Articolo metodologico

Stimolazione delle cellule endoteliali vascolari mediante trappole extracellulari neutrofile in presenza di lipoproteine a bassa densità

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DOI:

10.3791/68830

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12 agosto 2025

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1Department of Biological Chemistry, Showa Medical University Graduate School of Pharmacy

In questo articolo

Sommario

Viene descritta una serie di metodi, tra cui l'isolamento di lipoproteine a bassa densità (LDL) dal plasma umano, la differenziazione di cellule HL-60 in cellule simili ai neutrofili, la preparazione di trappole extracellulari per neutrofili (NET) in presenza di LDL e la stimolazione di cellule endoteliali aortiche umane con una miscela di NET e LDL.

Abstract

Le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) sono emerse come fattori causali in varie malattie non infettive e sono state implicate in disturbi cardiovascolari come l'aterosclerosi e la trombosi. La formazione di NET si osserva nella parete vascolare e ci sono prove convincenti che i marcatori plasmatici della formazione di NET aumentano con la gravità della malattia. I componenti NET derivati dai neutrofili, tra cui le mieloperossidasi e le proteasi, influenzano le lipoproteine plasmatiche e l'omeostasi vascolare. Qui viene descritta una serie di metodi per stimolare le cellule vascolari con NET formati in presenza di lipoproteine a bassa densità (LDL). L'LDL è stato frazionato dal plasma umano mediante ultracentrifugazione. Le cellule HL-60 sono state trattate con acido retinoico all-trans per differenziarle in cellule simili ai neutrofili e quindi stimolate con forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) per indurre la formazione di NET. Dopo la rimozione e il lavaggio della PMA, le cellule sono state ulteriormente incubate con LDL. I surnatanti raccolti contenenti NET e LDL sono stati immediatamente utilizzati per stimolare le cellule endoteliali aortiche umane (HAEC). Come risposta rappresentativa, l'alterazione morfologica delle HAEC indotta dal trattamento con NET è stata potenziata dalla presenza di LDL, suggerendo che la formazione di NET, in combinazione con LDL, aumenta la risposta delle HAEC. Questi metodi sono utili per esplorare gli effetti delle LDL sulle cellule endoteliali sotto attivazione dei neutrofili e infiammazione associata a NET, fornendo così nuove informazioni sui meccanismi alla base delle malattie cardiovascolari associate all'aumento delle LDL plasmatiche.

Introduzione

Le trappole extracellulari dei neutrofili (NET), prodotte dai neutrofili attivati in seguito a infezione batterica, così come in condizioni fisiologicamente plausibili non infettive, rilasciano DNA e proteine decondensate, come gli istoni, la mieloperossidasi (MPO) e l'elastasineutrofila 1. Poiché questi componenti possono smantellare cellule e tessuti marginali, causando un'infiammazione persistente, la formazione di NET è emersa come fattore causale nell'inizio e nella progressione di varie malattie acute e croniche, tra cui l'artrite reumatoide, la psoriasi, il diabete, il morbo di Alzheimer, le metastasi tumorali e le malattie cardiovascolari2. Le analisi istologiche delle lesioni vascolari umane dell'aterosclerosi3 e dell'aneurisma dell'aorta addominale4 hanno mostrato che l'infiltrazione dei neutrofili e la formazione di NET erano colocalizzate. Nel sangue circolante, i livelli di marcatori NETs, come gli istoni citrullinati, NET-DNA e MPO, aumentano con la gravità della malattia coronarica5. Nelle prime fasi dell'aterosclerosi, la formazione di NET spesso precede l'accumulo di lipidi, che avviene attraverso la formazione di cellule schiumogene guidate dai macrofagi 6,7. Questi fenomeni suggeriscono fortemente che l'MPO e gli enzimi proteolitici rilasciati extracellulare durante la formazione di NET possono agire non solo sui tessuti vascolari ma anche sui componenti del sangue, come le lipoproteine. Le lipoproteine sono fragili complessi lipidico-proteici che possono essere danneggiati da proteine derivate da NET come l'MPO8; quindi, la formazione di NET può causare alterazioni strutturali e biochimiche nelle lipoproteine, influenzando così l'omeostasi vascolare. Tuttavia, gli effetti sinergici della formazione di NET e delle lipoproteine sulla disregolazione indotta dalle cellule vascolari e sulle risposte infiammatorie rimangono poco chiari.

