Stabilimento e valutazione di un modello ovino di difetto osteocondrale a spessore completo

Sommario

Qui presentiamo un protocollo integrato per generare lesioni osteocondrali controllate nelle ginocchia di pecora al fine di stabilire un modello sperimentale adatto agli studi sulla rigenerazione del tessuto osseo e cartilagine. Il protocollo delinea un metodo per indurre un difetto osteocondrale a spessore completo nel condilo femorale, utilizzando tecniche che minimizzano gli impatti sul benessere animale e la variabilità dei risultati.

Abstract

L'invecchiamento, i traumi, la predisposizione genetica e lo stile di vita influenzano la degradazione della cartilagine del corpo umano. Una volta feriti, insulti continui derivanti dalle attività quotidiane possono scatenare condizioni patologiche come l'osteoartrite, la principale causa di disabilità e perdita socioeconomica a livello mondiale. L'obiettivo principale di tutti i chirurghi ortopedici che trattano lesioni alla cartilagine articolare è stato ridurre anatomicamente l'estensione della lesione, riparare la superficie cartilaginea e ristabilire la stabilità articolare. I modelli animali sono essenziali per lo sviluppo di farmaci terapeutici, ma i modelli attuali per i difetti cartilaginei sono insoddisfacenti. Le lesioni osteocondrali nelle pecore sono un modello prezioso per testare nuove terapie e biomateriali che possono aiutare nel recupero di cartilagine e ossa negli ambienti articolari umani. Questo studio ha stabilito un protocollo efficiente per indurre difetti osteocondrali acuti negli animali di grandi dimensioni. È stata creata una lesione standardizzata in entrambi i condili femorali mediali. Un ginocchio è stato assegnato casualmente per ricevere un trattamento con gelatina-metacriloile, mentre il ginocchio controlaterale fungeva da controllo. Sei mesi dopo l'intervento, l'area del condilo femorale è stata rimossa, le articolazioni del ginocchio dissezionate sono state decalcificate, incorporate nella paraffina e tagliate in sezioni, che sono state colorate con ematossilina ed eosina. Sono stati utilizzati i punteggi per valutare la lesione. Questa metodologia consente un'osservazione macroscopica immediata dopo l'induzione dell'infortunio. Inoltre, questo modello replica efficacemente difetti clinici della cartilagine, fornendo un prezioso modello per studiare la patologia e sviluppare approcci terapeutici innovativi.

Introduzione

La cartilagine è essenziale per preservare la competenza meccanica del sistema scheletrico fornendo una superficie senza attrito tra le ossa nelle articolazioni diartrodiali, prevenendo così l'erosione della superficie^{articolare 1}. La capacità della cartilagine di svolgere queste esigenti funzioni meccaniche dipende fortemente dalla composizione e dall'organizzazione uniche della sua matrice extracellulare, in particolare dal suo eccezionalmente alto contenuto d'acqua. L'acqua svolge un ruolo cruciale nella struttura e nella funzione della cartilagine articolare, rappresentando circa il 70-80% della sua composizione. L'acqua è l'elemento principale responsabile del carico durante la compressione. La capacità del tessuto di resistere alle forze di compressione dipende da come l'acqua è strutturata e limitata all'interno della matrice. Questa organizzazione è possibile grazie all'interazione dell'acqua con le principali macromolecole della cartilagine, come collagene e proteoglicani, in particolare aggregati legati all'acido^{ialuronico 1}. Questi agiscono come strutture di contenimento che ordinano e limitano il movimento dell'acqua. Questa interazione conferisce al tessuto non solo rigidità, ma anche resilienza e la capacità di recuperare dopo la deformazione. L'interazione tra acqua libera, acqua legata e matrice macromolecolare costituisce il nucleo del comportamento biomeccanico^{della cartilagine 2}.

