Protocollo aggiornato per l'assemblaggio e l'uso dell'array di minibioreattori (MBRA)

Summary

Il Minibioreactor Array (MBRA) è un sistema di coltura ad alto rendimento, personalizzabile e a flusso continuo che consente la coltivazione di comunità microbiche complesse, supportando esperimenti paralleli per studiare le dinamiche del microbioma, le interazioni terapeutiche e le risposte microbiche ai fattori ambientali.

Abstract

Il microbioma umano comprende comunità microbiche diverse e dinamiche che svolgono un ruolo essenziale nella salute dell'ospite. Comprendere queste comunità e le loro risposte ai fattori ambientali è fondamentale per far progredire le terapie basate sul microbioma. I modelli tradizionali in vitro per la coltivazione del microbiota di origine umana spesso mancano di scalabilità e richiedono un'ampia competenza tecnica, limitandone l'accessibilità e la produttività. Per affrontare queste limitazioni, abbiamo sviluppato il sistema Minibioreactor Array (MBRA), una piattaforma modulare, monostadio e a flusso continuo per la coltivazione ad alto rendimento di comunità microbiche. Questo sistema consente la coltivazione parallela di un massimo di 48 comunità microbiche distinte, supportando la flessibilità sperimentale e mantenendo la crescita stabile di ecosistemi complessi. Questo protocollo fornisce una guida dettagliata sulla fabbricazione, l'assemblaggio, la sterilizzazione e il funzionamento dell'MBRA. Il design modulare del sistema consente una facile integrazione nelle camere anaerobiche e supporta la personalizzazione per un'ampia gamma di applicazioni sperimentali. È stato utilizzato per studiare le risposte microbiche agli antibiotici, ai composti alimentari e all'invasione di agenti patogeni e per lo screening delle comunità resistenti ai patogeni. Grazie alla sua accessibilità, scalabilità e riproducibilità, l'MBRA rappresenta un potente sistema di modelli per lo studio delle interazioni microbiche e l'avanzamento della ricerca sul microbioma.

Introduction

Il microbioma umano è un complesso ecosistema di microrganismi che svolge un ruolo fondamentale in numerosi processi fisiologici e ha un profondo impatto sulla salute umana. Il microbioma umano si estende su molti siti anatomici in tutto il nostro corpo, ognuno dei quali contiene comunità microbiche dinamiche che interagiscono attivamente in modi che dobbiamo ancora comprendere appieno¹. L'espansione delle nostre conoscenze sul coinvolgimento delle comunità microbiche nella salute e nella malattia dipende dalla nostra comprensione delle interazioni microbiche che avvengono all'interno di questi ambienti¹. Per studiare e manipolare efficacemente questi intricati sistemi a fini terapeutici, è necessario un approccio riduzionista. L'esplorazione delle singole interazioni microbiche utilizzando sistemi modello semplificati facilita una migliore comprensione dell'intera complessità del microbioma².

È disponibile un'ampia varietà di sistemi modello per far crescere comunità microbiche di origine umana. Questi sistemi hanno migliorato la nostra comprensione delle comunità microbiche associate all'uomo e vanno dalla coltura batch a stadio singolo ai più complessi sistemi a flusso continuo multistadio. I sistemi modello, come il simulatore dell'ecosistema microbico intestinale umano³, il sistema chemostatico a stadio singolo a doppio vaso⁴ e il sistema di controllo ambientale per il microbiota intestinale⁵ replicano le condizioni fisiologiche di specifici siti anatomici e forniscono approssimazioni in vitro degli ambienti microbici. Tuttavia, la loro adozione da parte dei microbiologi è limitata perché sono costosi, richiedono competenze tecniche di alto livello per la gestione e la manutenzione e hanno una produttività limitata.

Per affrontare queste sfide, abbiamo sviluppato il sistema Minibioreactor Array (MBRA), un sistema di coltura a flusso continuo a stadio singolo progettato per facilitare la crescita stabile di comunità microbiche provenienti da diverse fonti in un ambiente controllato ^6,7,8. Il sistema MBRA si distingue dagli altri modelli di intestino per la sua semplicità di assemblaggio e funzionamento, combinata con capacità ad alta produttività che consentono la coltivazione simultanea di più comunità microbiche, aumentando l'efficienza sperimentale. Inoltre, la natura semplice e compatta di questo sistema ne consente il funzionamento all'interno di camere anaerobiche e microossiche per facilitare la crescita di batteri provenienti da siti anaerobi e ipossici, come il tratto gastrointestinale e vaginale. La natura versatile di questo sistema è stata sfruttata per lo screening delle comunità gastrointestinali resistenti a Clostridioides difficile ⁹, nonché per testare gli effetti degli antibiotici^10,11 e dei substrati dietetici¹² sulle comunità microbiche.

Gli MBRA sono fabbricati mediante stampa 3D o produzione additiva, dando priorità alla chiarezza e alla resistenza all'acqua nella scelta dei materiali (vedere la tabella dei materiali per informazioni sui polimeri). Ogni array contiene sei camere singole, tutte dotate di porte per l'importazione dei supporti, l'esportazione dei rifiuti e la raccolta dei campioni. I fluidi freschi vengono continuamente immessi nel sistema, mentre i rifiuti vengono estratti contemporaneamente, con portate controllate con precisione da due pompe peristaltiche. Il contenuto del sistema viene costantemente agitato utilizzando ancorette e una piastra di agitazione a 60 punti per facilitare colture omogenee. Il protocollo qui descritto è ottimizzato per un volume di lavoro di 15 mL per camera, sebbene ogni bioreattore possa ospitare un intervallo da 1 a 20 mL a seconda dei requisiti sperimentali. La pompa peristaltica e il tubo della pompa possono ospitare portate comprese tra 0,016 e 2,9 mL/min, corrispondenti a tassi di rotazione rispettivamente da circa 15,63 a 0,09 ore. Sebbene il sistema sia compatibile con un'ampia gamma di formulazioni di terreni e aggiunte dietetiche o nutrizionali, è necessario tenere conto di alcune considerazioni pratiche: i fluidi altamente viscosi possono richiedere una ricalibrazione delle portate e la presenza di particelle non disciolte o componenti insolubili può ostruire i tubi della pompa o i connettori stretti, in particolare a portate inferiori. La modularità del sistema consente una rapida e semplice personalizzazione degli esperimenti regolando la scelta dei terreni, la raccolta dei campioni, le portate e il volume di lavoro. In combinazione con quattro pompe peristaltiche a 24 canali e due piastre di agitazione a 60 punti, il sistema può far funzionare 48 camere separate per esperimento in una singola camera anaerobica, supportando lo screening anaerobico ad alto rendimento.