Qui, questo manoscritto fornisce un metodo per esaminare le risposte cellulari delle cellule endoteliali vascolari umane indotte dal trattamento con NET preparati da cellule simili ai neutrofili derivate da HL-60 e lipoproteine a bassa densità (LDL) frazionate da plasma umano. Risultati rappresentativi dimostrano il frazionamento di LDL dal plasma umano mediante ultracentrifugazione e le risposte cellulari delle cellule endoteliali aortiche umane (HAEC) stimolate con NET dopo co-incubazione con LDL. Questo metodo è ampiamente applicabile allo studio delle cellule vascolari che coinvolgono altre lipoproteine.

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Protocollo

Il protocollo per la preparazione delle LDL è stato approvato dal comitato etico della Showa Medical University School of Pharmacy (n. 231). Il consenso informato scritto è stato ottenuto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki e tutti i partecipanti hanno fornito volontariamente le loro firme per la partecipazione a questo studio. Le cellule sono state manipolate in modo asettico utilizzando una cappa a flusso laminare. Il criterio di inclusione era una fascia d'età compresa tra 22 e 65 anni. I criteri di esclusione includevano l'abitudine al fumo, le malattie cardiovascolari preesistenti (come malattie coronariche, ictus e malattie delle arterie periferiche), gravi disfunzioni epatiche e condizioni croniche incontrollate, tra cui diabete, ipertensione, dislipidemia, gravi malattie infiammatorie e cancro. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Isolamento di LDL dal plasma umano

  1. Raccogliere il sangue intero da un volontario umano sano in presenza di eparina anticoagulante (10 unità/mL).
  2. Centrifugare 45-50 mL di sangue intero umano ottenuto in una provetta per eparina (700 × g per 15 minuti a 4 °C). Assicurarsi di ridurre lentamente la velocità della centrifuga. Raccogliere lo strato superiore che comprende la frazione plasmatica.
  3. Eseguire la centrifugazione due volte (700 × g, 15 min a 4 °C) con la stessa impostazione di decelerazione del passaggio 1.2 per eliminare le cellule del sangue. Aggiungere un volume 1:1.000 di 250 mM EDTA (pH 7,4) per prevenire l'ossidazione delle lipoproteine mediata da ioni metallici bivalenti.
  4. Mettere 2,7 mL di plasma in una provetta da 4 mL di policarbonato (4PC), sovrapporre 900 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente 250 μM DI EDTA (PBS/EDTA) e ultracentrifugare (600.000 × g, 7 min a 4 °C).
  5. Scartare 900 μl dello strato superiore per eliminare il chilomicrone. Impilare 900 μl di PBS/EDTA su plasma e ultracentrifuga (600.000 × g, 2,5 h a 4 °C).
  6. Scartare 900 μl dello strato superiore per eliminare le lipoproteine a bassissima densità (VLDL). Questo passaggio è importante per prevenire la contaminazione delle LDL con altre frazioni lipoproteiche.
  7. Aggiungere 540 μL di soluzione KBr 0,5 mg/mL per regolare la densità a d = 1,063, quindi miscelare delicatamente con una pipetta e quindi ultracentrifugare (600.000 x g, 2,5 h a 4 °C).
  8. Raccogliere 540 μl dello strato superiore contenente LDL. Uno strato giallo-arancione indica una separazione LDL riuscita9. Trasferire su una membrana di dialisi.
  9. Dializzare la frazione LDL tre volte contro 2 L di PBS/EDTA a 4 °C al buio per eliminare il KBr.
  10. Conservare LDL a 4 °C al buio prima dell'uso.