Nonostante la sua straordinaria capacità di sostenere e distribuire carichi fisici e meccanici che raggiungono le articolazioni, una volta lesionata, la cartilagine articolare (AC) ha un potenziale limitato per la riparazione spontanea a causa della bassa attività mitotica dei condrociti e della scarsa vascolarizzazione^{tissutale 2}. Il danno articolare è solitamente associato alla perdita progressiva di molecole e proteine della matrice extracellulare (ECM), che costituiscono il 95% del tessuto e conferiscono caratteristiche biomeccaniche all'AC³. Uno squilibrio tra sintesi e degradazione dei componenti ECM, che si sposta verso processi catabolici, può portare all'osteoartrite (OA), la malattia degenerativa articolare più diffusa a livello mondiale. L'osteoartrite colpisce circa il 10-12% della popolazione adulta, causando dolore, limitando la mobilità e riducendo notevolmente l'autonomia dei^{pazienti 4}. L'osteoartrite è più diffusa nelle popolazioni anziane a causa degli insulti cumulativi all'articolazione nel corso della vita; tuttavia, vari fattori di rischio sono stati associati all'insorgenza della condizione clinica, come il genere, la predisposizione genetica, l'obesità e le abitudini^{quotidiane 4}. Fino ad ora, gli approcci terapeutici per trattare l'OA hanno consistito nella gestione clinica dei sintomi e nella sostituzione totale dell'articolazione nei casi più^{gravi 5}. Senza una strategia terapeutica robusta, riproducibile e affidabile per trattare efficacemente l'OA, vengono studiati approcci innovativi per comprendere e affrontare i problemi associati alla lesione della cartilagine articolare.

Per riparare, rigenerare e migliorare il movimento articolare nelle articolazioni artritiche, i progressi nella medicina rigenerativa sono emersi come una nuova speranza per il ripristino del danno AC ^6,7. L'uso di condrociti autologi combinato con l'impianto di ECM e l'iniezione intraarticolare di cellule staminali rappresenta lo stato dell'arte attuale in questo^{ambito 8,9,10}. La principale sfida di questi approcci è garantire un'adeguata differenziazione e sintesi funzionale della ECM da parte delle cellule impiantate. I condrociti autologi tendono a formare fibrocartilagine o a progredire in uno stato ipertrofico, creando nuovo tessuto disfunzionale che non riproduce le caratteristiche fisiologiche dell'AC, portando a un recupero incompleto e spesso a un deterioramento^{tardivo 11}. I biomateriali possono essere utilizzati per guidare il comportamento cellulare durante la rigenerazione dei tessuti, fornendo un impalcatura temporanea per le cellule per aderire e sintetizzare nuove matrice extracellulari naturali e^funzionali 12,13,14. Il biomateriale ideale per l'ingegneria della cartilagine deve garantire una forte integrazione con i tessuti circostanti, in particolare con l'osso sottocondrale, poiché il fallimento di questa interfaccia compromette la riparazione a lungo termine. Tuttavia, il legame debole tra gli strati cartilagine e ossei degli impalcature osteocondrali e la scarsa integrazione con il tessuto ospite restano sfide^{importanti 15}. Sebbene gli impalcature tentino di imitare l'architettura osteocondrale nativa, riprodurre la complessa microstruttura dell'interfaccia è ancora difficile. Ciò rafforza l'importanza della ricerca e dello sviluppo di impalcature con proprietà biologiche che possano contemporaneamente sostenere la rigenerazione di cartilagine e ossa mantenendo la stabilità dell'interfaccia¹⁶. La gelatina, derivata dal collagene—un componente chiave del tessuto cartilagine—possiede proprietà come motivi di legame cellulare e biodegradabilità, suggerendo il suo potenziale come biomateriale di supporto se combinata con fattori rigenerativi per il trattamento delle lesioni osteocondrali. Quando modificata chimicamente con anidride metacrilica per formare gelatina metacriloilile (GelMA), diventa foto-reticolabile, permettendo l'iniezione e la fotopolimerizzazione in situ, che migliora la stabilità meccanica per applicazioni in medicina^{rigenerativa 17}.

