In questo protocollo, viene illustrato un saggio combinato di amplificazione della polimerasi ricombinasi CRISPR/Cas12a per la rilevazione del patogeno invasivo delle piante, Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4.
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Articolo metodologico
Saggio combinato di amplificazione della polimerasi ricombinata CRISPR/Cas12a per il rilevamento di Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Una sorveglianza regolare e accurata è fondamentale per una gestione efficiente delle malattie delle piante. Può indicare quale linea d'azione è più appropriata e se è necessaria la prevenzione, l'eradicazione o l'assenza di interventi. La sorveglianza basata sulla sintomatologia nelle sole piante ospiti spesso non è affidabile a causa delle somiglianze nei sintomi causati da stress biotici e abiotici. I metodi molecolari di laboratorio, come la reazione a catena della polimerasi (PCR) e la PCR quantitativa (q), sono i più comunemente e in modo affidabile per il rilevamento di patogeni vegetali, ma si basano su attrezzature costose e operatori qualificati. Qui, descriviamo un protocollo che combina un'estrazione semplificata del DNA, l'amplificazione della polimerasi ricombinasi (RPA) e brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente intervallate (CRISPR)/Cas12a (RPA-Cas12a) per la rilevazione del patogeno invasivo, Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4 (Foc TR4). La tecnica fornisce una semplice alternativa di rilevamento in provetta singola che è analiticamente robusta con una specificità migliorata rispetto ai saggi di rilevamento molecolari disponibili e annulla la necessità di apparecchiature di laboratorio costose e sofisticate.
Introduzione
L'appassimento del Fusarium, causato dal patogeno fungino del suolo Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc), è considerato a livello globale come uno dei patogeni transfrontalieri delle piante più devastanti della storia1. Una volta introdotto in una nuova area, il Foc rimane invisibile fino a quando le piante infette non sviluppano i sintomi. Questo può richiedere mesi, consentendo al fungo di stabilirsi e diffondersi inconsapevolmente. Una volta stabilito, è quasi impossibile eradicarlo economicamente a causa della produzione di clamidospore resistenti e della natura perenne della produzione di banane. L'importanza della prevenzione e della diagnosi precoce, quindi, è fondamentale per proteggere i coltivatori vulnerabili1. L'attuale epidemia della malattia, causata dalla razza tropicale Foc 4 (TR4), richiede il rilevamento da parte di una sorveglianza regolare per identificare le piante di banano sintomatiche nelle aree ad alto rischio. I vincoli abiotici come lo stress idrico e alcune carenze nutrizionali producono un ingiallimento esterno, che è simile ai sintomi prodotti dall'infezione da Foc TR4. Inoltre, i sintomi derivanti dall'infezione da diverse razze Foc non possono essere distinti. La purificazione in laboratorio e la successiva rilevazione fenotipica e molecolare sono, quindi, necessarie per una rilevazione affidabile di Foc TR42. Sono disponibili vari saggi molecolari per la rilevazione di Foc TR4, tra cui PCR, PCR quantitativa (q) e saggi di amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) 3,4,5,6,7. La maggior parte di questi protocolli, tuttavia, richiede ancora competenze e attrezzature costose e specializzate, che devono essere condotte in ambienti di laboratorio. L'amplificazione della ricombinasi polimerasi (RPA) può essere eseguita isotermicamente e, quindi, elimina la necessità di tali apparecchiature e può essere presa in considerazione per i protocolli di rilevamento sul campo8.
I sistemi CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)-Cas sono stati sempre più utilizzati per migliorare la diagnostica molecolare9. Questi sistemi vengono utilizzati in quanto economici, semplici e non richiedono l'uso di strumentazione speciale, e possono quindi essere presi in considerazione per il rilevamento sul campo. La diagnostica basata su CRISPR prevede tipicamente l'amplificazione isotermica di una sequenza bersaglio, seguita dal riconoscimento del bersaglio tramite le proteine CRISPR-Cas e la scissione collaterale di un colorante reporter fluorescente a DNA o RNA per indicare la presenza del bersaglio10,11. Nei sistemi CRISPR-Cas12a, in particolare, l'RNA CRISPR (crRNA) guida Cas12a a riconoscere e scindere i bersagli degli acidi nucleici. Questo crRNA può essere progettato per colpire una specifica regione di DNA o RNA di interesse attraverso l'ibridazione in una sequenza complementare. Una volta legato, si traduce in Cas12a che divide il bersaglio con specificità a singolo nucleotide, seguito da una scissione collaterale delle molecole reporter12. Recentemente, i sistemi CRISPR-Cas12a sono stati impiegati per rilevare vari patogeni fungini delle pianteeconomicamente importanti 13,14,15,16,17,18,19,20.
