Articolo metodologico

Un semplice protocollo per l'isolamento e la coltura di epatociti da topi MASLD

DOI:

10.3791/68782

⸱

18 luglio 2025

 ,  ,  , 
1Department of Endocrinology, The First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China, 2Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio stabilisce un protocollo standardizzato per l'isolamento degli epatociti primari da topi con malattia steatosica epatica associata a disfunzione metabolica (MASLD), consentendo indagini rilevanti per la malattia della steatosi e della disfunzione metabolica senza carico lipidico artificiale. Il metodo produce epatociti ad alto rendimento e ad alta vitalità adatti per studi meccanicistici e terapeutici.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La malattia steatosica epatica associata a disfunzione metabolica (MASLD), caratterizzata da accumulo patologico di lipidi (steatosi) all'interno degli epatociti, rappresenta un onere sanitario globale significativo e crescente. Le colture primarie di epatociti di topo fungono da modelli ex vivo indispensabili per chiarire la patogenesi e gli interventi terapeutici della MASLD. Tuttavia, l'isolamento affidabile di epatociti di alta qualità da fegati steatotici rimane tecnicamente impegnativo. Qui, presentiamo un semplice protocollo per l'isolamento efficiente di epatociti primari da topi MASLD utilizzando la tecnica di perfusione della collagenasi. Questo protocollo genera epatociti che presentano steatosi intrinseca senza richiedere l'induzione artificiale tramite palmitato e integrazione di acido oleico, preservando così un fenotipo fisiologicamente più rilevante. Il protocollo produce epatociti altamente vitali e di elevata purezza ed è universalmente applicabile per isolare elevate quantità di epatociti da topi MASLD. Inoltre, è adatto per la valutazione farmacologica o gli studi di intervento genetico. In sintesi, forniamo un protocollo riproducibile per isolare epatociti ad alto rendimento, ad alta purezza e altamente vitali per studi di biologia cellulare a valle per facilitare la scoperta di nuovi bersagli terapeutici e farmaci per la MASLD.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La malattia steatosica epatica associata a disfunzione metabolica (MASLD) è caratterizzata da un accumulo patologico di lipidi negli epatociti e rappresenta la malattia epatica cronica più diffusa a livello globale1. Si stima che la MASLD colpisca il 38% della popolazione adulta mondiale ed è diventata una minaccia significativa per la salute umana2. I meccanismi della MASLD non sono stati completamente chiariti e le opzioni di trattamento sono molto limitate. La scoperta di nuovi bersagli terapeutici e lo sviluppo di agenti mirati per la MASLD è diventata un'esigenza clinica fondamentale. Gli epatociti, in quanto tipo di cellula predominante che compone il fegato, sono il sito primario del metabolismo epatico del glucosio-lipidi-farmaci. Gli epatociti primari conservano una funzione più completa degli epatociti rispetto alle linee cellulari di epatociti e sono uno strumento utile per studiare i meccanismi delle malattie epatiche e lo sviluppo di farmaci3. L'isolamento e la coltura di epatociti primari da topi con fegato grasso è una tecnica fondamentale per studiare la fisiopatologia epatica, compreso il metabolismo dei lipidi, l'insulino-resistenza e le risposte infiammatorie. Un precedente protocollo stabilito per l'isolamento degli epatociti da modelli murini di steatosi epatica impiegava la centrifugazione a gradiente per consentire specificamente la separazione delle popolazioni di epatociti normali e che accumulano lipidi. Questi epatociti isolati carichi di lipidi costituiscono quindi un sistema modello in vitro critico per lo studio della patobiologia della steatosi epatica3. L'obiettivo principale di questo approccio è quello di ottenere facilmente ed economicamente epatociti altamente vitali e ad alto rendimento che mantengano le caratteristiche fenotipiche specifiche della malattia e quindi siano in grado di imitare la MASLD in vitro.