Le lesioni osteocondrali hanno una capacità rigenerativa limitata, il che rappresenta una sfida clinica. Le indagini precliniche che impiegano modelli animali di grandi dimensioni di lesioni articolari del ginocchio sono essenziali per la ricerca traslazionale perché permettono una valutazione sistematica delle variabili che influenzano i meccanismi della malattia e gli esiti terapeutici. Le specie comunemente utilizzate includono maiali, capre, cani, cavalli e pecore, ognuna con vantaggi e limitazioni specifiche che devono essere considerate nella progettazione sperimentale. Inoltre, tutte queste specie mostrano una riparazione endogena limitata di difetti condrali e osteocondrali, come osservato negli esseri^{umani 18}. Per garantire che questi modelli siano predittivi degli esiti umani, devono riprodurre parametri rilevanti come anatomia, fisiologia e proprietà^{biomeccaniche 18}. Per confronto, lo spessore della cartilagine articolare umana nei condili femorali varia da 1,8 a 2^{mm 19}, e il diametro delle lesioni cartilaginei che tipicamente richiedono trattamento è di 10 mm o^{superiore a 20}.

Il modello suino offre vantaggi per studi sulla cartilagine e sulla rigenerazione osteocondrale, poiché la dimensione delle articolazioni, lo spessore della cartilagine e le esigenze di carico di carico somigliano molto a quelle osservate negli esseri^{umani 18}. Alcune razze di maiali miniatura, come il minipig di Göttingen, sono facili da maneggiare e raggiungono la maturità scheletrica tra i 18 e i 22 mesi di²¹ anni. Lo spessore della cartilagine varia da 1 a 2 mm, e difetti di 6 a 8 mm possono essere creati^{a 18} mm. Le caratteristiche ossee, tra cui lo spessore trabecolare, il tasso di apposizione ossea e l'organizzazione delle fibre di collagene, sono comparabili a quelle degli esseri^umani. Tuttavia, anche il modello suino presenta delle limitazioni: anche nelle razze in miniatura, l'articolazione del ginocchio (stifle) è più piccola rispetto agli esseri umani, limitando la creazione di difetti sperimentali di grandi dimensioni. Inoltre, la maggior parte degli studi utilizza animali scheletricamente immaturi a causa dei costi di manutenzione associati, che potrebbero sopravvalutare il potenziale di^{riparazione 23}.

Le capre presentano anatomia articolare, biomeccanica e spessore di cartilagine simili a quelle degli esseri^{umani 24}. Non richiedono strutture specializzate, sono facili da maneggiare e sono relativamente^{economiche 25}. Lo spessore della cartilagine delle capre varia da 0,8 a 2,0 mm, e la dimensione del difetto critico più segnalata è di 6^{mm 26}. Tuttavia, esiste una significativa variazione nello spessore della cartilagine tra razze, dimensioni e sessi, il che può portare a risultati^{incoerenti 27}. Il rapporto cartilagine-sottocondrale e la struttura ossea trabecolare sono anch'essi comparabili a quelli^{umani 28}. La maturità scheletrica avviene relativamente tardi, tra i 24 e i 36 mesi di²⁹ anni. Dal punto di vista biomeccanico, il ginocchio della capra subisce pressioni articolari e carichi ciclici simili a quelli degli esseri^{umani 25}, anche se la flessione del ginocchio durante l'andatura è maggiore (50°-70° nelle capre contro <30° negli esseri umani), risultando in aree di contatto^{distinte 30}. Questa differenza, unita a pressioni di picco più elevate, può contribuire a una riparazione della cartilagine^{meno efficiente 30}.

Tra i modelli animali di grandi dimensioni, i cani si distinguono per la loro capacità di tollerare regimi di riabilitazione, immobilizzazione articolare e addestramento al camminamento sul tapis roulant, al nuoto e agli esercizi controllati con carico¹⁸. Lo spessore della cartilagine articolare varia da 0,9 a 1,3 mm, e la dimensione critica del difetto è di circa 4 mm, limitando il confronto diretto con il modello^{umano 25}. La maturità scheletrica avviene tra gli 8,5 e i 13,7 mesi di³¹ anni. Anatomicamente, il ginocchio canino differisce da quello umano, e variazioni nella biomeccanica, nei modelli di carico e nella maturità tra razze complicano l'estrapolazione dei^{risultati 32}. Nonostante queste differenze anatomiche e la piccola dimensione dei difetti, il modello canino rimane prezioso per studi che includono protocolli di riabilitazione o patologie spontanee della cartilagine simili a quelle negli esseri umani. Tuttavia, il suo uso sperimentale è limitato da considerazioni^{etiche 29}.

