Reazione a catena della polimerasi digitale a microgocce per il rilevamento di precisione di mutazioni del carcinoma polmonare non a piccole cellule

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per rilevare in modo sensibile e specifico le mutazioni di EGFR T790M utilizzando la reazione a catena della polimerasi digitale delle goccioline (ddPCR), che può anche essere esteso per identificare rapidamente altre mutazioni tumorali come G719S, L858R, L861Q e S768I.

Abstract

Su scala globale, il cancro del polmone continua a essere il principale responsabile dei decessi correlati al cancro, con la sua prevalenza seconda solo a quella del cancro del rene. Il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) costituisce circa l'80-85% di tutti i casi di cancro al polmone segnalati. La mutazione T790M nel gene EGFR è un determinante primario ampiamente riconosciuto della resistenza acquisita agli inibitori della tirosin-chinasi del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR-TKI). La presenza di questa condizione è stata osservata in circa il 50-60% di coloro che hanno sperimentato una malattia progressiva. Pertanto, l'implementazione di un approccio rapido e altamente reattivo per rilevare le mutazioni T790M nel gene EGFR è essenziale per l'identificazione rapida del carcinoma polmonare non a piccole cellule. Nel presente studio, la ddPCR è stata utilizzata per rilevare la mutazione T790M con un limite di rilevamento di 10 copie/μL, che è 10 volte superiore alla sensibilità della qPCR (1 × 10² copie/μL). Per i 15 campioni simulati, la ddPCR è stata in grado di rilevare la presenza di mutazioni T790M nel gene EGFR, che sono state osservate a livelli ridotti quando analizzate utilizzando la qPCR. La rilevazione delle mutazioni T790M all'interno del gene EGFR mediante un metodo di rilevamento rapido è in fase di studio per determinarne l'idoneità.

Introduzione

Il cancro ai polmoni è la principale causa di mortalità correlata al cancro a livello globale e rappresenta la seconda neoplasia più diffusa in assoluto. Il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) rappresenta una maggioranza significativa, circa l'80-85%, di tutti i casi di cancro al polmone riportati 1,2,3,4. Per i pazienti con diagnosi di NSCLC avanzato che presentano mutazioni dell'EGFR, l'approccio terapeutico consolidato prevede l'applicazione di inibitori della tirosin-chinasi (TKI) del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) di prima, seconda o terza ^{generazione5,6,7}. Tuttavia, la maggior parte dei pazienti trattati con EGFR-TKI di prima o seconda generazione alla fine sviluppa una resistenza acquisita al farmaco. Questa resistenza è spesso attribuita alla presenza della mutazione T790M nel gene EGFR, che si trova in circa il 50-60% dei pazienti che manifestano progressione della malattia 8,9,10,11,12.

Tradizionalmente, le anomalie genetiche nel DNA tumorale da campioni di tessuto vengono identificate utilizzando tecniche come l'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) o il sequenziamento di nuova generazione (NGS)^13,14. Tuttavia, le biopsie tissutali possono essere difficili a causa dell'inaccessibilità del tumore, della cattiva salute del paziente o del contenuto insufficiente di cellule tumorali 15,16,17. In alternativa, le biopsie liquide, in particolare dal plasma, offrono un modo meno invasivo per identificare le mutazioni driver rilevando il DNA tumorale circolante (ctDNA). Le cellule tumorali rilasciano DNA nel flusso sanguigno, nel liquido pleurico, nella saliva o nelle feci, fornendo una preziosa fonte per l'analisi genetica^18,19. Il profilo genetico del ctDNA spesso rispecchia il corredo genetico del tumore, offrendo una visione completa dell'eterogeneità del tumore, un fattore cruciale per una diagnosi accurata e un trattamento personalizzato del cancro^20,21.

Tra le varie tecniche per identificare le mutazioni dell'EGFR nel sangue periferico, tra cui il sequenziamento, la reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR), la PCR digitale, la cromatografia liquida ad alte prestazioni denaturante (DHPLC), il sistema di mutazione refrattaria all'amplificazione (ARMS) e la PCR arricchita con mutanti (ME-PCR), la PCR digitale a microgocce (ddPCR) è emersa come uno strumento altamente efficace per il rilevamento delle mutazioni del ctDNA^22,23. La sua sensibilità superiore, la precisione e la capacità di rilevare mutazioni a bassa abbondanza con elevata precisione lo distinguono. A differenza della PCR tradizionale, la ddPCR suddivide i campioni in migliaia di goccioline, consentendo la quantificazione assoluta delle sequenze di DNA bersaglio senza curve standard. Ciò lo rende eccezionalmente adatto per rilevare mutazioni rare come la mutazione T790M nell'EGFR. Nonostante i vantaggi della ddPCR, la sua diffusa applicazione clinica è stata limitata dalle sfide nella preparazione dei campioni, nell'ottimizzazione del sistema e nell'analisi comparativa delle prestazioni con tecniche consolidate come la qPCR. Esiste una lacuna critica nell'ottimizzazione dei protocolli ddPCR per il rilevamento delle mutazioni del ctDNA, in particolare per quanto riguarda la sensibilità, la specificità e la riproducibilità essenziali per l'adozione clinica.