Questo protocollo funge da guida visiva e versione aggiornata di un metodo di assemblaggio e funzionamento MBRA precedentemente pubblicato sviluppato dal nostro laboratorio⁴. Sono stati incorporati diversi miglioramenti chiave per migliorare la riproducibilità, semplificare il flusso di lavoro e ridurre al minimo la contaminazione. In primo luogo, le cannucce in PTFE vengono ora incise chimicamente per evitare che si stacchino e cadano nelle camere del bioreattore. In secondo luogo, è stata aggiunta una cannuccia alle linee di alimentazione per dirigere il flusso del fluido sul fondo delle camere, impedendo ai fluidi di gocciolare lungo le pareti della camera. Questa era una fonte nota di formazione di biofilm. In terzo luogo, le lunghezze dei tubi C-flex sono state standardizzate e accorciate ed è stato progettato un supporto per tubi stampato in 3D per creare una configurazione più compatta e organizzata. Infine, i bioreattori non vengono più completamente smontati tra un utilizzo e l'altro, riducendo significativamente i costi di tempo e materiali associati a esperimenti ripetuti. Questi e altri perfezionamenti incrementali riflettono l'ottimizzazione iterativa basata sull'uso estensivo del sistema in più progetti nel nostro laboratorio.

Protocol

NOTA: Questo protocollo è per la preparazione e l'assemblaggio di una singola striscia MBRA (Figura 1). Ogni MBRA è costituito da un bioreattore stampato in 3D, da tubi per facilitare l'afflusso di un mezzo di crescita e da tubi per facilitare l'efflusso di rifiuti dalle camere del bioreattore. Un elenco completo delle parti che compongono un singolo MBRA, comprese le immagini, è disponibile nella Tabella 1. L'attrezzatura aggiuntiva richiesta include due pompe peristaltiche e una piastra di agitazione (vedere la tabella dei materiali per le specifiche del dispositivo).

1. Preparazione pre-assemblaggio

1. Mordenzatura con politetrafluoroetilene (PTFE)
   NOTA: Sebbene le proprietà chimiche del PTFE lo rendano ideale per l'uso in questo sistema MBRA, la sua lubrificazione rende impossibile il legame con altre parti del bioreattore utilizzando solo la resina epossidica. Per fissare il tubo in PTFE nei luer maschio filettati, è necessario prima inciderlo chimicamente per consentire l'incollaggio della resina epossidica. Viene utilizzato un mordenzante al fluorocarbonio (vedi Tabella dei materiali). La Figura 2A funge da guida visiva per la nastratura del tubo in PTFE per facilitare questo processo di incisione.
   1. Tagliare dodici lunghezze di tubo in PTFE da 25 mm. Sei di questi saranno tagliati a metà dopo l'incisione per fungere da cannucce per le linee di alimentazione ("media straw").
      NOTA: Deve essere incisa solo la sezione da incollare. Per evitare l'incisione della superficie interna e delle aree indesiderate, il tubo deve essere fissato con nastro adesivo e sigillato su entrambe le estremità.
   2. Utilizzando il nastro per etichettatura da laboratorio per uso generico (larghezza 19 mm), avvolgere completamente il nastro attorno alla parte superiore, coprendo ~5 mm del tubo in PTFE (Figura 2A). Applicare un'altra sezione di nastro adesivo attorno al fondo, coprendo ~10 mm del tubo in PTFE (Figura 2A).
   3. Pizzicare con decisione le estremità del nastro per evitare che la soluzione di mordenzatura raggiunga l'interno del PTFE (Figura 2A). Questo dovrebbe lasciare ~10 mm di tubo in PTFE esposti per l'incisione.
   4. Preparare quattro soluzioni: la soluzione di mordenzante al fluorocarburo riscaldata a 55 °C (vedere la tabella dei materiali per i dettagli sulla soluzione di mordenzante al fluorocarburo), etanolo al 100% (EtOH), H₂O distillato riscaldato a 70 °C e H₂O distillato + 2-5% di acido acetico riscaldato a 70 °C.
      ATTENZIONE: La soluzione mordenzante al fluorocarburo è altamente corrosiva. Eseguire tutti i passaggi in una cappa aspirante con DPI. Smaltire le sostanze chimiche secondo le linee guida istituzionali.
   5. Riscaldare tutte le soluzioni alle temperature indicate al punto 1.1.4. La soluzione mordenzante al fluorocarburo deve essere riscaldata a bagnomaria, le altre soluzioni possono essere riscaldate su una piastra calda. Versare le soluzioni in 4 contenitori di vetro separati abbastanza profondi da immergere completamente il tubo nastrato.
   6. Immergere tutti i tubi in PTFE nella soluzione di mordenzante al fluorocarbonio. Agitare per garantire un'esposizione uniforme della superficie. Immergere per 1 minuto, fino a quando la superficie mordenzata diventa marrone.
      NOTA: È possibile utilizzare un cucchiaio filtrante per skimmer in metallo per trasferire il tubo in PTFE tra le soluzioni.
   7. Trasferire il tubo nel bagno EtOH per 5-20 s.
   8. Travasare il tubo al bagno a 70 °C H₂0 per 15-30 s.
   9. Trasferire il tubo nel bagno di acido acetico a 70 °C H₂0 + 2-5% per 1 min.
   10. Rimuovere il tubo e posizionarlo su un tampone assorbente all'interno della cappa aspirante. Lasciare asciugare il tubo inciso per una notte (almeno 16 ore). Dopo l'asciugatura, rimuovere il nastro dal tubo inciso.
   11. Il PTFE mordenzato è pronto per l'incollaggio e rimarrà incollabile per diversi mesi se conservato a temperatura ambiente. Una volta che la colorazione marrone sulle superfici di incisione sbiadisce, non è più incollabile.
       NOTA: Non esporre il PTFE inciso ai raggi UV, poiché degraderebbe l'incisione.
   12. Tagliare a metà 6 dei tubi di PTFE incisi per fungere da cannucce per le linee di alimentazione (Figura 2A).
2. Cannucce epossidiche per rifiuti e media
   1. Inserire ciascuna delle 6 cannucce di scarto in PTFE incise e delle 6 cannucce in PTFE incise nel rispettivo luer maschio filettato. Assicurarsi che le superfici incise siano allineate con la parte inferiore del luer maschio (Figura 2).
   2. Miscelare la resina epossidica e l'indurente in un rapporto 1:1 in una bilancia o in una piastra di Petri. Utilizzando un puntale per pipetta da 1 mL, applicare la resina epossidica attorno alla base del luer maschio filettato nel punto in cui incontra il tubo in PTFE.
   3. Posizionare ogni pezzo verticalmente e lasciare che la resina epossidica si solidifichi per 24 ore.
      NOTA: Una scatola di puntali per pipette vuota da 1 ml funziona bene per tenerli in posizione verticale.

