Valutazione dell'aterosclerosi nell'aorta da topi iniettati con AAV8-PCSK9 mediante colorazione con olio rosso O

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo passo-passo per sezionare, perfondere, colorare, imaging e quantificare le lesioni aterosclerotiche en face nelle aorte di topo utilizzando la colorazione Oil Red O.

Abstract

I modelli murini sono stati a lungo strumenti fondamentali nello studio dell'aterosclerosi, fornendo informazioni critiche sui meccanismi molecolari e cellulari alla base della formazione delle placche, del metabolismo lipidico e dell'infiammazione cardiovascolare. Oltre ai topi Apoe^-/- o Ldlr^-/-, l'iniezione di AAV8-PCSK9^D377Y in topi C57BL/6J normali con concomitante alimentazione con dieta di tipo occidentale emerge come modello comunemente usato per la ricerca traslazionale nell'aterosclerosi. La colorazione Oil Red O è una tecnica fondamentale per visualizzare l'accumulo di lipidi neutri nei tessuti vascolari. La sua semplicità, l'economicità e l'elevata sensibilità per il rilevamento di lesioni cariche di lipidi lo rendono il gold standard per la valutazione del carico di placche aterosclerotiche negli studi preclinici. In questo studio, forniamo un protocollo dettagliato e riproducibile per la dissezione, la perfusione, l'apertura longitudinale, la colorazione Oil Red O, l'imaging e la quantificazione semi-automatica del carico aterosclerotico nell'aorta en front, senza la necessità di perni o complessi passaggi di montaggio. I nostri risultati dimostrano che la combinazione dell'iniezione di AAV8-PCSK9^D377Y e dell'alimentazione dietetica di tipo occidentale induce efficacemente una significativa formazione di lesioni aterosclerotiche nei topi e che la colorazione con O rosso olio è una tecnica affidabile ed efficiente per valutare la deposizione lipidica e il carico di placca. Inoltre, sebbene questo protocollo sia ottimizzato per il modello indotto da AAV8-PCSK9 nei topi C57BL/6J, può essere facilmente adattato per l'uso in altri modelli e specie, come i topi Apoe^-/-, i topi Ldlr^-/- e i criceti siriani dorati Ldlr-/^-.

Introduzione

L'aterosclerosi, caratterizzata dalla deposizione di lipidi e dall'infiammazione all'interno dell'intima arteriosa, rappresenta il fondamento patologico della malattia coronarica e di un'ampia gamma di malattie cardiovascolari (CVD), tra cui l'infarto del miocardio e l'ictus 1,2,3,4. Le CVD rimangono la principale causa di morbilità e mortalità in tutto il mondo, rappresentando un significativo onere sanitario ed economico globale ^3,5. Come base patologica primaria delle CVD, l'aterosclerosi ha raccolto un'ampia attenzione da parte della ricerca volta a scoprire i suoi meccanismi sottostanti e a sviluppare strategie terapeutiche efficaci. I modelli murini svolgono un ruolo centrale nel chiarire i meccanismi alla base dell'aterogenesi e nella valutazione di potenziali interventi terapeutici⁶. Lo sviluppo di modelli animali è stato determinante per far progredire la nostra comprensione dell'aterogenesi, consentendo ai ricercatori di sezionare i meccanismi cellulari e molecolari coinvolti e di valutare le strategie terapeutiche emergenti ^6,7. I classici modelli murini di aterosclerosi, come i topi con deficit di apolipoproteina E (Apoe^-/-) e con deficit di recettore delle lipoproteine a bassa densità (Ldlr^-/-), sono stati a lungo impiegati per indurre iperlipidemia e robusta formazione di placche. Tuttavia, la generazione e il mantenimento di queste linee geneticamente modificate richiedono un allevamento estensivo, che può richiedere molto tempo e limitare la flessibilità sperimentale ^8,9,10. Per superare queste limitazioni, ha acquisito importanza un approccio alternativo che utilizza il sierotipo 8 del virus adeno-associato che codifica per una mutazione con guadagno di funzione nella proproteina convertasi subtilisina/kexina di tipo 9 (AAV8-PCSK9^D377Y). Quando somministrato a topi C57BL/6J wild-type in combinazione con una dieta di tipo occidentale ricca di grassi e colesterolo, questo metodo induce efficacemente ipercolesterolemia e lesioni aterosclerotiche in un lasso di tempo relativamente breve, senza la necessità di incroci genetici complessi o di reincroci in sfondi inclini all'aterosclerosi ^9,11. Nonostante i suoi vantaggi, il modello AAV8-PCSK9 presenta alcune limitazioni che meritano di essere prese in considerazione. In particolare, l'entità dell'ipercolesterolemia e lo sviluppo di lesioni aterosclerotiche possono essere influenzati da variabili come la dose virale e i mezzi di somministrazione, che possono introdurre variabilità interanimale e influenzare la riproducibilità dei risultati sperimentali¹¹.