In questo protocollo, viene descritto lo sviluppo di una tecnica di rilevamento a provetta singola, che combina un'estrazione semplificata del DNA, l'amplificazione della ricombinasi polimerasi (RPA) e la tecnologia CRISPR/Cas12a (RPA-Cas12a) per la rilevazione di Foc TR4, che è stato visualizzato sia su un fluorimetro portatile che ad occhio nudo sotto un economico transilluminatore a luce blu a diodi emettitori di luce (LED)21. Il metodo può essere ulteriormente ottimizzato per il rilevamento sul campo per migliorare le strategie di prevenzione e contenimento. Un approccio simile può essere utilizzato anche per progettare saggi di rilevamento basati su Cas12a per altri patogeni delle piante.
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Protocollo
1. Estrazione semplificata del DNA da materiale vegetale
NOTA: Vedere la Figura 1 per una panoramica.
- Eseguire l'estrazione del DNA.
- Trasferire 250 mg di ciascun pezzo di pseudostelo sintomatico in una sacca di estrazione separata (vedere la Tabella dei Materiali).
- Aggiungere 2 mL di NaOH-PVP (Table of Materials) 0,5 M alle sacche con materiale vegetale. Macina i recipienti infetti in una sacca di estrazione usando un macinino manuale come un pestello.
NOTA: Aggiungere 1-2 mL di NaOH-PVP 0,5 M supplementari, se necessario, per ottenere una quantità sufficiente di estratto liquido dalla sacca. - Aggiungere 195 μL di Tris-HCL 100 mM (pH 8,0) (Tabella dei materiali) in provette da 1,5 mL.
- Pipettare 5 μL di estratto dalla sacca nella provetta da 1,5 mL con 195 μL di Tris-HCL da 100 mM (pH 8,0), diluendo l'estratto di 40 volte.
- Agitare i tubi per 15-30 s e conservarli a -20 °C fino al momento dell'uso.
2. sintesi e controllo di qualità del crRNA
- Eseguire la trascrizione.
- Utilizzando il kit di trascrizione dell'RNA (Tabella dei materiali), aggiungere quanto segue a una provetta PCR da 0,2 mL: 1,5 μL di tampone di reazione T7 10x, 1,5 μL di ciascun dNTP, 1,5 μL di miscela di DNA polimerasi T7, 1 μL di acqua priva di nucleasi e 10 μL di DNA stampo T7 da 100 μM per un volume totale di 20 μL.
- Incubare la provetta a 37 °C in un bagno d'acqua o in una macchina per PCR per almeno 4 ore.
- Utilizzare uno spettrofotometro (Tabella dei materiali) per determinare la quantità di RNA trascritto. Diluire l'RNA a 250 ng/μL (10 μg) in un volume di 40 μL utilizzando acqua priva di nucleasi o tampone TE (File supplementare 1).
NOTA: L'RNA trascritto può essere conservato a -80 °C fino a quando non si prosegue con i trattamenti con DNasi e le fasi di pulizia.
- Eseguire il trattamento con DNasi e la pulizia del crRNA.
NOTA: Eseguire tutti i passaggi a temperatura ambiente. Mantenere l'RNA e l'enzima DNasi I sul ghiaccio.- Trattare il campione di RNA con DNasi I inclusa nel kit di pulizia dell'RNA (Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore22.
- Pulire il campione di RNA utilizzando il kit di pulizia dell'RNA secondo le istruzioni del produttore, seguendo il Protocollo II22.
- Nanodrop il crRNA pulito per determinare la quantità e la qualità presenti. Diluire l'RNA a 100 ng/μL utilizzando acqua priva di nucleasi e conservare a -80 °C fino al momento dell'uso.
- Riscaldare il crRNA con il colorante di caricamento dell'RNA (Tabella dei materiali) a 70 °C per 10 minuti a bagnomaria e sottoporre il crRNA a elettroforesi su un gel di agarosio all'1,5% per visualizzare il crRNA sintetizzato (Figura 2).