2. Assemblaggio MBRA

1. MBRA e preparazione delle parti
   1. Assicurarsi che le strisce dell'array del minibioreattore siano stampate in 3D (vedere il file supplementare 1) e contengano 6 camere di bioreattore indipendenti. Ogni camera contiene tre porte da 1/4 di pollice, che devono essere filettate per inserire i raccordi. Eseguire la filettatura con un rubinetto frazionato da 1/4 di pollice-28NF con una chiave per maschi con impugnatura a T.
      NOTA: Si consiglia l'uso di una guida per maschi quando si infilano le porte per garantire una filettatura a piombo.
   2. Una volta infilata, lavare ogni camera del bioreattore con acqua per rimuovere eventuali residui di plastica. Aggiungere un'ancoretta magnetica da 10 x 3 mm e 1 ml di acqua distillata in ciascuna camera. L'acqua aiuterà il processo di sterilizzazione durante la sterilizzazione in autoclave.
   3. Posizionare una rondella di gomma sopra ogni porta del bioreattore. Per ogni camera, avvitare 1 luer maschio filettato in paglia di scarto, 1 luer maschio filettato in paglia e 1 luer maschio filettato vuoto in ciascuna delle porte come indicato nella Figura 2B.
   4. Inserire 6 setti di gomma su punte luer femmina da 3/32 di pollice. Piega la parte superiore della manica dei setti verso il basso per coprire il collo. Fissarli alle porte di ciascuna camera indicate nella Figura 2B.
   5. Tagliare strisce di tubi C-flex della seguente lunghezza: 2 3/8 pollici, 3 11/16 pollici, 5 1/4 pollici, 6 1/2 pollici, 7 13/16 pollici e 9 pollici e 9 pollici (due di ogni lunghezza saranno necessari sia per le linee di scarico che per le linee di alimentazione). Una volta tagliato, collegare una barchetta luer femmina da 1/8 di pollice a un'estremità e un connettore luer lock maschio all'estremità opposta di ciascuna lunghezza di tubo.
      NOTA: Le lunghezze utilizzate qui sono ottimizzate per ridurre l'ingombro e per pompe posizionate a ~1 pollice di distanza dalla piastra di agitazione. A seconda della configurazione desiderata, potrebbero essere necessarie lunghezze maggiori.
   6. Inserire una punta luer femmina da 1/16 di pollice in ciascuna estremità del tubo E-lab rosso a 2 stop (ID 1,14 mm) e del tubo E-lab arancione a 2 stop (ID 0,89 mm). Ripeti questo processo sei volte per ogni striscia MBRA.
      NOTA: Per facilitare l'inserimento della punta luer femmina da 1/16 di pollice, immergere brevemente le estremità del tubo E-lab in acqua quasi bollente per ammorbidire la plastica.
   7. Collegare il tubo E-lab al tubo C-flex preparato al punto 2.1.5. Ciascuna delle 6 lunghezze di tubo C-flex deve essere collegata a una linea E-lab rossa e una arancione tramite luer femmina.
   8. Tagliare ventuno pezzi da 1 pollice, un pezzo da 2 pollici, tre pezzi da 3 pollici e un pezzo da 12 pollici di tubo C-flex. Collegare una punta luer femmina da 1/8 di pollice e un connettore luer lock maschio alle estremità di un pezzo da 3 pollici e del pezzo di tubo da 12 pollici. Al tubo rimanente, collegare i connettori luer lock maschio a entrambe le estremità. Questi pezzi comprenderanno gli assemblaggi della linea di scarico e dell'albero della linea di alimentazione.
2. Assemblaggio dell'albero della linea di scarico
   1. Seguire il diagramma 3D mostrato nella Figura 3B per assemblare l'albero della linea di scarico.
   2. Collegare le estremità esposte del tubo rosso E-lab a 2 stop (ID 1,14 mm) ai luer lock maschio del terminale sull'albero della linea di scarico assemblato. Fissarli in ordine crescente in base alla lunghezza del tubo C-flex collegato al tubo E-lab a 2 stop. Collegare il tubo C-flex da 3 pollici con la punta luer femmina da 1/8 di pollice e il connettore luer lock maschio alla parte superiore dell'albero della linea di scarico.
3. Assemblaggio dell'albero della linea di alimentazione
   1. Seguire il diagramma 3D mostrato nella Figura 3A per assemblare l'albero della linea di alimentazione.
      NOTA: Gli alberi della linea di alimentazione non incorporano i connettori luer maschio-maschio utilizzati nell'albero della linea di scarico. In base alla nostra esperienza, questi connettori sono soggetti a perdite e possono allentarsi facilmente, aumentando il rischio di contaminazione sia nelle camere del bioreattore che nei flaconi dei terreni. Per mitigare questo problema, l'albero della linea di alimentazione viene costruito senza questi componenti.
   2. Collegare le estremità esposte del tubo E-lab arancione a 2 stop (ID 0,89 mm) ai luer lock maschio terminale sull'albero della linea di alimentazione assemblato. Fissarli in ordine crescente in base alla lunghezza del tubo C-flex collegato al tubo E-lab a 2 stop. Collegare il tubo C-flex da 12 pollici alla parte superiore dell'albero della linea di alimentazione.
4. Assemblaggio completo: Combinare i componenti preparati nel sistema di coltura MBRA.
   1. Collegare il tubo C-flex a lunghezza variabile all'estremità dell'albero della linea di alimentazione al bioreattore, in ordine crescente, con la linea più corta sul lato sinistro della striscia del bioreattore e la più lunga a destra.
   2. Collegare il tubo C-flex a lunghezza variabile all'estremità dell'albero della linea di scarico alla striscia del bioreattore in ordine decrescente, con la linea più lunga a sinistra e la più corta a destra. La linea di scarico più corta si trova sul lato destro della striscia del bioreattore perché è più vicina alla pompa di scarico. Al contrario, la linea di alimentazione più lunga si trova sul lato destro perché la pompa di alimentazione si trova a sinistra (Figura 1).
5. Sterilizzazione di array assemblati: Preparare il sistema assemblato per la sterilizzazione.
   1. Raggruppare tutte le linee di alimentazione C-flex sul lato sinistro dell'MBRA e fissarle con una fascetta. Fai lo stesso per le linee di scarico sul lato destro della striscia.
   2. Forma un anello con il tubo E-lab arancione a 2 stop tra le linee C-flex. Fissare l'anello con del nastro adesivo per autoclave. Fai lo stesso per il tubo rosso E-lab a 2 stop sul lato di scarico della striscia del bioreattore. Ciò consentirà di risparmiare spazio durante la sterilizzazione in autoclave.
   3. Coprire il luer femmina all'estremità della linea di scarico e dell'albero della linea di alimentazione con un foglio di alluminio per evitare la contaminazione dopo la rimozione dall'autoclave. Allentare i luer filettati maschio con i setti su ciascuna camera del bioreattore per consentire la fuoriuscita del vapore durante la sterilizzazione in autoclave.
      NOTA: Questo passaggio è fondamentale per garantire che il vapore possa fuoriuscire dal bioreattore durante la sterilizzazione in autoclave. Se non adeguatamente ventilata, possono verificarsi crepe nelle camere del bioreattore.
   4. Posizionare l'MBRA in un contenitore per autoclave e stendere la linea di alimentazione e gli alberi della linea di scarto in contenitori separati adiacenti al contenitore contenente gli MBRA. Se il tubo E-lab vicino alla punta luer femmina da 1/16 di pollice o qualsiasi sezione del tubo C-flex viene piegato durante la sterilizzazione in autoclave, il tubo potrebbe ostruirsi, ostacolando il flusso di fluidi o rifiuti.
   5. Autoclavare a 121 °C, ≥ 15 psi per 25 min. Utilizzare un programma di scarico lento tipico dei cicli a liquido. Lasciare raffreddare il bioreattore a temperatura ambiente dopo il ciclo in autoclave. Dopo che l'MBRA si è raffreddato a sufficienza, serrare nuovamente i luer maschio filettati con i setti.
      NOTA: Le strisce del bioreattore autoclavate diventano malleabili e soggette a screpolature se compresse. Lasciare raffreddare a sufficienza prima di serrare i raccordi.
      NOTA: Il tubo arancione E-lab a 2 stop è soggetto a crepe durante il processo in autoclave e può separarsi dall'aletta luer femmina da 1/16 di pollice. Se si verifica una screpolatura, spruzzare entrambe le estremità con etanolo al 70%, quindi tagliare l'estremità incrinata con un rasoio sterile e ricollegare il tubo alla punta luer. In alternativa, è possibile sterilizzare separatamente un tubo E-lab aggiuntivo con luer femmina da 1/16 di pollice in una sacca per autoclave e sostituire l'intero tubo.