Per valutare il carico di malattia in tali modelli, la colorazione dell'aorta con O rosso olio fornisce una tecnica ben consolidata e sensibile per visualizzare e quantificare le lesioni aterosclerotiche ricche di lipidi lungo la superficie luminale del sistema vascolare^12,13. Questo approccio offre dati sia qualitativi che quantitativi ed è ampiamente utilizzato negli studi preclinici per valutare gli effetti della manipolazione genetica, dell'intervento farmacologico o della modulazione dietetica¹⁴.

In questo studio, presentiamo un protocollo pratico e riproducibile per l'isolamento, la perfusione, l'apertura longitudinale, la colorazione Oil Red O, l'imaging e la quantificazione semi-automatica delle lesioni aterosclerotiche nelle aorte di topo a montatura intera. In questo protocollo, AAV8-PCSK9^D377Y viene somministrato alla dose di 5 × 10¹¹ genomi vettori (vg) per topo tramite iniezione della vena caudale. Se combinata con una dieta di tipo occidentale (WD) contenente il 40% di kcal da grassi e l'1,25% di colesterolo, si può osservare un robusto sviluppo di lesioni aterosclerotiche entro 12-16 settimane. Il protocollo semplifica ogni fase del processo, eliminando la necessità di fissare i fazzoletti sulle superfici in cera e impiegando invece una tecnica di appiattimento semplificata che riduce la variabilità e la domanda tecnica. Il metodo non è solo ottimizzato per il modello indotto da AAV8-PCSK9^D377Y nei topi C57BL/6J, ma è anche facilmente applicabile ad altri modelli ampiamente utilizzati di aterosclerosi, inclusi i topi Apoe^-/- e Ldlr^-/-, nonché i criceti dorati siriani Ldlr^-/- 15,16,17,18,19, che sono emersi come un modello promettente grazie al loro metabolismo lipidico simile a quello umano.

Protocollo

Tutte le procedure per gli animali sono state eseguite in conformità con le linee guida delineate nel NIH e sono state approvate dal Comitato Etico Animale dell'Università di Scienza e Tecnologia della Cina (Approvazione Etica n. USTCACUC27120124102).

NOTA: Tutte le procedure che coinvolgono AAV8-PCSK9 devono essere condotte in una cabina di sicurezza biologica certificata di Classe II in condizioni di Biosicurezza di Livello 2 (BSL-2). Il personale deve indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) adeguati, tra cui camice da laboratorio, guanti monouso e occhiali di sicurezza.

1. Induzione dell'aterosclerosi nei topi

1. Iniettare un topo C57BL/6J di 8 settimane per via endovenosa con AAV8-PCSK9^D377Y (5 × 10¹¹ vg/topo attraverso la vena caudale).
2. Posizionare il mouse su WD (contenente il 40% di kcal di grassi e l'1,25% di colesterolo) immediatamente dopo l'iniezione.
3. Somministrare il WD al topo per 12-16 settimane per indurre la formazione di lesioni aterosclerotiche.
   NOTA: Un periodo di alimentazione di 12 settimane è comunemente usato ed è stato dimostrato che induce un'evidente formazione di placche aterosclerotiche, in particolare nei modelli indotti da AAV8-PCSK9. Durate più lunghe (ad esempio, 16 settimane) possono portare a lesioni più avanzate e il punto temporale ottimale deve essere selezionato in base agli obiettivi sperimentali specifici.
4. Monitorare regolarmente il peso corporeo, la salute generale e i livelli di lipidi plasmatici durante il periodo di alimentazione. Per la profilazione lipidica, raccogliere campioni di sangue al basale e in punti temporali selezionati (ad esempio, ogni 4 settimane) tramite sanguinamento sottomandibolare o della vena caudale in breve anestesia con isoflurano.