Il modello equino è il più grande modello animale disponibile per la ricerca sulla riparazione della cartilagine e sviluppa naturalmente lesioni condrali e osteoartrite legate all'età o al trauma simili a quelle negli esseri^{umani 33}. I cavalli presentano caratteristiche anatomiche e biomeccaniche paragonabili a quelle umane, come un'articolazione del ginocchio eretta, grandi dimensioni articolari, spessore della cartilagine tra 2 e 3 mm più vicino alla cartilagine umana - estensione completa del ginocchio durante l'andatura e densità minerale ossea^{comparabile 34}. La maturità scheletrica si verifica tra i 24 e i 48 mesi, e le dimensioni dei difetti comunemente studiate variano da 6 a 20 mm^32,33. Le limitazioni includono l'elevato carico verticale sull'articolazione dello soffocamento equino durante la locomozione, che espone gli impianti a forze maggiori rispetto agli esseri umani e ostacola la guarigione a lungo^{termine 35}. Inoltre, i costi di acquisizione e manutenzione sono elevati e sono necessarie strutture^{specializzate 36}.

Le pecore sono ampiamente utilizzate come modello negli studi di riparazione della cartilagine grazie alla loro disponibilità, temperamento docile, buona tolleranza alla chirurgia articolare e facilità di^{maneggiamento 37}. La maturità scheletrica nelle pecore si raggiunge tipicamente intorno ai 2-3 anni di²⁵ anni. Inoltre, il ginocchio ovino mostra somiglianze anatomiche e biomeccaniche con l'articolazione umana^{del ginocchio 38}. Lo spessore della cartilagine nel condilo femorale mediale varia da 0,7 a 1,7 mm, e la densità minerale ossea e le pressioni di contatto sono anch'esse comparabili, anche se la frazione di volume osseo è maggiore nella^{pecora 39}. A causa dello spessore ridotto della cartilagine, i difetti indotti spesso si estendono all'osso sottocondrale, rendendo questo modello più adatto agli studi sui difetti^{osteocondrali 32}. Lesioni di diametro da 6 a 8 mm si formano tipicamente in luoghi come i condili femorali e il^{trocleo 32}. Inoltre, il modello ovino offre vantaggi per studi bilaterali, permettendo il confronto tra siti trattati e di controllo all'interno dello stesso animale, riducendo così la variabilità legata all'ospite, migliorando la consistenza e la riproducibilità, e minimizzando il numero di animali necessari^{a 40}. Ogni modello presenta diversi gradi di somiglianza con la fisiologia e la biomeccanica umane. Pertanto, la selezione del modello dovrebbe bilanciare rilevanza biologica, fattibilità pratica e considerazioni etiche. Nel presente studio sono state incluse pecore femmine nullipare di 12 mesi, valutate durante il periodo stagionale dell'anestro.

Questo studio mirava a progettare un protocollo efficace per generare difetti osteocondrali acuti negli animali di grandi dimensioni. Il protocollo prevede la creazione di una lesione osteocondrale a spessore completo per stabilire un modello adatto agli studi di medicina rigenerativa. Inoltre, l'applicazione dell'idrogel GelMA viene esplorata come guida per la guarigione dei tessuti e come metodo prospettico per la consegna di molecole e cellule rigenerative. Il protocollo delinea la procedura chirurgica per creare lesioni osteocondrali nella cartilagine articolare del ginocchio della pecora. È adattabile a varie applicazioni di ingegneria tissutale, inclusa l'induzione di lesioni simili in altri modelli animali di grandi dimensioni per la medicina rigenerativa.