2. Preparazione di pozzetti rivestiti di poli-L-lisina o gelatina

  1. Preparare una soluzione di poli-L-lisina allo 0,01%10 diluendo la soluzione di poli-L-lisina allo 0,1% con acqua sterile, seguita da filtrazione con un filtro sterile da 0,2 μm. Conservare a 4 °C prima dell'uso.
  2. Aggiungere 152 μL/pozzetto di soluzione di poli-L-lisina allo 0,01% a ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti e incubare per almeno 5 minuti.
  3. Rimuovere la soluzione e quindi lavare una volta con 200 μL/pozzetto di acqua sterile e asciugare per almeno 2 ore.
  4. Conservare a temperatura ambiente prima dell'uso nella preparazione dei NET.

3. Preparazione dei pozzetti rivestiti di gelatina

  1. Preparare una soluzione di gelatina allo 0,1% prima dell'uso diluendo la soluzione di gelatina al 2% con acqua sterile.
  2. Aggiungere 152 μL/pozzetto della soluzione di gelatina allo 0,1 % a ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti e incubare per almeno 5 minuti11.
  3. Rimuovere la soluzione e quindi lavare una volta con 200 μL/pozzetto di acqua sterile e asciugare per almeno 2 ore.
  4. Conservare a temperatura ambiente prima dell'uso.

4. Mantenimento e preparazione delle cellule endoteliali dell'aorta umana (HAEC)

  1. Coltura di HAEC primarie in un pallone di coltura non rivestito utilizzando un terreno completo contenente il 2% di siero fetale di vitello (FCS), 5 ng/mL di fattore di crescita epidermico, 10 ng/mL di fattore di crescita basico dei fibroblasti, 20 ng/mL di fattore di crescita insulino-simile, 0,5 ng/mL di fattore di crescita endoteliale vascolare, 1 μg/mL di acido ascorbico, 22,5 μg/mL di eparina e 0,2 μg/mL di idrocortisone, come indicato nelle istruzioni del produttore. Cambiare il terreno a giorni alterni fino a quando le celle sono confluenti al 70%-80%.
  2. Per la stimolazione, seminare gli HAEC in piastre a 12 pozzetti rivestite di gelatina. Cambiare il mezzo a giorni alterni fino a raggiungere la confluenza. Esegui l'esperimento tra i passaggi 4 e 7.

5. Preparazione di cellule neutrofile derivate da HL-60 seguite da NET

  1. Mantenere le cellule HL-60 con il terreno RPMI-1640 integrato con il 5% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina/streptomicina, utilizzando piatti non trattati.
  2. Per la preparazione di cellule simili ai neutrofili derivate da HL-60, coltivare 2 × 106 cellule per 10 mL di cellule HL-60 per 4 giorni in terreno RPMI-1640 contenente 2 μM di acido retinoico all-trans (AtRA).

6. Preparazione di NET con LDL

  1. Raccogliere le cellule HL-60 4 giorni dopo il trattamento con 2 μM di AtRA. Dopo la differenziazione delle cellule HL-60 in cellule simili ai neutrofili, le cellule diventano più piccole.
  2. Celle di centrifugazione (220 × g, 4 min a 18-22 °C). Aspirare il surnatante e lavare le cellule con un volume uguale di RPMI-1640 privo di siero.
  3. Centrifugare le cellule (220 × g, 4 min a 18-22 °C) e quindi risospendere le cellule con RPMI-1640 privo di siero.
  4. Contare le cellule, quindi risospendere le cellule a 2 × 106 cellule/mL in RPMI-1640 senza siero e seminare 0,5 mL di sospensione cellulare nei pozzetti di una piastra a 12 pozzetti pre-rivestita con poli-L-lisina. Coltura per almeno 30 min.
  5. Aggiungere 100 μl di RPMI-1640 senza siero con o senza 300 nM di forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) alla concentrazione finale di 0 o 50 nM PMA. Coltura per 30 min.
  6. Rimuovere il terreno e lavare le cellule una volta con RPMI-1640 senza siero. Sostituire il terreno con RPMI-1640 privo di siero con o senza 20 μg/mL di LDL e quindi coltivare per 2 ore.
  7. Raccogliere il terreno di coltura e centrifugare (700 × g, 3 minuti a 18-22 °C) per rimuovere i detriti cellulari.