2. Eutanasia e perfusione

1. Somministrare pentobarbital sodico (200 mg/kg, iniezione intraperitoneale) per l'eutanasia del topo.
2. Aprire la cavità toracica per esporre il cuore.
3. Praticare un'incisione nell'appendice atriale destra e perfondere soluzione salina con tampone fosfato freddo (PBS, circa 10 ml) attraverso il ventricolo sinistro utilizzando un ago da 21 G per eliminare il sangue.

3. Dissezione dell'aorta

1. Rimuovere i tessuti in eccesso come i polmoni e il timo per esporre l'aorta toracica dal cuore al diaframma.
2. Usa forbici da dissezione fini e pinze di precisione per rimuovere il tessuto adiposo circostante attorno all'arco aortico. Sollevare delicatamente il tessuto adiposo che circonda la base dell'aorta toracica vicino al diaframma. Asciugare lungo la radice del tessuto adiposo utilizzando forbici da dissezione fine (assicurandosi che la struttura vascolare non venga danneggiata), continuando la dissezione verso l'alto fino all'arco aortico per esporre completamente il vaso aortico.
   NOTA: La dissociazione del tessuto adiposo perivascolare dall'aorta è fondamentale e si suggerisce di eseguire questo passaggio con l'aorta in situ (prima di essere tagliata dal topo) poiché la dissezione del grasso perivascolare dall'aorta è tecnicamente difficile una volta che l'aorta è stata sezionata e posta in PBS.
3. Sezionare il vaso alla base dell'aorta toracica utilizzando le forbici di precisione. Sollevare l'estremità tagliata con una pinza e sezionarla verso l'alto lungo il vaso verso l'arco aortico. Recidere i tre rami primari dell'aorta a una distanza appropriata.
4. Transetto alla radice aortica per separare l'aorta toracica dal cuore, isolando l'intero segmento per ulteriori analisi.
5. Trasferire il recipiente asportato in una soluzione pre-refrigerata di paraformaldeide al 4% (PFA) e incubare a 4 °C per una notte (12-16 ore). Per standardizzare la manipolazione e facilitare l'elaborazione dei lotti, posizionare le singole aorte nei pozzetti di una piastra da 24 o 48 pozzetti durante il fissaggio.
   NOTA: Evitare la fissazione prolungata (oltre 24 ore), poiché un'eccessiva incubazione in PFA può causare l'indurimento del vaso, ostacolando il sezionamento longitudinale e ulteriori analisi.
   ATTENZIONE: il 4% di PFA è un fissativo tossico e volatile che comporta rischi di esposizione respiratoria e cutanea. Tutte le fasi che prevedono il fissaggio dei PFA devono essere eseguite in una cappa aspirante indossando i DPI, compresi i guanti in nitrile, il camice da laboratorio e gli occhiali di sicurezza. Evitare l'inalazione e il contatto con la pelle. La soluzione PFA utilizzata deve essere raccolta in appositi contenitori per rifiuti di formaldeide, chiaramente etichettata e smaltita come rifiuto chimico pericoloso da un servizio di smaltimento dei rifiuti chimici istituzionale o autorizzato.