La procedura generale per l'isolamento degli epatociti nei topi consiste in un processo in due fasi che inizia con il lavaggio del sangue dal fegato con una soluzione di perfusione isotonica, come la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS), e quindi la digestione del fegato utilizzando una soluzione digestiva contenente collagenasi. I recenti progressi nelle tecniche di perfusione epatica e di digestione enzimatica hanno migliorato la resa e la vitalità degli epatociti primari nei topi femmina4. I miglioramenti ai tradizionali metodi di perfusione della collagenasi in due fasi, come l'ottimizzazione della composizione del tampone e la riduzione dei tempi di digestione, sono stati fondamentali per adattare i protocolli sperimentali ai campioni di fegato grasso. Gli epatociti primari fungono da modelli indispensabili per chiarire i meccanismi fisiopatologici alla base della MASLD e delle sue complicanze cardiometaboliche, in particolare attraverso il loro ruolo nel mediare il crosstalk cuore-fegato e le interazioni dell'asse fegato-vascolare attraverso mediatori endoteliali e fattori angiogenici 5,6. Queste cellule forniscono informazioni critiche sulle reti di comunicazione multiorgano che guidano la progressione della malattia, come evidenziato dalle associazioni cliniche tra MASLD, malattia renale cronica e cardiopatia ischemica7, offrendo al contempo una piattaforma fisiologicamente rilevante per lo sviluppo di terapie mirate che affrontano le manifestazioni epatiche e cardiovascolari della sindrome metabolica. L'attuale ricerca in vitro sulla MASLD si basa prevalentemente su epatociti normali stimolati con acido palmitico/oleico (PA/OA) o su linee cellulari di epatociti umani (ad esempio, HepG2 e Huh7), che replicano in modo inadeguato le caratteristiche fisiopatologiche degli epatociti steatotici in condizioni di malattia, limitando la loro rilevanza traslazionale per lo studio delle interazioni cuore-fegato-vascolare. Questo approccio non riesce a catturare la disfunzione metabolica cronica, il microambiente infiammatorio e il crosstalk interorgano specifico della malattia caratteristici della progressione della MASLD.

Questo protocollo può essere utilizzato per isolare gli epatociti dai topi MASLD, senza la necessità di aggiungere artificialmente trattamenti con acido palmitico e oleico. In conclusione, presentiamo un metodo semplice e riproducibile per ottenere epatociti ad alto rendimento con un'eccellente vitalità, adatto per la ricerca di biologia cellulare a valle per supportare la scoperta di nuovi bersagli terapeutici e lo sviluppo di farmaci per MASLD.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutte le fasi sperimentali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso l'Università di Scienza e Tecnologia della Cina. I topi maschi C57BL/6J sono stati alimentati con una dieta ricca di grassi (HFD, #12492, Research Diet) per più di 12 settimane in questo studio.

1. Preparazione di una piastra o di un piatto di coltura rivestito di collagene

  1. Aggiungere 15 mL di 100% EtOH a 35 mL di H2O (ddH2O) a doppia distillazione. Preparare una soluzione di collagene di tipo I 50 μg/mL in EtOH al 30%. Filtro con punta sterile da 0,22 μm.
  2. Rivestire una piastra o un piatto per coltura cellulare con 30 μL di soluzione di collagene per cm2. Incubare a temperatura ambiente (RT) per 1 ora.
  3. Rimuovere il liquido in eccesso con una pipetta e asciugare la piastra o il piatto di coltura. Irradiare le stoviglie rivestite con luce ultravioletta per 0,5 ore per la sterilizzazione. Conservare a 4 °C per meno di 1 mese.
    NOTA: La lunghezza d'onda della lampada UV è di 254 nm e l'intensità UV non è inferiore a 400 mw/m2. La distanza della sorgente della lampada UV dalle stoviglie rivestite di collagene è di 1 m.

2. Preparazione della soluzione di perfusione

  1. Alcuni giorni prima di isolare gli epatociti, preparare i reagenti per l'isolamento degli epatociti e i terreni di coltura specificati nella Tabella 1. Filtrare la soluzione di perfusione A e B con un puntale sterile da 0,22 μm. Conservare a 4 °C per meno di 1 mese. Preparare un bagnomaria e impostare la temperatura a 37 °C.
  2. Preriscaldare le soluzioni di perfusione A e B a bagnomaria a 37 °C. Aggiungere 40 mg di collagenasi di tipo IV a 80 ml di soluzione di perfusione B prima dell'intervento chirurgico.
  3. Pompare il 75% di EtOH a una velocità di 4 mL/min per 5 minuti utilizzando una pompa peristaltica a RT. Commutare il tubo della pompa dal 75% di EtOH alla soluzione di perfusione preriscaldata A.
    NOTA: Montare l'unità di riempimento a circolazione riscaldata secondo la configurazione illustrata nella Figura 1A.