In questo studio, ipotizziamo che la ddPCR offra una sensibilità e un'affidabilità superiori per rilevare la mutazione EGFR T790M nel ctDNA rispetto ai metodi tradizionali di qPCR. Ci siamo concentrati sull'ottimizzazione del processo di estrazione dell'acido nucleico per migliorare l'efficienza, seguita dall'ottimizzazione della ddPCR per il rilevamento delle mutazioni. Inoltre, abbiamo confrontato le prestazioni di ddPCR e qPCR in termini di sensibilità, specificità e riproducibilità utilizzando campioni simulati. Valutando sistematicamente il potenziale della ddPCR, miriamo a stabilirla come un'alternativa valida e superiore alla qPCR per il rilevamento della mutazione dell'EGFR nelle biopsie liquide.

Protocollo

Questo studio non ha coinvolto partecipanti umani, tessuti umani o esperimenti su animali vivi; Pertanto, non era richiesta alcuna approvazione etica formale. Tutte le procedure sono state condotte in conformità con le linee guida istituzionali e nazionali. Il plasmide mutante T790M è stato sintetizzato commercialmente. Il sangue di maiale utilizzato per simulare i campioni clinici è stato ottenuto da un fornitore certificato nel rispetto delle normative sul benessere degli animali, senza alcun coinvolgimento di animali vivi. Tutti gli altri reagenti, comprese le microsfere magnetiche, i primer, le sonde e gli enzimi PCR, sono stati acquistati commercialmente e utilizzati secondo le istruzioni dei produttori.

Estrazione con acidi nucleici
L'estrazione dell'acido nucleico è stata eseguita utilizzando un kit di estrazione a microsfere magnetiche e uno strumento di estrazione dell'acido nucleico completamente automatico. La procedura standard prevedeva l'aggiunta di 200 μl di campione e 20 μl di proteinasi K alla colonna 1 o 7 della piastra a pozzetti profondi preimpaccata. Quindi, 15 μL di microsfere magnetiche fornite con il kit sono state aggiunte alla colonna 2 o 8. Il programma di estrazione è stato avviato sullo strumento, con la guaina magnetica posizionata nella posizione designata. Dopo l'estrazione, il liquido della colonna 6 o 12 è stato trasferito in una nuova provetta da 1,5 mL priva di nucleasi e conservato a -20 °C.

Per ottimizzare l'estrazione di acidi nucleici target a bassa concentrazione, sono stati condotti esperimenti di ottimizzazione. I parametri di estrazione consigliati erano: temperatura di lisi 70 °C, tempo di lisi 10 min, 1 min per ciascuna delle tre soluzioni di lavaggio, 2 min di asciugatura e 3 min di eluizione a 56 °C. I parametri più influenti sono stati sistematicamente ottimizzati: temperatura di lisi (62 °C, 66 °C, 70 °C, 74 °C e 78 °C), tempo di lisi (1, 3, 5, 7 e 9 min) e dimensione delle perle magnetiche (100 nm, 200 nm, 300 nm, 400 nm, 500 nm e 1000 nm). Queste ottimizzazioni sono state eseguite utilizzando il plasmide mutante T790M a 1 × 10⁵ copie/μL. Le perle magnetiche da 100 nm sono state fornite con il kit di estrazione, mentre altre dimensioni delle particelle sono state ottenute da un'azienda biotecnologica. L'efficienza di ciascuna condizione di estrazione è stata valutata analizzando le curve di amplificazione qPCR e i valori Ct dei campioni estratti. L'analisi statistica di questi risultati è stata eseguita utilizzando un software statistico.