4. Colorazione O rosso olio

1. Lavare le aorte fisse tre volte con PBS per rimuovere il PFA residuo.
2. Come mostrato nella Figura 1, aprire l'aorta longitudinalmente al microscopio da dissezione utilizzando forbici sottili, partendo dalla radice aortica lungo la curvatura interna. In alternativa, aprire l'aorta prima del fissaggio, il che può facilitare l'apertura e l'allineamento del vaso durante il montaggio. Se necessario, aprire longitudinalmente i rami principali dell'arco aortico, come l'arteria brachiocefalica (BCA), l'arteria carotide destra (RCA) e l'arteria succlavia sinistra, per esporre ulteriori regioni¹¹. Fai attenzione durante questa fase, poiché le placche in queste aree potrebbero staccarsi o danneggiarsi.
   NOTA: Entrambi gli approcci possono essere selezionati in base alle preferenze dell'operatore e alle condizioni del tessuto.
3. Preparare la soluzione di lavoro Oil Red O diluendo lo stock 0,5% in isopropanolo con acqua deionizzata in rapporto 3:2 (v/v, concentrazione finale 0,3%). Incubare a bagnomaria a 37 °C per 5 minuti per sciogliere completamente il colorante.
4. Filtrare attraverso una membrana da 0,22-0,45 μm per rimuovere i precipitati. Conservare la soluzione nel bagnomaria a 37 °C fino al momento dell'uso.
5. Rimuovere il PBS da ogni pozzetto. Aggiungere la soluzione di lavoro Oil Red O per immergere completamente le aorte. Incubare a temperatura ambiente (RT) per 10 min.
6. Dopo l'incubazione, aspirare la soluzione e aggiungere immediatamente 1 mL di isopropanolo al 60% a ciascun pozzetto. Posizionare il piatto su uno shaker e agitare delicatamente per lavare.
7. Dopo circa 30 s, quando le aree non lesionate del vaso appaiono traslucide, interrompere il lavaggio aspirando l'isopropanolo. Sciacquare i campioni due volte con PBS.
8. Dopo la colorazione con olio rosso O, tagliare ulteriormente il tessuto adiposo perivascolare residuo, se necessario. In questa fase, il tessuto adiposo è tipicamente ben colorato e visivamente distinguibile, il che consente un'identificazione e una rimozione più accurate senza compromettere l'integrità della parete vascolare.
9. Dopo la colorazione con olio rosso O, aprire l'aorta longitudinalmente e montarla con cautela su un vetrino per ottenere un imaging immediato al microscopio.
10. In alternativa, conservare i campioni per un breve periodo in PBS a 4 °C prima dell'imaging. Per le arterie difficili da appiattire, appuntare i vasi su una lastra di cera nera utilizzando aghi sottili per garantire un posizionamento e una chiarezza ottimali. Per una conservazione a lungo termine, montare i recipienti colorati su vetrini, sigillarli con gelatina glicerica e quindi visualizzarli direttamente.
    NOTA: Trasferire le aorte macchiate su una nuova piastra per il lavaggio per evitare la contaminazione da olio residuo O rosso.
    ATTENZIONE: Oil Red O è un colorante lipofilo tipicamente preparato in isopropanolo, che è infiammabile e irritante. Maneggiare le soluzioni ORO in una cappa chimica per evitare l'inalazione di fumi. Evitare il contatto con la pelle e gli occhi. Le soluzioni coloranti Oil Red O devono essere raccolte separatamente in contenitori per rifiuti chimici infiammabili. Smaltire secondo le normative locali sullo smaltimento dei rifiuti pericolosi.

5. Imaging

1. Monta le aorte colorate su uno sfondo bianco per migliorare il contrasto. Mantenere la flessibilità dell'imbarcazione.
   NOTA: Uno sfondo ad alto contrasto facilita un riconoscimento più efficiente della placca utilizzando il software di analisi delle immagini. È possibile utilizzare anche altri colori di sfondo in base alle preferenze dell'utente.
2. Visualizzare l'intera aorta utilizzando uno scanner piano o un microscopio da dissezione con una fotocamera ad alta risoluzione.
3. Garantite un'illuminazione uniforme e un ingrandimento costante tra i campioni (ad esempio, da 6 a 8 volte l'ingrandimento). Se l'aorta si asciuga durante l'imaging, reidratare utilizzando salviette per kiwi imbevute di soluzione salina o PBS.