Protocollo

Lo studio ha ricevuto l'approvazione del Comitato Etico per la Ricerca ed è stato certificato con un Certificato di Presentazione Etica numerato 6092250823/2023. Nel presente studio, sono state selezionate nove femmine di White Suffolk di 12 mesi. Il difetto si è creato in entrambi i condili femorali mediali di ciascun animale. I difetti vuoti venivano usati come controlli. A ogni animale è stato assegnato casualmente un ginocchio per il trattamento con GelMA e l'altro come controllo. Questa strategia ci ha permesso di valutare la capacità rigenerativa naturale e ridurre l'impatto delle variazioni individuali, come i fattori genetici e la maturità scheletrica. Gli animali sono stati seguiti per 6 mesi per valutare la formazione della cartilagine ialina.

1. Procedura anestetica

1. Privare gli animali di cibo e acqua per circa 24 ore prima dell'intervento.
2. Premedicare gli animali con meperidina intramuscolare 4 mg/kg combinata con midazolam 0,3 mg/kg.
3. Riempi il vaporizzatore anestetico un giorno prima dell'uso, con la stanza vuota, e indossa guanti protettivi per ridurre al minimo il rischio di esposizione professionale.
4. Controlla il circuito anestetico per eventuali perdite prima di ogni procedura ed esegui tutte le manipolazioni in un'area ben ventilata, seguendo le linee guida istituzionali per la biosicurezza.
5. Dopo 15 minuti, cannulare gli animali con un catetere da 18 g e somministrare la soluzione di Ringer lattata a una dose di 10 mL^∙kg-1∙^h-1.
6. Somministrare anestesia endovenosa usando propofol all'1% a una dose di 4 mg/kg.
7. Intubare gli animali con un tubo endotracheale cuffiato da 7,5-8,0 mm e mantenerli sotto ventilazione spontanea utilizzando un sistema respiratorio circolare semi-chiuso che fornisce ossigeno a un FiO₂ di 1,0 e una portata di 50 mL/kg.
8. Utilizzare la tecnica di anestesia parziale per via endovenosa (PIVA), mantenere il propofol come infusione continua a 0,1 mg∙^{kg-1 min-1}, e regolare solo la concentrazione di isoflurano per ottenere un piano chirurgico di anestesia adeguato. Monitorare la profondità anestetica durante tutta la procedura.
9. Eseguire blocchi perineurali dei nervi femorali e sciatici, guidati da un neurolocalizzante. Somministrare 0,2 mL/kg di lidocaina al 2% per ogni blocco.
   NOTA: L'intervento dovrebbe iniziare solo una volta confermata l'anestesia chirurgica dell'animale (nessuna risposta a un pizzicamento forte degli zoccoli e assenza di tono mascellare).