3. Assemblaggio dei supporti e delle bottiglie di scarto

1. Assemblaggio della bottiglia del supporto
   NOTA: Nel presente esempio, l'intero sistema viene alimentato con una singola bottiglia da 2 litri. Fare riferimento alla Figura 4A per un'immagine del gruppo del tappo di bottiglia del supporto.
   1. Avvitare gli adattatori Dibafit (adattatori per tappi di bottiglia) nelle due porte filettate sulla parte superiore del tappo di bottiglia della serie Q. Aggiungere una sezione di 3 pollici di tubo C-flex a uno degli adattatori e una sezione di 12 pollici di tubo C-flex all'altro. All'estremità di ogni sezione del tubo, aggiungere un connettore luer lock maschio.
      NOTA: La lunghezza del tubo necessaria per raggiungere l'albero della linea di alimentazione dell'MBRA può variare e può essere regolata di conseguenza.
   2. Taglia un pezzo di tubo in PTFE da 12 pollici che funga da cannuccia da cui attingere i media. Tagliare l'estremità con un angolo di 45° utilizzando una lama di rasoio per evitare l'intasamento della parete laterale della bottiglia. Inserire il PTFE nel piccolo foro sul fondo del tappo del flacone collegato alla sezione da 12 pollici del tubo C-flex.
   3. Taglia un pezzo di tubo C-flex da 2 pollici e collega una barchetta luer femmina a un'estremità e un connettore luer lock maschio all'altra. Collegare questo tubo alla sezione di tubo da 12 pollici che alla fine si collegherà all'albero della linea di alimentazione. Fissare il pezzo da 2 pollici con un Pinchcock. Posizionare l'anello del Pinchcock attorno al tubo da 3 pollici del tappo della bottiglia. Questo servirà come tappo temporaneo per evitare perdite di terreno durante e dopo la sterilizzazione in autoclave.
   4. Preparare il supporto desiderato. Installare il tappo del flacone completamente assemblato sul flacone del terreno. Avvolgere il tubo C-flex da 12 pollici attorno alla bottiglia e fissare l'estremità con il Pinchcock sul tubo da 2 pollici, come descritto sopra. Non avvitare saldamente il tappo, ma allentarlo leggermente per evitare l'accumulo di pressione durante la sterilizzazione in autoclave.
   5. Usa un foglio per coprire l'estremità del tubo da 3 pollici che parte dal tappo della bottiglia. Autoclavare per un tempo adeguato al protocollo del supporto. Dopo la sterilizzazione, rimuovere la pellicola dal tubo da 3 pollici e avvitare un filtro per siringa da 0,22 μm nel connettore luer lock maschio. Ciò consentirà il flusso d'aria nella bottiglia del terreno durante il pompaggio, ma eviterà la contaminazione.
      NOTA: Prima dell'uso, assicurarsi che i tappi dei flaconi della serie Q siano ben chiusi sui flaconi, poiché una chiusura impropria potrebbe impedire il corretto flusso.
2. Assemblaggio delle bottiglie di scarto: per evitare di cambiare le bottiglie di scarto ogni giorno, il laboratorio ha creato un sistema di raccolta dei rifiuti a più livelli (Figura 4B) che consente di riempire più bottiglie da 2 litri con rifiuti durante l'esperimento. La configurazione di questo sistema di rifiuti a più livelli è la seguente:
   1. Avvitare gli adattatori del tappo di bottiglia nelle due porte filettate sulla parte superiore di un tappo di bottiglia della serie Q. Ripetere l'operazione per 2-4 tappi, a seconda del numero di flaconi per la conservazione dei rifiuti necessari.
   2. Taglia un pezzo di PTFE da 2 pollici per ogni tappo di bottiglia. Inserire questo pezzo all'interno del tappo della bottiglia nel foro designato per la rimozione dei rifiuti nella bottiglia successiva nel sistema.
   3. Tagliare un tratto di tubo C-flex abbastanza lungo da allungarsi tra l'albero della linea di scarico che parte dalla pompa fino alla posizione del sistema di bottiglie di scarico. Montare un connettore luer lock maschio all'estremità adiacente all'albero della linea di scarico e collegare l'altra estremità all'adattatore del tappo della bottiglia senza il tubo in PTFE sul tappo della bottiglia.
   4. Tagliare un secondo pezzo di tubo C-flex per collegare i tappi del primo e del secondo flacone di scarto. Fissare il tubo sull'adattatore del tappo della bottiglia con la cannuccia in PTFE sulla prima bottiglia e sull'adattatore del tappo della bottiglia senza la cannuccia in PTFE sulla seconda bottiglia.
      NOTA: Ogni bottiglia nella cascata di bottiglie di scarto a più livelli deve essere posizionata sopra la prima per consentire alla gravità di assistere il flusso da una bottiglia all'altra (Figura 4B). Si consiglia di posizionare tutte le bottiglie in un contenitore secondario (ad esempio, un contenitore di plastica aperto) e di disporle in ordine decrescente utilizzando le alzate, come i contenitori per oggetti taglienti rovesciati.
   5. Continuate questa catena per tutte le bottiglie che desiderate. Sull'ultima bottiglia, collegare un segmento di tubo C-flex da 3 pollici con un connettore luer lock maschio all'adattatore del tappo della bottiglia libero. Quindi collegare una siringa da 20 ml per applicare il vuoto e facilitare la cascata dei rifiuti.