7. Stimolazione delle HAEC con NET e LDL

  1. Sostituire il terreno con 0,5 ml di terreno di coltura fresco. Coltura per almeno 30 minuti prima della stimolazione.
  2. Aggiungere 167 μl di terreno di coltura contenente NET e LDL (fase 6.7) e LDL alle piastre HAEC. Controllare i cambiamenti morfologici nelle HAEC indotte dopo la stimolazione per 12 ore o più.

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Risultati

Dopo la rimozione dei chilomicroni, seguita dalle frazioni VLDL dal plasma umano attraverso l'ultracentrifugazione sequenziale, il plasma umano è stato miscelato con una soluzione di KBr per regolare la densità a d = 1,063. In questa fase, il precipitante rimanente non è stato completamente disciolto nella soluzione e si è evitata una miscelazione severa, che ha creato bolle di gas, per mantenere intatto l'LDL. Dopo l'ultracentrifugazione, l'LDL è stato valutato visivamente sullo strato superiore dal suo colore ...

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Discussione

Questo protocollo descrive la preparazione di NET da cellule dHL-60 indotte dalla coesistenza di LDL, che vengono successivamente utilizzate per analizzare le risposte HAEC. L'importanza di questo protocollo è l'uso di terreno fresco contenente NET e LDL per la stimolazione delle cellule, anche se molti altri studi utilizzano una soluzione madre di NET congelati a -20 °C. Poiché le lipoproteine sono complessi lipidico-proteico, le loro strutture e caratteristiche intatte vengono perse d...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo studio è stato in parte sostenuto dalla Japan Society for the Promotion of Science, KAKENHI (numeri di sovvenzione 23K10897 e 19K07069). Ringraziamo Editage (www.editage.jp) per la modifica della lingua inglese.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,1% Poli-L-lisinaSigmaAldrichP8920-100ML
Piatto da 10 cmCorning430591
Piastre per colture tissutali a 12 pozzettiFalcone353043
2% GelatinaSigmaAldrichG1393-20ML
Tubo da 4 pezziHimacS404332A
Acido retinoico all-transWako188-01113Può essere sostituito con qualsiasi fornitore
Tubi per dialisi in celluriosioGruppo MISUMI Inc.0327-23-37-07 (UC18-32-100)Può essere sostituito con qualsiasi fornitore
EDTADojindo345-01865Può essere sostituito con qualsiasi fornitore
Terreno di coltura delle cellule endoteliali 2 KitPromoCellC-22111
Siero fetale bovinoGibco10270-106Può essere sostituito con qualsiasi fornitore
Eparina sodica (5.000 unità/5 mL)Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.Può essere sostituito con qualsiasi fornitore
Centrifuga refrigerata ad alta velocitàTOMYSRX-201Accelerazione: 9, Decelerazione: 7
cellule endoteliali aortiche umaneLonzacc-2535
KBrWako168-03475Può essere sostituito con qualsiasi fornitore
Software per microscopia KEYENCEKEYENCEAnalizzatore BZ-II
Micro UltracentrifugaHimacCS150GX
MicroscopiaOLIMPOCK40
MicroscopiaKEYENCEBZ-9000Per l'imaging time-lapse (opzione)
Telecamera per microscopiaNikonDS-Fi3
Software per telecamera per microscopiaNikonDS-L4
Penicillina/StreptomicinaGibco15140-122 100MLPuò essere sostituito con qualsiasi fornitore
tampone fosfato soluzione salina (× 10)Sciogliere 2,6 g di NaH2PO4· 2H2O, 29 g di Na2HPO4· 12H2O, 80 g di NaCl e 2,0 g di KCl in acqua distillata e regolare al volume di 1 L. (Può essere sostituito con qualsiasi fornitore)
PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetato)Wako162-23591Può essere sostituito con qualsiasi fornitore
Confezione di reagentiLonzaCC-5034(CC-5022: Soluzione salina tamponata HEPES, CC-5012: Tripsina/EDTA, CC-5002: Soluzione neutralizzante della tripsina) 
RotoreHimacS100AT6-0242
RPMI-1640 (con rosso fenolo)Wako189-02025Può essere sostituito con qualsiasi fornitore
RPMI-1640 (senza rosso fenolo)Wako186-02155Può essere sostituito con qualsiasi fornitore
Pallone T-25Corning3275

Riferimenti

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