2. Intervento chirurgico in vivo

1. Disinfettare il ginocchio rasato usando gluconato di clorexidina antisettico topico e posizionare l'animale in posizione di decubito dorsale nella sala operatoria.
2. Individua la cavità articolare toccando il ginocchio dell'animale per determinare il sito preciso dell'incisione. Effettuare un'incisione cutanea doppiamente curva (iniziando distale rispetto all'epicondilo femorale laterale e terminando medialmente al livello della tuberosità tibiale).
3. Identificare il tendine rotulare, la rotula, il legamento rotulano e la porzione mediale della capsula articolare. Incisci la capsula per esporre il condilo femorale mediale. Iperflessi il ginocchio per visualizzare la regione più distale della cartilagine articolare del condilo.
4. Effettuare un'incisione chirurgica di circa 3-5 cm nella regione del condilo dell'animale. Rimuovere gli strati di tessuto sottostanti alla pelle per accedere al condilo e mantenere pulita l'area dell'incisione per prevenire contaminazioni.
5. Raccogli il liquido sinoviale usando una siringa e un ago. Trasferire parte del campione in un tubo EDTA per l'analisi e utilizzare il materiale rimanente per preparare le vetri di smear.
6. Posiziona i retrattori per esporre completamente la superficie condilare. Più il condilo è esposto, più sarà facile indurre una lesione nella fase successiva.
   NOTA: In questo momento, fai attenzione alla zampa dell'animale. La flessione o l'estensione del ginocchio può aiutare a esporre il condilo.
7. Forare un difetto di 8 mm di diametro e 5 mm di profondità al centro del condilo femorale mediale utilizzando un trapano ortopedico dotato di una punta tradinica da 8 mm, assicurando un corretto allineamento per evitare dimensioni o forme indesiderate, e mantenendo un angolo di 0° rispetto alla regione più distale della cartilagine articolare.
   NOTA: Eseguire la trepanazione alla velocità più bassa possibile, azionando delicatamente il controllo del trapano e utilizzando solo la rotazione necessaria per tagliare cartilagine e osso sottocondrale, eseguendo anche raffreddamento locale con lo 0,9% di NaCl a temperatura ambiente, anche a bassa velocità.
8. Esegui l'estrazione chirurgica del tappo osteocondrale utilizzando il martello ortopedico e l'osteotomo.
9. Pulisci l'estensione della ferita con garze sterili, assicurandoti che l'interno della lesione sia libero da sangue e detriti di tessuto.
10. Applicare 200 μL della formulazione liquida GelMA al 20% (v/v), contenente 0,25% (p/v) fenil-2,4,6-trimetilbenzilfosfinato (LAP), all'interno della lesione fino a raggiungere la superficie.
11. Incrocia il GelMA idrogel sotto un LED da 395-405 nm (potenza totale di 9 W) posizionato a circa 5 cm dal campione per 180 secondi. In queste condizioni, l'irradianza stimata in superficie è di ~10 mW/cm², con un totale di energia di esposizione di circa 1,8 J/cm².
    NOTA: Usa occhiali protettivi quando usi la luce ultravioletta.
12. Rimuovi con attenzione i retrattori.
13. Chiudi la lesione con suture indipendenti nei diversi strati tissutali per prevenire la formazione del seroma. Il numero di punti necessari dipenderà dall'estensione dell'incisione chirurgica.
14. Applica una benda sterile sui punti per prevenire infezioni.

3. Cure post-operatorie

1. Monitorare gli animali durante il recupero anestetico, includendo segni vitali come frequenza cardiaca (70-90 battiti/minuto), frequenza respiratoria (12-20 respiri/minuto), temperatura corporea (39 °C a 40,5 °C) e mucose normali con un tempo di ricarica capillare di 1-2 secondi. Palpare regolarmente le arterie facciale e femorale per verificare se il polso è facilmente percepibile.
   NOTA: Il recupero anestetico dovrebbe avvenire in un ambiente tranquillo, pulito, caldo e imbottito, con illuminazione minima e bassi livelli di rumore.
2. Eseguire medicazioni chirurgiche utilizzando penicillina topica (benzatinica penicillina G: 1.250.000 UI; procaina penicillina G: 1.250.000 UI; diidrostreptomicina solfato: 1,25 g; urea: 2,50 g), una volta al giorno per 10 giorni.
3. Assicurati che gli animali rimangano in posizione quadrupede subito dopo il risveglio dall'anestesia, appoggia peso sull'arto operato e non mostri segni di disagio.
4. L'analgesia postoperatoria consisteva in meloxicam (0,4 mg/kg ogni 24 ore) e tramadolo (2 mg/kg ogni 12 ore) per 5 giorni. Una dose aggiuntiva di tramadolo è stata somministrata quando sono state identificate espressioni facciali legate al dolore utilizzando la Sheep Grimace^{Scale 41}, uno strumento validato basato su specifiche unità di azione facciale (inclusi irrigidimenti orbitali, risposta di Flehmen, posizione dell'orecchio e posizione della testa) per valutare il dolore e il disagio post-operatorio nelle pecore.