4. Connessione, funzionamento e smontaggio MBRA

1. Collegamento alle pompe
   1. Rimuovere il nastro dell'autoclave che tiene insieme il tubo E-lab sia per le linee di scarico che per quelle di alimentazione. Sciogliere i fasci di tubi C-flex.
   2. Posizionare l'MBRA tra le due pompe sopra la piastra di agitazione. Può essere fissato alla lastra utilizzando i supporti stampati in 3D (vedere il file supplementare 2). Assicurarsi che sia allineato con le posizioni di agitazione indicate sulla piastra di agitazione.
   3. Collegare il tubo E-lab della linea di alimentazione alle cartucce della pompa peristaltica. Posizionare i fermi del tubo E-lab nelle fessure delle cartucce. Fare lo stesso per il tubo E-lab della linea di scarico sulla pompa a destra della piastra di agitazione.
   4. Bloccare le cartucce della pompa peristaltica nella pompa. Assicurarsi che le cartucce siano completamente posizionate contro la pompa e che il tubo sia all'interno del canale delle cartucce.
      NOTA: Bloccare le cartucce in posizione sulle pompe solo se si intende avviare il flusso entro 24 ore. Se lasciati bloccati senza flusso di fluido per più di 24 ore, i tubi possono comprimersi e ostruirsi. In tal caso, è sufficiente rimuovere il morsetto e massaggiare delicatamente il tubo nel punto di compressione.
   5. Riordina il tubo C-flex utilizzando i supporti per tubi stampati in 3D (File supplementare 3).
   6. Fissare l'estremità dell'albero della linea di scarico al tubo che porta alle bottiglie di scarico.
      NOTA: Quando si eseguono più MBRA, gli alberi della linea di scarico dovranno essere biforcati insieme prima di essere collegati al tubo che porta alle bottiglie di scarico. Questa operazione può essere eseguita creando un semplice albero di ramificazione per ogni MBRA aggiuntivo.
   7. Collegare il luer femmina sul tubo di ingresso della linea di alimentazione al connettore maschio sul tubo da 12 pollici dal tappo del flacone del supporto.
      NOTA: A questo punto entrambe le estremità devono essere sterili. Evitare di toccarli con qualsiasi potenziale fonte di contaminazione. Se si sospetta una contaminazione, immergere ciascuna estremità in candeggina al 10% per 10 minuti prima di collegarle.
   8. Accendere entrambe le pompe per iniziare il flusso di fluidi. Assicurarsi che le pompe scorrano nella direzione corretta (entrambe impostate in senso orario ("CW") se i rifiuti si trovano a destra delle pompe).
   9. Osservare la dimensione e la cadenza delle goccioline di terreno che cadono in ciascuna camera del bioreattore; Eventuali grandi differenze in questo possono indicare la variabilità della portata. Se si osserva variabilità, si consiglia di sostituire qualsiasi tubo di alimentazione E-lab arancione a 2 stop collegato alla camera del bioreattore incriminata. Ciò contribuirà a limitare la variabilità della velocità di flusso nell'esecuzione sperimentale.
      NOTA: Questo è il momento di diagnosticare e riparare eventuali perdite nel sistema, quindi monitorare attentamente il processo di riempimento iniziale.
   10. Una volta che le camere del bioreattore hanno raggiunto la capacità, spegnere entrambe le pompe e lasciare riposare i bioreattori per 24-48 ore. Questo passaggio è essenziale per verificare la presenza di eventuali contaminazioni nelle camere prima dell'inizio dell'esperimento.
2. Inoculazione MBRA
   NOTA: Qui descriviamo il protocollo di base per la sterilizzazione dei setti e l'iniezione di un inoculo.
   1. Preparare l'inoculo secondo le specifiche desiderate.
   2. Applicare una soluzione di candeggina al 10% appena preparata sulla parte superiore dei setti su ciascuna camera del bioreattore utilizzando un contagocce di plastica. Deposita abbastanza candeggina per ricoprire completamente la parte superiore dei setti. Lasciate riposare per 10 minuti. Asciugare i setti con una salvietta sterile da laboratorio.
   3. Utilizzando un ago da 3 pollici di lunghezza e 22 G e una siringa contenente il campione, perforare il centro dei setti. Assicurarsi che l'ago tocchi il terreno all'interno della camera, quindi iniettare l'inoculo nella camera del bioreattore. Sciacquare la siringa rimuovendo il terreno e reiniettandolo nella camera. Rimuovere gli aghi dai setti e smaltirli in un contenitore per oggetti taglienti.
   4. Lasciare crescere l'inoculo per un periodo appropriato, in base al disegno sperimentale, prima di iniziare il flusso. Ad esempio, le comunità batteriche fecali richiedono una crescita iniziale del lotto di 4-16 ore per aumentare una quantità sufficiente di biomassa⁸.
   5. Accendere entrambe le pompe alla portata desiderata, a seconda del tempo di rotazione richiesto. Per ulteriori informazioni sulle portate, consultare il manuale della pompa peristaltica.
      NOTA: Indipendentemente dalla portata desiderata, la pompa di scarico deve essere sempre azionata a una velocità superiore a quella della pompa del fluido per garantire che le camere del bioreattore non trabocchino. Per la nostra coltivazione della comunità batterica gastrointestinale, utilizziamo un tasso di turnover di 1,92 mL/h, ottenuto impostando la pompa del terreno a 1,0 giri/min e la pompa di scarico a 2,0 giri/min.
   6. Ancora una volta, osservare le dimensioni e la cadenza delle goccioline di terreno che cadono in ciascuna camera del bioreattore, qualsiasi grande differenza in questo può indicare la variabilità della portata. Se si osserva variabilità, si consiglia di sostituire qualsiasi tubo di alimentazione E-lab arancione a 2 stop collegato alla camera del bioreattore incriminata. Ciò contribuirà a limitare la variabilità della velocità di flusso nelle esecuzioni sperimentali.
3. Campionamento MBRA
   1. Applicare una soluzione di candeggina al 10% sulla parte superiore dei setti su ciascuna camera del bioreattore, sufficiente a rivestire completamente la superficie. Lasciate riposare per 10 minuti. Dopo 10 minuti, asciugare i setti con una salvietta sterile da laboratorio.
   2. Utilizzando un ago e una siringa calibro 22 lunghi 3 pollici, perforare il centro dei setti e inserire completamente l'ago nella camera del bioreattore. Tenendo la siringa, tirare indietro lo stantuffo per rimuovere il campione dalla camera.
      NOTA: Evitare di rimuovere più del 20% del volume totale della camera del bioreattore in una sola volta. La rimozione di una quantità maggiore di questo può danneggiare la comunità microbica, poiché l'efflusso dei rifiuti viene interrotto fino a quando il terreno fresco non riempie la camera fino al livello della cannuccia di scarto in PTFE.
   3. Rimuovere l'ago e dosare il campione in un contenitore appropriato. Smaltire l'ago in un contenitore per oggetti taglienti.
4. Smontaggio e ricondizionamento MBRA
   NOTA: Dopo gli esperimenti, l'MBRA dovrà essere sterilizzato e preparato per esperimenti futuri.
   1. Commutare l'ingresso del supporto con 1 L di candeggina al 10% in acqua deionizzata (DI). Aumentare al massimo la portata di entrambe le pompe per spostare il contenuto delle camere del bioreattore con la soluzione di candeggina.
   2. Una volta che le camere diventano chiare (tutti i mezzi sono stati sostituiti con candeggina), capovolgere l'MBRA per disinfettare sopra la linea di riempimento per 5 minuti. Dopo 5 minuti, raddrizzare la striscia e attendere altri 5 minuti per la sterilizzazione.
      NOTA: Non lasciare riposare la candeggina oltre i 10 minuti come descritto sopra, poiché ciò causerà lo scolorimento della plastica e l'indebolimento del supporto e del tubo di scarico.
   3. Sostituire la soluzione di candeggina al 10% con 1 L di acqua deionizzata. Sciacquare il sistema con acqua deionizzata fino a quando tutta l'acqua non è passata. Scollegare il tubo E-lab del bioreattore dalle pompe e rimuovere gli MBRA.
   4. Per la ristrutturazione, rimuovere i setti usati e tutto tranne 1 ml di acqua da ciascuna camera.
   5. Sostituire i setti e il tubo E-lab arancione a 2 stop e seguire i passaggi precedenti per prepararsi alla sterilizzazione in autoclave (passaggi da 2.5.1 a 2.5.5) fino a 3 volte. Dopo il terzo riutilizzo, l'MBRA deve essere completamente smontato, il tubo C-flex sostituito e ogni singola parte sterilizzata con il 70% di EtOH o sostituita se rotta. La resina epossidica che trattiene i rifiuti e il PTFE di alimentazione diventerà fragile dopo diversi cicli in autoclave e dovrà essere riapplicata.
      NOTA: Il tubo arancione E-lab a 2 stop viene sostituito tra ogni corsa per limitare la variabilità della portata causata dall'usura e dai ripetuti cicli dell'autoclave.