DNA plasmidico standard
Il plasmide mutante T790M del gene EGFR è stato sintetizzato su misura da un'azienda biotecnologica. Quattro microgrammi della polvere di plasmide secca sono stati risospesi in 100 μL di tampone 1x TE. La concentrazione del plasmide è stata determinata utilizzando uno spettrofotometro. Il numero di copie per microlitro è stato calcolato utilizzando la formula: Numero di copie/μL = [(6,02 × 10²³) × (concentrazione di DNA (ng/μL) × ^10-9)] / (lunghezza del DNA in coppie di basi × 660). La concentrazione del frammento sintetizzato era di 1,26 × 10⁹ copie/μL. Questo plasmide stock è stato quindi diluito 126 volte per ottenere una concentrazione di lavoro di 1 × 10⁸ copie/μl.

Progettazione e sintesi di primer
I primer e una sonda TaqMan per la mutazione EGFR T790M sono stati progettati utilizzando il Primer 6 sulla base dei principi di progettazione standard dei primer. Innesco a monte: 5′-CCTCACCTCCACCGTGC-3′; Primer a valle²⁴: 5′-AGGCAGCCGAAGGGCA-3′; Sonda: 5′-FAM-AGCTCATCACGCAGCTCA-BHQ1-3′. Tutti i primer e le sonde sono stati sintetizzati da un servizio commerciale di sintesi di oligonucleotidi.

Messa a punto e ottimizzazione del sistema di rivelazione quantitativa a fluorescenza ddPCR e TaqMan
Uno stock plasmidico T790M di 1 × 10⁸ copie/μl è stato diluito a 1 × 10⁶ copie/μl utilizzando il tampone 1× TE per l'uso in esperimenti di ottimizzazione del sistema ddPCR e qPCR.

Ottimizzazione del sistema ddPCR: il sistema ddPCR è stato ottimizzato in base alle raccomandazioni del produttore dell'enzima. Il sistema iniziale raccomandato includeva: 7,5 μL di miscela PCR 4x, 1,2-3 μL di primer a monte (10 μM), 1,2-3 μL di primer a valle (10 μM), 0,3-1,8 μL di sonda (10 μM), 1-15 μL di DNA stampo e acqua priva di nucleasi fino a un volume finale di 30 μL. Il ciclo di amplificazione consigliato prevedeva un iniziale 10 minuti a 95 °C, seguito da 40 cicli di 30 s a 94 °C e 60 s a 55-65 °C. La temperatura di ricottura (55-61,8 °C), la concentrazione del primer (1-3 μL), la concentrazione della sonda (0,75-1,75 μL) e la concentrazione del modello (3-15 μL) sono state ottimizzate in modo sistematico. I risultati dell'ottimizzazione sono stati analizzati statisticamente utilizzando un software statistico.

Ottimizzazione del sistema qPCR: il sistema qPCR è stato ottimizzato secondo le raccomandazioni del produttore dell'enzima. Il sistema inizialmente suggerito includeva: 5 μL di Taq polimerasi, 0,45 μL di 250 mM MgCl2, 0,5-2,5 μL di primer diretto (10 μM), 0,5-2,5 μL di primer inverso (10 μM), 0,5-2,5 μL di sonda (10 μM), 5 μL di campione di DNA e acqua priva di nucleasi fino a un volume finale di 25 μL. Il programma di amplificazione consigliato era di 5 minuti a 95°C; seguiti da 45 cicli di 15 s a 95 °C e 30 s a 56-64 °C, con raccolta di fluorescenza a 56-64 °C. La temperatura di ricottura (56-64 °C), la concentrazione del primer (1-3 μL), la concentrazione della sonda (0,5-2,5 μL) e la concentrazione del modello (1-5 μL) sono state ottimizzate. L'analisi statistica di questi risultati è stata eseguita utilizzando un software statistico.

Test di sensibilità quantitativa alla ddPCR e alla fluorescenza Taqman
Per valutare la sensibilità della ddPCR rispetto alla qPCR, il plasmide T790M da 1 × 10^{a 8} copie/μL è stato diluito in serie di 10 volte utilizzando 1x tampone TE per creare un gradiente di concentrazione compreso tra 10⁶ e 10¹ copie/μL. Per la ddPCR, sono state preparate sette soluzioni di reazione secondo il sistema ddPCR ottimizzato, una per ogni concentrazione, incluso un controllo negativo. I campioni sono stati caricati su un chip generatore di microgoccioline ed elaborati con uno strumento di generazione di goccioline per generare microgoccioline. Queste goccioline sono state poi amplificate utilizzando un termociclatore PCR e successivamente analizzate da uno strumento di rilevamento PCR digitale. Contemporaneamente, sono state preparate sette soluzioni di reazione basate sul sistema qPCR ottimizzato, con modelli identici. Questi sono stati eseguiti su uno strumento di PCR in tempo reale per valutare le rispettive sensibilità dei due approcci (n = 3).

