Stabilimento e valutazione di un modello ovino di difetto osteocondrale a spessore completo

Summary

Qui presentiamo un protocollo integrato per generare lesioni osteocondrali controllate nelle ginocchia di pecora al fine di stabilire un modello sperimentale adatto agli studi sulla rigenerazione del tessuto osseo e cartilagine. Il protocollo delinea un metodo per indurre un difetto osteocondrale a spessore completo nel condilo femorale, utilizzando tecniche che minimizzano gli impatti sul benessere animale e la variabilità dei risultati.

Abstract

L'invecchiamento, i traumi, la predisposizione genetica e lo stile di vita influenzano la degradazione della cartilagine del corpo umano. Una volta feriti, insulti continui derivanti dalle attività quotidiane possono scatenare condizioni patologiche come l'osteoartrite, la principale causa di disabilità e perdita socioeconomica a livello mondiale. L'obiettivo principale di tutti i chirurghi ortopedici che trattano lesioni alla cartilagine articolare è stato ridurre anatomicamente l'estensione della lesione, riparare la superficie cartilaginea e ristabilire la stabilità articolare. I modelli animali sono essenziali per lo sviluppo di farmaci terapeutici, ma i modelli attuali per i difetti cartilaginei sono insoddisfacenti. Le lesioni osteocondrali nelle pecore sono un modello prezioso per testare nuove terapie e biomateriali che possono aiutare nel recupero di cartilagine e ossa negli ambienti articolari umani. Questo studio ha stabilito un protocollo efficiente per indurre difetti osteocondrali acuti negli animali di grandi dimensioni. È stata creata una lesione standardizzata in entrambi i condili femorali mediali. Un ginocchio è stato assegnato casualmente per ricevere un trattamento con gelatina-metacriloile, mentre il ginocchio controlaterale fungeva da controllo. Sei mesi dopo l'intervento, l'area del condilo femorale è stata rimossa, le articolazioni del ginocchio dissezionate sono state decalcificate, incorporate nella paraffina e tagliate in sezioni, che sono state colorate con ematossilina ed eosina. Sono stati utilizzati i punteggi per valutare la lesione. Questa metodologia consente un'osservazione macroscopica immediata dopo l'induzione dell'infortunio. Inoltre, questo modello replica efficacemente difetti clinici della cartilagine, fornendo un prezioso modello per studiare la patologia e sviluppare approcci terapeutici innovativi.

Introduction

La cartilagine è essenziale per preservare la competenza meccanica del sistema scheletrico fornendo una superficie senza attrito tra le ossa nelle articolazioni diartrodiali, prevenendo così l'erosione della superficie^{articolare 1}. La capacità della cartilagine di svolgere queste esigenti funzioni meccaniche dipende fortemente dalla composizione e dall'organizzazione uniche della sua matrice extracellulare, in particolare dal suo eccezionalmente alto contenuto d'acqua. L'acqua svolge un ruolo cruciale nella struttura e nella funzione della cartilagine articolare, rappresentando circa il 70-80% della sua composi....

Protocol

Lo studio ha ricevuto l'approvazione del Comitato Etico per la Ricerca ed è stato certificato con un Certificato di Presentazione Etica numerato 6092250823/2023. Nel presente studio, sono state selezionate nove femmine di White Suffolk di 12 mesi. Il difetto si è creato in entrambi i condili femorali mediali di ciascun animale. I difetti vuoti venivano usati come controlli. A ogni animale è stato assegnato casualmente un ginocchio per il trattamento con GelMA e l'altro come controllo. Questa strategia ci ha permesso di valutare la capacità rigenerativa naturale e ridurre l'impatto delle variazioni individuali, come i fattori genetici ....

Results

Induzione di difetto osteocondrale

Questo studio mirava a sviluppare un protocollo efficiente per indurre difetti osteocondrali acuti negli animali di grandi dimensioni. Le lesioni sono state create meccanicamente durante una procedura chirurgica, risultando in una lesione di circa 8 mm di diametro e 5 mm di profondità (Figura 1). Considerando i punteggi stabiliti dalla International Cartilag Regeneration & Joint .......