Results

Per facilitare la crescita di batteri anaerobi, come quelli che si trovano nel tratto gastrointestinale, l'MBRA può essere installato e utilizzato all'interno di camere anaerobiche. Per dimostrare la capacità di far crescere comunità batteriche complesse direttamente da siti rilevanti nel corpo umano, è stato preparato un campione fecale umano e coltivato in questo sistema. Tutto il lavoro è stato svolto in una camera anaerobica impostata a 37°C e le colture sono state coltivate nel nostro terreno di coltura per bioreattore, BRM3⁷.

Il liquame fecale è stato preparato scongelando le feci umane in modo anaerobico e quindi mescolandolo con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) fino a una concentrazione finale del 25% p/v. Dopo aver confermato la sterilità, sono state inoculate nove camere del bioreattore con 3 ml dello stesso impasto fecale. Le comunità microbiche sono state coltivate durante la notte senza input di terreni o rimozione dei rifiuti, ottenendo colture batch separate per un periodo di 16 ore. Quindi, le pompe di alimentazione sono state accese e impostate su una portata di 1,92 ml all'ora. Dopo quattro giorni di flusso continuo, i campioni sono stati raccolti dai bioreattori e analizzati per la composizione della comunità microbica utilizzando il sequenziamento genico dell'rRNA 16S seguito dal denoising con Deblur e dalla classificazione tassonomica con il database SILVA 138 SSU in QIIME 2¹³. Un totale di 65 generi sono stati rilevati in tutte e nove le repliche, ma i bioreattori erano dominati da soli 18 generi, ciascuno dei quali comprendeva almeno il 2% di abbondanza in una delle nove repliche (Figura 5). I bioreattori hanno mostrato un'elevata riproducibilità tale che 22 dei 65 generi sono stati rilevati in tutte e nove le repliche e altri 17 generi sono stati rilevati in almeno la metà delle repliche. La maggior parte dei generi assenti da almeno un reattore (37 su 43 generi) erano specie rare, ciascuna con abbondanza relativa inferiore al 2% nei bioreattori. In sintesi, le colture MBRA a flusso continuo hanno supportato comunità microbiche complesse e riproducibili derivate dallo stesso campione di feci, anche dopo colture batch separate per 16 ore all'interno di ciascuna camera del bioreattore.

Figura 1: L'array di minibioreattori (MBRA). MBRA completamente assemblato, comprese le etichette per l'albero dei tubi della linea di alimentazione e di scarico, le camere del bioreattore e la striscia del bioreattore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Guida all'incisione in PTFE e layout della porta MBRA. (A) Diagramma di flusso da seguire per l'incisione dei terreni e delle cannucce in PTFE di scarto. (B) Ogni camera del bioreattore contiene una porta per una cannuccia media + luer maschio filettato, una cannuccia di scarto + luer maschio filettato e un setto + luer maschio filettato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Alberi della linea di alimentazione e di scarto MBRA. Immagini rappresentative da seguire nell'assemblaggio di (A) albero della linea di alimentazione e (B) albero della linea di scarico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Tappo di bottiglia del supporto e sistema di livelli di scarto. (A) Un esempio di tappo di bottiglia assemblato della serie Q utilizzato per estrarre i supporti negli MBRA. (B) Un'immagine del sistema di raccolta dei rifiuti a più livelli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Abbondanza relativa dei generi batterici. (A) Il grafico a barre sovrapposte mostra l'abbondanza relativa di tutti i generi che comprendono almeno il 2% di abbondanza in uno qualsiasi dei campioni visualizzati. (B) Metriche di diversità alfa degli OTU osservati e della diversità di Shannon tra tutte e nove le camere del bioreattore. Tutte e nove le camere del bioreattore sono state inoculate con lo stesso impasto fecale preparato da feci umane. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Componenti MBRA. Immagini e descrizioni di tutte le singole parti necessarie per assemblare completamente l'MBRA, insieme alla quantità necessaria per ogni componente. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Guida alla risoluzione dei problemi. Problemi comuni riscontrati con l'esecuzione dell'MBRA, insieme alle loro potenziali cause e soluzioni consigliate. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Fascicolo supplementare 1: File Stl per la stampa 3D delle strisce di array di minibioreattori. Clicca qui per scaricare questo file.