3. Procedura chirurgica

  1. Anestetizzare il topo utilizzando un metodo approvato. Iniettare pentobarbital sodico (50 mg/kg) per via intraperitoneale. Verificare la perdita del riflesso di virata prima di procedere.
  2. Fissare gli arti superiori e inferiori del topo su una tavola di dissezione. Sterilizzare l'area chirurgica con alcol al 75%.
  3. Tagliare le membrane addominali interne ed esterne utilizzando strumenti di dissezione. Ruotare gli organi viscerali sul lato sinistro del topo con un batuffolo di cotone per esporre la vena cava inferiore (IVC) e la vena porta epatica (PV).
  4. Premi la vena cava inferiore con un batuffolo di cotone per gonfiarla. Inserire un ago a permanenza 22-G parallelo alla vena cava inferiore.
  5. Estrarre la parte di ferro dell'ago a permanenza. Lasciare il catetere nella vena cava inferiore. Collegare l'ago a una linea di perfusione con un puntale del filtro da 0,22 μm.
    NOTA: Un ago a permanenza è costituito da una parte dell'ago in ferro e da una parte del catetere in plastica. Assicurarsi che l'inserimento sia accurato nella vena cava inferiore e attendere che l'ago a permanenza si riempia di sangue. Elimina tutte le bolle d'aria dall'ago a permanenza. Completa rapidamente l'intera procedura per evitare la trombosi.
  6. Impostare la velocità di perfusione a 5 ml/min di liquido di perfusione A. Iniziare la perfusione e osservare il fegato fino a quando non appare gonfio. Tagliare immediatamente la vena porta.
  7. Massaggiare delicatamente il fegato con un batuffolo di cotone per garantire un accurato lavaggio del sangue. Continua la perfusione fino a quando il fegato diventa giallo terroso.
  8. Passa al fluido di perfusione B contenente lo 0,05% di collagenasi di tipo IV. Continua la perfusione fino a quando il fegato non è completamente digerito.
    NOTA: Ci vogliono almeno 10 minuti per topo per digerire il fegato. Un volume di 80 ml di soluzione di perfusione B contenente collagenasi è sufficiente per consentire a un topo di digerire il fegato. Il tessuto epatico subisce una completa digestione enzimatica fino a raggiungere il massimo rammollimento, con il parenchima racchiuso in capsula che raggiunge uno stato di estrema fragilità suscettibile di disgregazione meccanica.
  9. Rimuovere il fegato dall'addome del topo. Mettere il fegato in un piatto da 10 cm contenente DMEM.
  10. Procedere in una cappa di biosicurezza. Riduci il fegato in polvere usando una pinzetta (un fegato ben digerito rilascia facilmente gli epatociti).
  11. Filtrare la sospensione attraverso un filtro a maglie da 70 μm in una provetta da centrifuga sterile da 50 mL. Regolare il volume a 45 ml (per mouse) con DMEM medium.
  12. Centrifugare a 50 × g per 4 min. Versare completamente il surnatante.
  13. Risospendere il pellet con terreno DMEM fino a un volume finale di 25 mL (per topo). Centrifugare nuovamente a 50 × g per 2 min.
  14. Versare completamente il surnatante. Risospendere il pellet in 25 mL di terreno di coltura integrato con il 10% di FBS.
  15. Mescolare accuratamente la sospensione. Colorare le celle con il blu di tripano per il conteggio. Procedere immediatamente all'inoculazione per la coltura.
    NOTA: Introdurre 2 mL di terreno contenente 2 × 105 cellule per pozzetto in piastre a 6 pozzetti rivestite di collagene. Sostituire il terreno DMEM dopo 2 ore dall'inoculazione cellulare.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'attuale protocollo è stato implementato su topi maschi C57BL/6J alimentati con HFD per più di 12 settimane. Gli epatociti primari isolati sono stati esaminati per morfologia e funzione. Abbiamo ottenuto una resa media di 2 × 107 cellule per isolamento da circa 40 g di fegato di topo. La vitalità cellulare è stata determinata tra l'85% e l'86% mediante colorazione con calceina AM di cellule vive. La resa di ciascun isolamento di topi obesi indotti dalla dieta (DIO) è stata suf...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'isolamento di epatociti di topo vitali comporta una procedura critica in due fasi che inizia con un'accurata perfusione vascolare utilizzando una soluzione isotonica per rimuovere i componenti del sangue, seguita da una digestione enzimatica controllata con soluzione attiva di collagenasi 9,10. Il successo dell'isolamento dipende dal mantenimento di condizioni fisiologiche ottimali durante tutto il processo, in particolare la t...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno segnalato alcun potenziale conflitto di interessi.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China [n. 82373967].

