'arteria carotide, la vena giugulare interna e il nervo vago sono racchiusi all'interno della guaina carotidee. Quando si apre la guaina, bisogna fare attenzione a non danneggiare il nervo vago. L'arteria carotide ha un diametro minore rispetto alla vena giugulare esterna ma è più elastica, rendendo l'eversione più difficile rispetto a quella della vena.

4. Anastomosi cardiaca da donatore

1. Anastomosi arteria-carotide da aorta a carotide
   1. Dopo aver rifilato il cuore donatore, posizionalo immediatamente nel collo del topo ricevente. Usa un 8-0 Sutura di seta con un nodo sciolto per creare un anello attorno all'aorta donatrice.
   2. Fai passare l'aorta donatrice sopra il bracciale arterioso sull'arteria carotide del ricevente e fissarla con un 8-0 legatura di seta.
      NOTA: Durante il fissaggio dell'aorta, la sutura deve essere legata sopra la linea di legatura dell'arteria carotide per evitare il contatto diretto tra il sito della legatura e il sangue del ricevente.
2. Anastomosi da arteria polmonare a vena giugulare esterna
   1. Usa un 8-0 Sutura di seta con un nodo allentato per creare un anello attorno all'arteria polmonare donatrice. Fai passare l'arteria polmonare sopra il bracciale venoso sulla vena giugulare esterna del ricevente e fissarla con un 8-0 legatura di seta.
3. Ripresa cardiaca
   1. Rilascia le pinze vascolari sull'arteria carotide e sulla vena giugulare esterna del ricevente per ripristinare il flusso sanguigno. Osserva che il cuore donatore riprende forti contrazioni e diventa rapidamente rosso entro 10 secondi.
4. Chiusura dell'incisione
   1. Una volta che il cuore donatore ha recuperato un ritmo stabile, si corregge la posizione e si chiude l'incisione cutanea sul collo del ricevente con suture 4-0. Disinfetta il sito chirurgico con povidone-iodio.

5. Cure post-operatorie

1. Analgesia postoperatoria
   1. Applica il gel di lidocaina topicamente per alleviare il dolore dopo aver completato la chiusura della pelle. Se il topo mostra segni significativi di dolore, somministrare meloxicam (2 mg/kg) tramite iniezione intraperitoneale.
      NOTA: Il Meloxicam è disciolto in 10% di DMSO e 90% di olio di mais, e il volume di iniezione viene calcolato in base alla dose richiesta.
2. Recupero
   1. Posiziona il mouse su un tappetino caldo e morbido mantenuto a 37–38 °C per preservare la temperatura corporea e monitoralo finché non riprende conoscenza. Una volta completamente sveglio, tieni il topo singolarmente in una gabbia con accesso adeguato a cibo e acqua.
3. Monitoraggio
   1. Monitorare quotidianamente il cuore trapiantato tramite ispezione visiva e palpazione per valutarne il battito e la vitalità complessiva dell'innesto.
      NOTA: Eseguire tutte le procedure utilizzando DPI appropriati e rispettare le normative istituzionali sulla biosicurezza e la cura degli animali. Tutti i residui chimici, i perfusati e i tessuti animali generati durante l'esperimento devono essere raccolti e smaltiti secondo le normative istituzionali. Le soluzioni contenenti tribromoetanolo o eparina dovrebbero essere trattate come rifiuti chimici pericolosi, mentre i tessuti animali e i materiali derivati dal sangue dovrebbero essere gestiti come rifiuti biologici e sterilizzati tramite autoclaving o smaltiti tramite strutture certificate.

Risultati

La Figura 1 mostra il flusso di lavoro collaborativo standardizzato a tre persone per generare un modello di xenotrapianto murino. In questo sistema, tre operatori lavorano in parallelo, ciascuno svolgendo ripetutamente un compito designato: preparazione del ricevente, procuramento del cuore donato o anastomosi cardiaca del donatore. Questa divisione del lavoro permette di completare ogni 10 minuti un modello completo di trapianto. Mentre un singolo operator...

Discussione

La xenotrapianto murina è una procedura altamente invasiva che richiede un alto livello di competenza tecnica e coerenza da parte dell'operatore. Durante l'elaborazione del modello, l'operatore ha un impatto significativo sugli esiti^{sperimentali 14,15}. In un flusso di lavoro a una sola persona, la complessità e la durata della procedura portano a un tempo operativo approssimativo di 30 minuti per modello, portando a una bassa eff...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anti-CD3 antibody	Abcam	ab16669
Anti-CD68 antibody	Bioss	bs-1432R
DAPI	Thermofisher	P36971
Depilatory cream	Veet	-
Electrocautery pen	Yuyan Instrument	-
Fluorescent secondary antibodies	Thermofisher	A-11008
HE staining kit	Beyotime	C0105S
Ice maker	Shjingmi	IMS-20
Insulin syringes	KDL	U-40
Lidocaine gel	Tide Pharm
Meloxicam	Sigma-Aldrich	444800
Microsurgical forceps	ZHENHAO	FS217
Microsurgical needle holders	BIOFIVEN	HH01231
Microsurgical scissors	ZHENHAO	FS237
Normal saline	Kelun Pharmaceutical	-
Polyimide tubing	Guangzhou Wanlixin Metal Products Co., Ltd.	-	Diametro interno: 0,3-0,5 mm
Polyimide tubing	Guangzhou Wanlixin Metal Products Co., Ltd.	-	Diametro interno: 0,4-0,7 mm
Povidone-iodine solution	INOHV	-
Sodium heparin	Qianhong bio-pharma	-
Stereomicroscope	Murzider	MSD204
Surgical sutures	Jinhuan Medical	8-0 and 4-0 silk sutures
Surgical warming pad	Hani Pet	-
Tribromoethanol	Jitianbio	JT0781
University of Wisconsin solution	Belzer	-
Vascular clamps	RWD Life	R31005-10