Fascicolo supplementare 2: File Stl per la stampa 3D dei supporti del bioreattore utilizzati per ancorare i bioreattori alle piastre di agitazione. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 3.: File Stl per la stampa 3D dei portatubi utilizzati per organizzare i rifiuti C-flex e i tubi di alimentazione che si estendono dagli MBRA. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Questo protocollo descrive l'assemblaggio completo e il funzionamento di base di un array di minibioreattori (MBRA) per la coltivazione ad alto rendimento di comunità batteriche, incorporando diversi perfezionamenti chiave al metodo precedentemente pubblicato. Il sistema MBRA rimane uno strumento versatile ed economico che consente ai ricercatori di coltivare ecosistemi microbici complessi supportando numerose repliche sperimentali in parallelo. In questa versione aggiornata, introduciamo miglioramenti che migliorano la riproducibilità, semplificano il flusso di lavoro e riducono il rischio di contaminazione. Questi includono cannucce in PTFE incise chimicamente (Figura 2) per evitare il distacco, una cannuccia di alimentazione sulla linea del terreno (Figura 2) per ridurre al minimo la formazione di biofilm, lunghezze dei tubi standardizzate con un supporto per tubi stampato in 3D (File supplementare 3) per una configurazione più compatta e organizzata e un protocollo di riutilizzo ottimizzato che elimina la necessità di uno smontaggio completo tra gli esperimenti. Insieme, questi perfezionamenti rappresentano miglioramenti iterativi sviluppati attraverso l'uso estensivo del sistema MBRA in diverse applicazioni sperimentali nel nostro laboratorio. Affrontando sia le fasi critiche dell'assemblaggio che i miglioramenti pratici, questa discussione sottolinea l'utilità dell'MBRA come sistema modello in continua evoluzione per la ricerca sul microbioma.

Il successo del sistema MBRA si basa in gran parte sull'assemblaggio e la sterilizzazione precisi dei componenti per garantire un funzionamento privo di contaminazioni. I passaggi chiave includono il corretto montaggio dei tappi, dei tubi e dei connettori della serie Q, che facilitano l'assemblaggio modulare e consentono l'ingresso dei media e la raccolta dei rifiuti. Garantire una tenuta ermetica tra i flaconi dei terreni, i serbatoi di scarto e le camere del bioreattore è essenziale per prevenire perdite e mantenere condizioni di sterilità. Un altro passaggio critico è la verifica delle portate delle pompe peristaltiche prima della sperimentazione, poiché le incongruenze possono portare a un'erogazione irregolare dei terreni e possono influenzare le dinamiche di crescita microbica. La maggior parte delle pompe peristaltiche multicanale che utilizzano cassette includono un meccanismo di regolazione dell'occlusione, che dovrebbe essere utilizzato per regolare con precisione la portata di ciascun canale. Anche con una corretta calibrazione, il tubo E-lab rimane una fonte primaria di variabilità. Per mitigare questo problema, è importante monitorare visivamente la frequenza e le dimensioni delle goccioline di terreno che entrano in ciascuna camera del bioreattore sia durante il riempimento iniziale che durante l'inizio degli esperimenti. Questi controlli visivi consentono di rilevare precocemente le incongruenze della portata che potrebbero altrimenti compromettere la riproducibilità sperimentale. La tabella 2 fornisce le strategie di risoluzione dei problemi comuni riscontrati durante l'assemblaggio e l'uso degli MBRA. Questi passaggi per la risoluzione dei problemi garantiscono la riproducibilità tra gli esperimenti e prevengono interruzioni durante la coltivazione a lungo termine.

Nonostante i suoi punti di forza, il sistema MBRA presenta alcune limitazioni che devono essere considerate quando si progettano gli esperimenti. A differenza dei sistemi più avanzati, l'MBRA non dispone di funzionalità di monitoraggio attivo, come le misure di densità ottica (OD) in tempo reale, il controllo del pH e la regolazione della temperatura. Questa assenza di misurazione attiva limita la capacità del sistema di monitorare i cambiamenti dinamici nella crescita microbica e nell'attività metabolica in tempo reale. Inoltre, sebbene il sistema supporti la coltivazione anaerobica all'interno delle camere, non include il controllo integrato dei gas, che può limitare le applicazioni che richiedono ambienti microaerofili precisi o arricchiti di CO₂. Per gli studi che richiedono tale controllo, possono essere più adatti sistemi alternativi con regolazione del gas incorporata.

Il sistema MBRA offre vantaggi chiave rispetto ai modelli di bioreattori esistenti, tra cui elevata produttività, scalabilità ed economicità, pur mantenendo la capacità di coltivare comunità batteriche complesse a flusso continuo per imitare ambienti dinamici come il tratto gastrointestinale umano ^6,8,10. Il suo design compatto e modulare consente il funzionamento simultaneo di più bioreattori, rendendolo ideale per studi ad alto rendimento come lo screening delle comunità di derivazione fecale per la resistenza all'invasione di agenti patogeni⁹. Questo design modulare offre un'ampia flessibilità sperimentale: ogni striscia può essere alimentata da una singola bottiglia di terreno, come dimostrato in questo protocollo, o da un massimo di sei fonti di terreno distinte, una per ogni camera del bioreattore. Il volume di lavoro è regolato dalla lunghezza di una sottile cannuccia di scarto in PTFE inserita nella porta di scarico di ciascuna camera, che imposta l'altezza del liquido; in questo protocollo, le paillettes da 25 mm mantengono un volume di lavoro di 15 ml, ma i volumi compresi tra 1 e 20 ml possono essere raggiunti tagliando o estendendo la cannuccia. Inoltre, le cannucce di alimentazione più corte vengono inserite nell'ingresso del substrato per dirigere l'afflusso verso la base della camera, impedendo al setti di gocciolare lungo le pareti della camera e riducendo la formazione di biofilm sopra la linea di riempimento. Anche la velocità della pompa o il diametro del tubo della pompa possono essere regolati per modificare il tasso di rotazione del sistema. Ad oggi, il sistema MBRA è stato ampiamente utilizzato per studiare i cambiamenti funzionali e composizionali delle comunità microbiche in risposta a una varietà di fattori, tra cui antibiotici¹⁰, farmaci antitumorali¹⁴ e vari composti dietetici 12,15,16,17 . Il design semplice e modulare lo rende ideale per l'adattamento a varie esigenze sperimentali. Ad esempio, l'MBRA è stato modificato per studiare i biofilm in condizioni simili a quelle dei chemiostati¹⁸, dimostrando la sua versatilità per gli studi di ecologia microbica al di là delle colture planctoniche.