6. Quantificazione delle lesioni aterosclerotiche

1. Aprire l'immagine in ImageJ. I passaggi seguenti descrivono la procedura di analisi utilizzando ImageJ come esempio.
   NOTA: È possibile utilizzare anche altri software di analisi delle immagini (ad es. Zeiss Zen, Fiji) a seconda delle preferenze e della disponibilità dell'utente.
2. Impostare la scala utilizzando un riferimento noto (ad esempio, barra della scala o righello). Utilizzare lo strumento Linea retta per disegnare sulla distanza nota. Vai su Analizza > Imposta scala, inserisci la distanza e le unità, seleziona Globale e fai clic su OK.
3. Usa lo strumento Poligono o Selezione a mano libera per delineare l'intera regione aortica.
4. Misurare l'area utilizzando Analizza > Misura.
5. Identifica le aree della placca aterosclerotica utilizzando l'immagine > Regola > soglia colore. Regola la saturazione e la luminosità per isolare le regioni O-positive rosso olio.
6. Fare clic su Seleziona per generare la selezione binaria delle aree colorate. Misurare le regioni selezionate utilizzando Analizza > Misura. Applica le stesse impostazioni di soglia a tutte le immagini in un batch.
   NOTA: Dato che il grasso residuo o gli artefatti possono causare una colorazione falsa positiva, gli utenti possono scegliere di definire manualmente o semi-automaticamente le regioni della placca in base alle loro specifiche esigenze sperimentali e alla qualità dell'immagine. Il tracciamento manuale dell'area della placca può essere eseguito utilizzando lo stesso metodo utilizzato per definire l'area totale del vaso.
7. Esporta i risultati (File > Salva con nome > risultati) come .csv per ulteriori analisi.
8. Esprimere l'area della placca come area della placca/area aortica totale × 100%. Per ottenere una valutazione più accurata del carico di placche aterosclerotiche, quantificare l'area della placca in base alle regioni anatomiche (ad esempio, arco aortico, in particolare la curvatura minore e l'aorta totale) ed esprimere i risultati come percentuale dell'area della placca rispetto alla superficie totale di ciascuna rispettiva regione: area della placca (%) = (area della placca / area totale della regione) × 100%.
   NOTA: Per ridurre al minimo le potenziali distorsioni, si consiglia l'analisi in cieco. Se si analizza un gran numero di immagini, l'intero flusso di lavoro, dalla soglia alla misurazione, può essere automatizzato utilizzando il Macro Recorder (Plugins > Macros > Record) ed elaborato in blocco utilizzando Process > Batch > Macro. Ciò consente un'analisi efficiente e riproducibile ad alto rendimento.

Risultati

Per valutare l'entità della deposizione lipidica nella parete aortica, è stata eseguita la colorazione con O rosso olio en face su aorte isolate da topi maschi C57BL/6J iniettati con AAV8-PCSK9^D377Y e alimentati con una dieta occidentale per 12 settimane, insieme a topi di controllo di pari età. Dopo perfusione sistemica con PBS e un'attenta dissezione, l'intera aorta è stata accuratamente sezionata longitudinalmente e colorata con Oil Red O per visualizzare le lesioni aterosclerotiche cariche di lipidi. La pr...

Discussione

Il metodo di colorazione O rosso olio en face descritto in questo studio offre un approccio robusto, riproducibile ed efficiente in termini di tempo per valutare il carico di lesioni aterosclerotiche nell'intera aorta. In questo studio, abbiamo selezionato specificamente l'arco aortico e l'aorta toracica come regioni di interesse per l'analisi della placca, piuttosto che l'intera aorta. Questa decisione è stata guidata dalla natura del modello AAV8-PCSK9^D377Y

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
C57BL/6J topi	GemPharmatech	N. N000013
4% paraformaldeide	Beyotime	P0099	Per fissare i tessuti
AAV8-PCSK9D377Y particelle virali	Wzbio	pAV208001	Per indurre l'aterosclerosi
Pinze fini	Strumenti di scienza fine	n. 11254-20	Per la dissezione dell'aorta
ImageJ	NIH	1.47
Isopropanolo	Sangon biotech	A600918	Per pulire l'olio in eccesso rosso
Olio rosso O 0,5% Soluzione in isopropanolo	Poly Scientific R & D Corp	S1849-32OZ	Per la colorazione con olio rosso O
Soluzione salina tamponata con fosfato	Servicebio	G4202	Per la perfusione e la pulizia delle aorte
Forbici a molla	Strumenti per la scienza fine	n. 15003-08	Per la dissezione dell'aorta
Microscopio stereoscopico	Mshot	MZ62	Per la dissezione dell'aorta e l'imaging
della dieta occidentale	Ricerca Dieta	Indurre l'aterosclerosi

D12108C