4. Analisi istologica

1. Sei mesi dopo l'intervento, esegui l'eutanasia. Per ottenere una sedazione profonda prima della somministrazione dell'agente eutanasico, pre-medicare gli animali per via endovenosa con ketamina (10 mg/kg) e xilazina (1 mg/kg), utilizzando dosi intenzionalmente superiori a quelle tipicamente raccomandate per le procedure cliniche, per garantire un rapido avviso di sedazione profonda, come supportato dai protocolli accettati per l'eutanasia. Successivamente, somministrare propofol per indurre un coma anestetico. Successivamente, somministrare cloruro di potassio a 2 mEq/kg IV fino a quando non si verifica l'arresto respiratorio e cardiovascolare e l'assenza di tutti i riflessi protettivi.
2. Sezione dell'epifisi femorale distale per rimuovere l'area dei condili. Fissare le articolazioni del ginocchio dissezionate con formalina tamponata neutra al 10% e decalcificare in EDTA al 5% (acido etilendediaminetetraacetico) a 34 °C, cambiando la soluzione EDTA ogni 3 giorni.
3. Immergere il materiale nella paraffina e tagliarlo in sezioni da 4 μm. Rimuovi la paraffina dai vetri immergendoli in xilene a 65 °C per 3 x 5 minuti. Idratare con 10-20 immersioni in etanolo (99%, 95%, 70%), seguita da acqua deionizzata per 5 minuti^{e 42}.
4. Per la colorazione di ematossilina ed eosina (H&E), colorare le sezioni con ematossilina Harris e controcolorare con eosina, scansionare a ingrandimento del 20× utilizzando un microscopio automatico a scansione di vetri, e analizzare utilizzando il software collegato.
5. Valutare la lesione secondo^l'iniziativa di istopatologia 43 della Osteoarthritis Research Society International (OARSI): un punteggio di 0 indica cartilagine normale; un punteggio di 1 riflette fibrillazione superficiale senza perdita di cartilagine; un punteggio di 2 corrisponde a fessure verticali che raggiungono lo strato immediatamente sotto la zona superficiale, accompagnate da una perdita parziale della lama superficiale; un punteggio di 3 indica fessure verticali o erosione che si estendono nella cartilagine calcificata e colpiscono meno del 25% della superficie articolare; I punteggi di 4, 5 e 6 rappresentano fessure verticali o erosione che raggiungono la cartilagine calcificata e coinvolgono rispettivamente il 25-50%, il 50-75% e più del 75% della superficie articolare.
   NOTA: Per questo studio, alle lesioni con fessure verticali o erosioni che si estendono nella cartilagine calcificata e che coinvolgono più del 25% della superficie articolare è stata assegnata con un punteggio di 4.

Risultati

Induzione di difetto osteocondrale

Questo studio mirava a sviluppare un protocollo efficiente per indurre difetti osteocondrali acuti negli animali di grandi dimensioni. Le lesioni sono state create meccanicamente durante una procedura chirurgica, risultando in una lesione di circa 8 mm di diametro e 5 mm di profondità (Figura 1). Considerando i punteggi stabiliti dalla International Cartilag Regeneration & Joint ...