Le future iterazioni del sistema MBRA potrebbero beneficiare di ulteriori aggiornamenti ingegneristici che ne ampliano le funzionalità, la precisione e il potenziale di produttività. Uno di questi miglioramenti è l'incorporazione di porte aggiuntive in ciascuna camera del bioreattore. Queste porte potrebbero essere utilizzate per supportare il monitoraggio attivo di parametri ambientali come pH, temperatura, gas o densità ottica. Ciò risolverebbe una delle limitazioni più significative del modello, consentendo il feedback e il monitoraggio in tempo reale. I miglioramenti alla geometria della camera o della porta potrebbero facilitare una pulizia più accurata e accessibile, riducendo l'accumulo di residui e lo scolorimento e migliorando la riutilizzabilità a lungo termine. L'integrazione di ulteriori pompe peristaltiche con timer programmabili consentirebbe input di media pulsati o diurni, simulando meglio gli ambienti associati all'ospite come i cicli di alimentazione nell'intestino umano. Infine, la stampa 3D con materiali alternativi, come i polimeri chimicamente resistenti e autoclavabili, può consentire una maggiore durata e compatibilità con una gamma più ampia di reagenti. Insieme, questi miglioramenti potrebbero espandere significativamente la portata sperimentale e la fedeltà della piattaforma MBRA.

In conclusione, l'MBRA fornisce una piattaforma potente e ad alto rendimento per la coltivazione e lo studio delle comunità microbiche in condizioni controllate. Sebbene presenti limitazioni nel monitoraggio attivo e nel controllo del pH, la sua flessibilità, scalabilità ed efficienza in termini di costi lo rendono uno strumento prezioso per un'ampia gamma di studi microbiologici, in particolare quelli che richiedono un'elevata replicabilità e produttività sperimentale. È importante sottolineare che la progettazione modulare e l'approccio alla fabbricazione del sistema lo rendono intrinsecamente adattabile; i ricercatori hanno e possono continuare a personalizzare l'MBRA per soddisfare un'ampia gamma di obiettivi sperimentali. Questa adattabilità garantisce che l'MBRA possa continuare a evolversi insieme alle questioni e alle tecnologie scientifiche emergenti, mantenendo la sua rilevanza come piattaforma versatile per la ricerca sul microbioma.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Guida V-tap, misure standard da 0-80 a 5/8"	Strumenti Big Gator	STD500NP
0,22 μ m filtro per siringhe	Pescatore	SLGVR33RS
2mag MIXdrive 60 Agitatore (solo azionamento)	2MAG	MF 41060
Aghi ipodermici Air-tite, 22G x3"	VWR	89219-274
BD 1mL Slip Tip Siringhe sterili sterili	Pescatore	14-823-434
Bioreattore	Proto-Laboratori	NA	Stampato in 3D con DMS Somos Watershed Plastic. Vedere il file supplementare 1 per il modello
Supporti per bioreattori	Proto-Laboratori	NA	Stampato in 3D in PA 12 nero. Vedere il file supplementare 2 per il modello.
Tappo per flacone solvente Diba Omnifit Q-Series, GL38/38-430 (vetro), 2 attacchi UNF(F) senza valvole, blu	Cole Parmer	EW-21942-86
Tubo Diba Omnifit, PTFE, diametro esterno 1/8" (3,2 mm) x diametro interno 1,5 mm	Cole Parmer	EW-21942-76
Adattatore Dibafit, fondo piatto 1/4"-28 UNF(M) con diametro interno di 3,2 mm, PEEK	Cole Parmer	EW-21941-49
IRWIN 12001ZR Chiave per maschi #0-1/4" Impugnatura a T	Amazzone	B00004YOB0
Irwin Hanson Rubinetto per frazione SAE in acciaio ad alto tenore di carbonio da 1/4 di pollice. 1 pz	Zoro	G7695682
Loctite Heavy Duty Epoxy Quick Set 8-Fluid Ounce Bottiglia	Amazzone	B0044F59N0
Connettore Luer Lock da maschio a maschio	Darwin Microfluidica	DM-MM-LUER-PP	Alternativa: Strategic Applications Inc Connettore Luer Maschio-Maschio - 10/pz - Fisher - NC9876577
Raccordi adattatori Masterflex, Luer a Luer, Nylon, Avantor	VWR	MFLX45502-56
Raccordo Masterflex, nylon, dritto, adattatore femmina Luer-portagomma, 1/16" ID	VWR	MFLX45502-00
Raccordo Masterflex, nylon, dritto, adattatore femmina da Luer a portagomma, diametro interno 3/32"	VWR	MFLX45502-02
Raccordo Masterflex, nylon, dritto, femmina Luer a portagomma, 1/8"	VWR	MFLX45502-04
Raccordo Masterflex, Nylon, Dritto, Adattatore Luer Lock Maschio a Portagomma, 1/8	VWR	MFLX45505-04
Raccordo Masterflex, Nylon, Dritto, Luer maschio x 1/4-28 UNF	VWR	MFLX45505-82
Raccordo Masterflex, polipropilene, gomito, adattatore Luer femmina a Luer femmina	VWR	MFLX45508-26
Tubo per pompa Masterflex Ismatec, 2 fermi, Tygon S3 E-Lab, diametro interno 0,89 mm	VWR	MFLX96460-26
Tubo per pompa Masterflex Ismatec, 2 fermi, Tygon S3 E-Lab, diametro interno 1,14 mm	VWR	MFLX96460-30
Masterflex® Tubo di trasferimento, C-Flex, bianco opaco, 1/8" ID x 1/4" OD; 25 piedi	VWR	MFLX06424-67
Mohr' s Pinchcock per tubi	VWR	470201-374
rondelle parafango in gomma neoprene ½ ” OD x ¼ ” ID x 1/16" Spessore	Amazzone	B01A29F1R0
Setti in gomma con guarnizione di precisione	Sigma Aldrich	Z553905
Micro ancorette Spinbar	VWR	58948-375
Tetra-incisione	Compagnia R.S. Hughest	TE-500
Supporto per tubi	Proto-Laboratori	NA	Stampato in 3D in PA 12 nero. Vedere il file supplementare 3 per il modello.
Pompa a cartuccia multicanale Watson-Marlow 205S	Watson-Marlow	020.3724.00A	Scontate, alternative: Pompe peristaltiche digitali Ismatec IPC MFLX7800142 - FISHER - 113-200-014 o Masterflex Pompa peristaltica Ismatec IPC, da 0,1 a 11,25 giri/min, 24 canali, 115/230 V CA, Avantor, VWR, MFLX78006-48-CH