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette da centrifuga sterili da 50 mLAnticorpo Nest602052
anti-HNF4&alfa; AnticorpoImmunowayYM8517
anti-IgGProteintech30000-0-AP
BODIPYThermo Fisher ScientificD3922
CaCl2Merck (SigmaAldrich)C5670
CentrifugaThermo Sorvall ST16R
Collagene Tipo I Corning354236
Collagenasi, Tipo 4Sangon BiotechA004186-0001
Ago di contenimentoBRAUN4254074B
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)GibcoC11995500BT
EGTAYeasen60339ES10
EtanoloMerck (SigmaAldrich)493511
Fetale Siero Bovino SigmaF2442
GlucosioMerck (SigmaAldrich)G7021
HEPESGibco15630080
Isoginkgetin MedChemExpressHY-N2117
K2HPO4 Merck (Supelco)PHR2900
KClMerck (SigmaAldrich)P3911
Na2HPO4 · 12H2OMerck (SigmaAldrich)04273
NaClMerck (SigmaAldrich)S9888
NaHCO3Merck (SigmaAldrich)S6014
Filtro ad ago 0,22µ MMillex-GPSLGV033RB
Nile RedInvitrogenN1142
Penicillina/streptomicina (100X)Gibco15140122
Adenovirus ricombinanteObio Technology Corp., ltd. Gli adenovirus ricombinanti che codificano per il topo flag-taged IER2 (Ad-Ier2, NM_010499.4) e l'adenovirus di controllo (Ad-NC) sono stati costruiti da Obio Technology Corp., ltd.
Pentobarbital di sodioMerck (SigmaAldrich)P3761
Filtri cellulari sterili, 100 μ mFisher Scientific22363549
Trypan BlueBeyotimeST2780-5g
Pompa peristaltica a portata variabileLongerBT100-1F

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Israelsen, M., Francque, S., Tsochatzis, E. A., Krag, A. Steatotic liver disease. Lancet. 404 (10464), 1761-1778 (2024).
  2. Targher, G., Byrne, C. D., Tilg, H. Masld: A systemic metabolic disorder with cardiovascular and malignant complications. Gut. 73 (4), 691-702 (2024).
  3. Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protoc. 1 (3), 100222(2020).
  4. Feng, M., Divall, S., Wu, S. An improved time- and labor-efficient protocol for mouse primary hepatocyte isolation. J Vis Exp. (176), e61812(2021).
  5. Driessen, S., et al. Metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease and the heart. Hepatology. , (2023).
  6. Chew, N. W. S., et al. Cardiovascular-liver-metabolic health: Recommendations in screening, diagnosis, and management of metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease in cardiovascular disease via modified delphi approach. Circulation. 151 (1), 98-119 (2025).
  7. Miyamori, D., et al. Coexistence of metabolic dysfunction-associated fatty liver disease and chronic kidney disease is a more potent risk factor for ischemic heart disease. J Am Heart Assoc. 12 (14), e030269(2023).
  8. Zhang, Z., et al. A natural small molecule isoginkgetin alleviates hypercholesterolemia and atherosclerosis by targeting ACLY. Theranostics. 15 (10), 4325-4344 (2025).
  9. Edwards, M., Houseman, L., Phillips, I. R., Shephard, E. A. Isolation of mouse hepatocytes. Methods Mol Biol. 987, 283-293 (2013).
  10. Guo, Q., Furuta, K., Aly, A., Ibrahim, S. H. Isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells. J Vis Exp. (178), e63062(2021).
  11. Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: Cell characterization and asialoglycoprotein receptor-based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
  12. Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method. J Vis Exp. (140), e58323(2018).
  13. Xu, S., et al. TRIM56 protects against nonalcoholic fatty liver disease by promoting the degradation of fatty acid synthase. J Clin Invest. 134 (5), e166149(2024).
  14. Xu, S., et al. The clinical antiprotozoal drug halofuginone promotes weight loss by elevating GDF15 and FGF21. Sci Adv. 11 (13), eadt3142(2025).
  15. Tiriticco, V., et al. Rat liver perfusion and primary hepatocytes isolation: An old procedure crucial for cutting-edge 3D organoids culture. J Vis Exp. (213), e66857(2024).
  16. Wei, S., et al. Nafld and nash: Etiology, targets and emerging therapies. Drug Discov Today. 29 (3), 103910(2024).
  17. Fang, T., et al. Mouse models of nonalcoholic fatty liver disease (nafld): Pathomechanisms and pharmacotherapies. Int J Biol Sci. 18 (15), 5681-5697 (2022).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Isolamento degli epatocitiPerfusione con collagenasiEpatociti primariFegato steatosicoColtura di epatocitiAccumulo lipidicoModelli ex vivoIntervento geneticoValutazione farmacologica
Video in arrivo

Articoli correlati