3. Reazione in una provetta con amplificazione della polimerasi ricombinasi (RPA)-Cas12a per la rilevazione in vitro di Foc TR4
NOTA: Vedere la Figura 3 per una panoramica.
- Preparare le miscele di reazione RPA e Cas12a.
NOTA: Assicurarsi che questi passaggi vengano eseguiti in uno spazio privo di DNA sul ghiaccio, con i reagenti e i materiali pre-raffreddati. Pulire la superficie di lavoro e le pipette con candeggina ed etanolo al 70% prima dell'esperimento. Vedere la Tabella 1 per informazioni su tutti gli oligonucleotidi utilizzati in questo studio.- Preparare una miscela di reazione Cas12a da 20 μL in una provetta separata da 0,5 mL (Tabella dei materiali) con i seguenti volumi di reagenti: 2 μL di 10x NEBuffer r2.1 (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 100 μg/mL di albumina ricombinante, pH 7,9), 0,4 μL di proteina 10 μM LbCas12a, 0,6 μL di 100 ng/μL di crRNA, 0,4 μL di reporter da 10 μM e 16,6 μL di acqua deionizzata.
NOTA: Le concentrazioni finali della proteina LbCas12a, del crRNA e del reporter sono rispettivamente di 200 nM. - Preparare una miscela di reazione RPA da 9,5 μl in una provetta separata da 0,5 mL con i seguenti volumi di reagenti: 5 μl di 2x tampone di reazione (concentrazione finale 1x secondo le linee guida del produttore), 1,6 μl di dNTP Mix (concentrazione finale 1,6 mM), 1 μl di 10x Basic E-Mix (concentrazione finale 1x secondo le linee guida del produttore), 0,5 μl di ciascun primer RPA a 10 μM (concentrazione finale 0,5 μM ciascuno), 0,5 μl di miscela di reazione del nucleo 20x (concentrazione finale 1x secondo le linee guida del produttore) e 0,4 μl di acqua deionizzata.
- Posizionare una striscia da 8 provette in una rastrelliera per provette (Tabella dei materiali) sul ghiaccio.
- Trasferire la miscela di reazione Cas12a da 20 μl nella base della provetta.
- Trasferire la miscela di reazione RPA da 9,5 μl nel coperchio della striscia di provette. Aggiungere 0,5 μl di MgOAc da 280 nM (concentrazione finale 14 nM) alla miscela di reazione RPA nel coperchio della striscia di provette e miscelare pipettando su e giù.
- Aggiungere 0,5 μl di acqua deionizzata al coperchio della provetta NTC (Non-Template Control) e chiudere accuratamente per assicurarsi che le miscele di reazione RPA e Cas12a non siano combinate.
NOTA: è incluso un controllo NTC (Non-Template Control) per garantire l'affidabilità dei risultati.
- Preparare una miscela di reazione Cas12a da 20 μL in una provetta separata da 0,5 mL (Tabella dei materiali) con i seguenti volumi di reagenti: 2 μL di 10x NEBuffer r2.1 (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 100 μg/mL di albumina ricombinante, pH 7,9), 0,4 μL di proteina 10 μM LbCas12a, 0,6 μL di 100 ng/μL di crRNA, 0,4 μL di reporter da 10 μM e 16,6 μL di acqua deionizzata.
- Aggiungi il DNA modello e inizia la reazione.
- Aggiungere 0,5 μL di DNA stampo alla miscela di reazione RPA da 10 μL contenente MgOAc nel coperchio della striscia di provetta, ad eccezione dell'NTC, con acqua deionizzata al posto del DNA. Aggiungere sempre un controllo positivo noto di Foc TR4 DNA in un pozzetto per garantire che il test abbia funzionato come previsto. Miscelare pipettando su e giù.
- Chiudere con cautela i coperchi delle strisce di provette per assicurarsi che la reazione RPA e Cas12a non si mescolino.
- Accendere il fluorimetro portatile (Tabella dei materiali) e creare un profilo di esecuzione per il test RPA-Cas12a (File supplementare 2). Aprire il profilo di esecuzione salvato e posizionare la striscia di provette nel fluorimetro portatile per incubare per 30 minuti a 37 °C.