test di ripetibilità ddPCR
Per valutare la ripetibilità, il DNA plasmidico T790M standard a 1 × 10⁸ copie/μL è stato diluito per generare standard di concentrazione elevati (1 × 10⁶ copie/μL), medi (1 × 10⁴ copie/μL) e bassi (1 × 10² copie/μL). Sono state preparate sei soluzioni di reazione secondo il sistema ddPCR ottimizzato. I campioni sono stati caricati su un chip generatore di microgoccioline ed elaborati con uno strumento di generazione di goccioline per formare microgoccioline. Le microgoccioline sono state quindi amplificate utilizzando un termociclatore e analizzate da uno strumento di rilevamento PCR digitale. È stato incluso un controllo negativo. L'esperimento è stato eseguito in triplicato. La riproducibilità è stata valutata confrontando i profili di amplificazione e calcolando i valori del coefficiente di variazione (CV) delle tre repliche sperimentali.

Test di campioni analogici
Al fine di testare l'affidabilità dei sistemi ddPCR e qPCR con mutazione T790M, abbiamo utilizzato sangue di maiale miscelato in modo casuale con concentrazioni alte e basse di plasmidi standard di mutazione T790M rispettivamente, e il sangue di maiale senza plasmidi standard misti è stato utilizzato come campioni negativi e 15 campioni simulati sono stati preparati in modo casuale e l'acido nucleico è stato estratto dai campioni simulati, e rilevati utilizzando rispettivamente i metodi ddPCR e qPCR.

Analisi statistica
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in almeno tre repliche tecniche. I dati sono presentati come media ± deviazione standard (SD). Le analisi statistiche sono state condotte utilizzando il software GraphPad Prism 10. Le differenze tra i gruppi sono state analizzate utilizzando il t-test di Student o l'analisi della varianza a una via (ANOVA), a seconda dei casi. Un valore p inferiore a 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Risultati

Ottimizzazione dell'estrazione degli acidi nucleici
Il flusso di lavoro basato sulla ddPCR per rilevare la mutazione T790M dell'EGFR è riassunto schematicamente nella Figura 1. Innanzitutto, abbiamo determinato la temperatura di lisi ottimale. Come mostrato nella Figura 2A, una temperatura di scissione di 66 °C ha prodotto il valore medio di Ct più piccolo, indicando la scissione più efficiente. Pertanto, 66 °C sono stati selezionati per gli ...

Discussione

Il cancro del polmone, come principale causa di decessi correlati al cancro in tutto il mondo, è sempre stato un punto focale nella ricerca medica. In questo studio, esploriamo molteplici aspetti critici del cancro del polmone, con l'obiettivo di fornire informazioni più approfondite sulla sua diagnosi, trattamento e prognosi. La pietra angolare per una diagnosi e un trattamento precisi per il cancro ai polmoni è un test genetico accurato. Come dimostrato da Zhao et ^al....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1&volte; Tampone TE	Sangon Biotech	B548144	tampone Tris-EDTA utilizzato per la diluizione del DNA
4& Miscela enzimatica Unimix-U	TargetingOne Bio	UNIMIXU-4X	Miscela enzimatica ddPCR
A300 Fast Thermal Cycler	Amplificazione PCR LongGene	A300	Analizzatore
di biochip	SEED Bio	DigitalPCR-Biochip	Sistema di rilevamento per PCR digitale
Drop Marker Strumento per la preparazione dei campioni	Xinyi Biotechnology	Piattaforma PCR digitale TD-2	Preparazione di microgoccioline
Kit di estrazione dell'acido nucleico a perle magnetiche	Tecnologia LemnisCare	MXP-1005	Estrazione dell'acido nucleico
Chip generatore di microgocce	TargetingOne Biotech	MG-Chip-01	Utilizzato per generare microgoccioline per ddPCR
NanoDrop	Allsheng	NC-500	Misurazione della concentrazione di acido nucleico dopo l'estrazione del campione
Spettrofotometro NanoDrop ND-500	Allsheng Strumenti	Spettrofotometro ND-500	per la quantificazione del DNA
Strumento PCR A300 Fast Thermal Cycler	LongGene	A300	Termociclatore per amplificazione PCR
Primer e sonda TaqMan	Sangon Biotech	Primer sintetizzati su misura	e sonda TaqMan per rilevamento T790M
Strumento qPCR Gentier mini	Tianlong Technology	Gentier mini	Real-time PCR strumento
T790M mutazione plasmide	Tsingke biologia	T790M	Curva standard e test limite di rilevamento