Discussion

Per superare le sfide nella terapia cartilagine, come l'inadeguatezza della differenziazione condrogenica e della maturazione ECM, gli studi non clinici rimangono essenziali per valutare le strategie terapeutiche. Metodi per modelli non clinici di tessuto cartilagineo lesionato sono stati già riportati in precedenza utilizzando varie tecniche⁴⁵. Tuttavia, la letteratura manca ancora di rapporti dettagliati e procedure standardizzate per indurre lesioni osteocondra.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Filo per suture poliglecaprone 25, n. 2-0	Ethicon		Il filo per sutura per la chiusura generale dei tessuti molli veniva utilizzato per suturare la capsula articolare e il tessuto cellulare sottocutaneo.
Anticorpi anti-β-Tubulina	Invitrogen	PA516863	Anticorpo contro la β-tubulina, due subunità (α/β) che costituiscono i microtubuli del citoscheletro
Dispositivo anestesitico	HB ospedaliere		Attrezzature per anestesia inalatoria
Axio Scan Z1	Zeiss, Monaco, Germania		Microscopio
Benzatina penicillina G	Ourofino		Antibiotici
Catetere 18 G	Solidor		Catetere endovenoso
Cefalexina	Virbac		Terapia antimicrobica
Soluzione acquosa di digluconato di clorexidina	RIOQUÍ MICA		Antisettico usato per l'ansisi cutanea
Tubo endotracheale cuffiato 7.5– 8,0 mm	Solidor		Tubo endotracheale cuffiato
DAPI	Sigma	D9542	Colorante fluorescente
Eagle Medium Modificato di Dulbecco	Gibco	12100-046	Mezzo di coltura cellulare
Solfato di diidrostreptomicina	Ourofino		Antibiotici
Valvula EDTA	Becton Dickinson	362788	Tubo di raccolta
Eosina	Neon	1795	Un colorante usato per visualizzare la morfologia cellulare, la colorazione e la colorazione; citoplasma.
Acido etilendediaminatetraacetico	Sigma	E5134	Favorisce la graduale demineralizzazione del tessuto osseo
Siero bovino fetale	Gibco	12657-029	Integratore per coltura cellulare con fattori di crescita
Formalina	Sigma-Aldrich	47608	Preservare la morfologia tissutale
GelMA Liofilizzato	TissueLabs	GLMA-LYO-1	Idrogel fotocrosscrossabile
Harris ematoxilina & nbsp;	Laborclin	620503	Un colorante usato per visualizzare la morfologia cellulare, colorando i nuclei.
Isoflurano	Cristá Lia		Mantenimento anestetico
Ketamina 10%	VETNIL		Procedura di eutanasia
Soluzione di Ringer lattata	Fresenius Kabi		Terapia fluidica
L-Glutamina 200 mM	Gibco	25030-081	Amminoacido essenziale per la coltura cellulare
Lidocaina cloridrato	Cristá Lia		Anestesia locale
Kit di vitalità/citotossicità VIVO/MORTO	Invitrogen	L3224	Kit di analisi fluorescente per valutare la vitalità cellulare
Meloxicam	Ouro fino		Antinfiammatori e analgesici per il periodo post-operatorio
Midazolam cloridrato	Cristá Lia		Farmaci preanestetici
Filo di sutura mononylon, n. 3-0	Ethicon		Sutura utilizzata per la chiusura della pelle
NaCl 0,9%	Cristalia		Soluzione salina
Neurolocalizzatore	Neurolocalizador DL 250 DeltaLife		Anestesia locale guidata da un neurolocalizzatore e da un elettrostimolatore del nervo periferico.
Drill ortopedico	Mini Trapano Ortopedico Cannulato (Delicato) - Mandrino Cromato - Marca Makita		Utilizzato per interventi ortopedici.
Martello ortopedico	Edlo	Hammer Neufield (10-3155)	Caratteristiche generali: 20 cm di lunghezza e peso 560 gr; materiale: acciaio inossidabile di alta qualità; Utilizzo: Indicato per procedure di traumatologia e ortopedia che richiedono impatto controllato. Certificazioni: i prodotti hanno certificazioni di qualità come ISO (Organizzazione Internazionale per la Normalizzazione): 13485:2016, con conformità europea e standard di buone pratiche di produzione.
Osteotomo di Lambotte	Edlo	Osteotomo di Lambotte (10-0749)	L'osteotomo di Lambotte (6 mm x 17 cm / 6 3/4") è uno strumento chirurgico ad alta precisione utilizzato principalmente in interventi ortopedici e neurochirurgiche che prevedono la manipolazione ossea. Con una punta larga 6 mm, è ideale per tagli delicati, rimodellazione e rimozione di cartilagine compatta e osso sottocondrale.
Penicillina Streptomicina	Gibco	15140-122	Antibiotico ad ampio spettro ampiamente utilizzato in coltura cellulare
Cloridrato di petidina	Cristá Lia		Farmaci preanestetici
Cloruro di potassio 19,1%	Samtec		Procedura di eutanasia
Procaina, penicillina G	Ourofino		Antibiotici
Propofol	Cristá Lia		Induzione anestetica e mantenimento
Lattato di Ringer	Cristá Lia		Terapia fluidica
Sistema respiratorio circolare semi-chiuso	HB ospedaliere		Circuito respiratorio per anestesia
Benda sterile per crepe	Cremer		Benda sterile in crepe, usata per coprire le estremità distali degli arti operati.
Stimuplex D, 22 Ga. x 2 in. (50 mm) Ago isolato con set di prolunga, 30&grad; Smusso (STIMD2250/30)	BBRAUN		Anestesia locale perineurale
Cloridrato di tramadolo	Cristá Lia		Analgesia postoperatoria
Trapano Trephine	Trapano a trefina osseo, diametro mm e ndash; modello: contra-angle, marchio: surgical WF		Trapano per la raccolta ossa con trefina 8,0 mm; prodotta in acciaio chirurgico; utilizzata in interventi di innesto osseo; serve a rimuovere il blocco osseo per analisi istologiche o autoinnesti.
Xilazina 10%	VETNIL		Procedura di eutanasia