NOTA: Fare attenzione a non toccare il fondo dei tubi quando si maneggia la striscia di tubi; Invece, tieni i bordi esterni all'estremità superiore sinistra e destra. - Rimuovere la striscia di provette dal fluorimetro portatile dopo 30 minuti. Capovolgere le provette sei volte per mescolare le reazioni RPA e Cas12a e farle girare in una mini centrifuga (vedi Tabella dei materiali) per 5 s.
- Riposizionare la striscia di provette nel fluorimetro portatile e incubare per altri 30 minuti a 37 °C utilizzando il profilo di esecuzione salvato.
- Visualizza i risultati.
- Interpretare le unità medie di fluorescenza relativa (RFU) misurate sul fluorimetro portatile (File supplementare 2 e manuale utente23).
- Visualizzare i tubi sotto la luce blu LED a una lunghezza d'onda di eccitazione di 465 nm utilizzando un transilluminatore a luce blu (File supplementare 3). Cattura immagini con la fotocamera di un telefono.
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Risultati
La Figura 4A illustra il rilevamento riuscito di Foc TR4 da materiale vegetale infetto utilizzando l'estrazione semplificata del DNA seguita dal test combinato RPA-Cas12a quando condotto nel fluorimetro portatile Genie III. I campioni positivi mostrano una fluorescenza visibile (corsia 6-8), mentre i campioni negativi mostrano una bassa fluorescenza finale (corsia 1-5). Quando le provette del campione sono state osservate sotto la luce blu dei LED, anche i c...
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Discussione
La sorveglianza regolare è una strategia importante per un'efficace prevenzione e contenimento del Foc TR4 e di altri importanti parassiti invasivi. I protocolli di rilevamento che possono essere applicati sul campo e che identificano rapidamente e con precisione gli agenti patogeni possono accelerare il processo decisionale e limitare i costi associati alle attività di sorveglianza. A tal fine, il protocollo qui presentato ha combinato un'estrazione semplificata del DNA, condotta dirett...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari o intellettuali concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo il finanziamento della National Research Foundation of South Africa, Grant Number: 138109, nell'ambito del programma di sostegno competitivo per i ricercatori senza rating. Riconosciamo inoltre il finanziamento della borsa di studio Marie Skłodowska-Curie del programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea nell'ambito del progetto INDICANTS Grant Number: 890856.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Proteina EnGen Lba Cas12a (Cfp1) | New England Biolabs | M0653T | |
| Diluente EnGen Lba Cas12a | New England Biolabs | B0653A | |
| Tubi PCR Eppendorf | Merck | EP0030124332 | |
| Provette micro a sicurezza Eppendorf | Merck | EP0030121708 | |
| Sacchi di estrazione universali | BIOREBA | 430100 | |
| GeneRuler 100 bp Scala del DNA | Thermo Fischer Scientific | SM0241 / SM0242 | |
| Centrifuga Genie Mini-6KO | OptiGene | OP-FUGE | |
| Genie III | OptiGene | https://www.optigene.co.uk/instruments/genie-iii/ | |
| Portastriscie Genie | OptiGene | GBLOCK-01 / GBLOCK-02 / GBLOCK-03 | |
| Strisce Genie | OptiGene | OP-0008-50 / OP-0008-500 | |
| Kit di sintesi di RNA ad alta resa HiScribe T7 | New England Biolabs | E2040S | |
| NanoDrop ND-1000 Spettrofotometro UV/Vis | Thermo Fischer Scientific | https://caeonline.com/buy/spectrometers/nanodrop-nd-1000/293669253 | |
| NEBuffer 3 | New England Biolabs | B7003S | |
| NEBuffer r2.1 | New England Biolabs | B6002S | |
| Policilpirridone (PVP) in polvere | Sigma-Aldrich | 9003-39-8 | |
| Kit RNA Clean e Concentrator-5 | Zymo Research | R1013 | |
| Colorante di carico di RNA | Thermo Fischer Scientific | R0641 | |
| Trasilluminatore SmartBlue Blue Light | Strumenti Accuris | E4000-E | |
| Pellet di idrossido di sodio (NaOH) | Merck, EMPARTA | K277 | |
| Tris (idrossimetil) amminatomano | Merck | 77-86-1 | |
| Kit base liquido TwistAmp | TwistDx | TALQBAS01 |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