Discussione

Per superare le sfide nella terapia cartilagine, come l'inadeguatezza della differenziazione condrogenica e della maturazione ECM, gli studi non clinici rimangono essenziali per valutare le strategie terapeutiche. Metodi per modelli non clinici di tessuto cartilagineo lesionato sono stati già riportati in precedenza utilizzando varie tecniche⁴⁵. Tuttavia, la letteratura manca ancora di rapporti dettagliati e procedure standardizzate per indurre lesioni osteocondra...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Filo per suture poliglecaprone 25, n. 2-0	Ethicon		Il filo per sutura per la chiusura generale dei tessuti molli veniva utilizzato per suturare la capsula articolare e il tessuto cellulare sottocutaneo.
Anticorpi anti-β-Tubulina	Invitrogen	PA516863	Anticorpo contro la β-tubulina, due subunità (α/β) che costituiscono i microtubuli del citoscheletro
Dispositivo anestesitico	HB ospedaliere		Attrezzature per anestesia inalatoria
Axio Scan Z1	Zeiss, Monaco, Germania		Microscopio
Benzatina penicillina G	Ourofino		Antibiotici
Catetere 18 G	Solidor		Catetere endovenoso
Cefalexina	Virbac		Terapia antimicrobica
Soluzione acquosa di digluconato di clorexidina	RIOQUÍ MICA		Antisettico usato per l'ansisi cutanea
Tubo endotracheale cuffiato 7.5– 8,0 mm	Solidor		Tubo endotracheale cuffiato
DAPI	Sigma	D9542	Colorante fluorescente
Eagle Medium Modificato di Dulbecco	Gibco	12100-046	Mezzo di coltura cellulare
Solfato di diidrostreptomicina	Ourofino		Antibiotici
Valvula EDTA	Becton Dickinson	362788	Tubo di raccolta
Eosina	Neon	1795	Un colorante usato per visualizzare la morfologia cellulare, la colorazione e la colorazione; citoplasma.
Acido etilendediaminatetraacetico	Sigma	E5134	Favorisce la graduale demineralizzazione del tessuto osseo
Siero bovino fetale	Gibco	12657-029	Integratore per coltura cellulare con fattori di crescita
Formalina	Sigma-Aldrich	47608	Preservare la morfologia tissutale
GelMA Liofilizzato	TissueLabs	GLMA-LYO-1	Idrogel fotocrosscrossabile
Harris ematoxilina & nbsp;	Laborclin	620503	Un colorante usato per visualizzare la morfologia cellulare, colorando i nuclei.
Isoflurano	Cristá Lia		Mantenimento anestetico
Ketamina 10%	VETNIL		Procedura di eutanasia
Soluzione di Ringer lattata	Fresenius Kabi		Terapia fluidica
L-Glutamina 200 mM	Gibco	25030-081	Amminoacido essenziale per la coltura cellulare
Lidocaina cloridrato	Cristá Lia		Anestesia locale
Kit di vitalità/citotossicità VIVO/MORTO	Invitrogen	L3224	Kit di analisi fluorescente per valutare la vitalità cellulare
Meloxicam	Ouro fino		Antinfiammatori e analgesici per il periodo post-operatorio
Midazolam cloridrato	Cristá Lia		Farmaci preanestetici
Filo di sutura mononylon, n. 3-0	Ethicon		Sutura utilizzata per la chiusura della pelle
NaCl 0,9%	Cristalia		Soluzione salina
Neurolocalizzatore	Neurolocalizador DL 250 DeltaLife		Anestesia locale guidata da un neurolocalizzatore e da un elettrostimolatore del nervo periferico.
Drill ortopedico	Mini Trapano Ortopedico Cannulato (Delicato) - Mandrino Cromato - Marca Makita		Utilizzato per interventi ortopedici.
Martello ortopedico	Edlo	Hammer Neufield (10-3155)	Caratteristiche generali: 20 cm di lunghezza e peso 560 gr; materiale: acciaio inossidabile di alta qualità; Utilizzo: Indicato per procedure di traumatologia e ortopedia che richiedono impatto controllato. Certificazioni: i prodotti hanno certificazioni di qualità come ISO (Organizzazione Internazionale per la Normalizzazione): 13485:2016, con conformità europea e standard di buone pratiche di produzione.
Osteotomo di Lambotte	Edlo	Osteotomo di Lambotte (10-0749)	L'osteotomo di Lambotte (6 mm x 17 cm / 6 3/4") è uno strumento chirurgico ad alta precisione utilizzato principalmente in interventi ortopedici e neurochirurgiche che prevedono la manipolazione ossea. Con una punta larga 6 mm, è ideale per tagli delicati, rimodellazione e rimozione di cartilagine compatta e osso sottocondrale.
Penicillina Streptomicina	Gibco	15140-122	Antibiotico ad ampio spettro ampiamente utilizzato in coltura cellulare
Cloridrato di petidina	Cristá Lia		Farmaci preanestetici
Cloruro di potassio 19,1%	Samtec		Procedura di eutanasia
Procaina, penicillina G	Ourofino		Antibiotici
Propofol	Cristá Lia		Induzione anestetica e mantenimento
Lattato di Ringer	Cristá Lia		Terapia fluidica
Sistema respiratorio circolare semi-chiuso	HB ospedaliere		Circuito respiratorio per anestesia
Benda sterile per crepe	Cremer		Benda sterile in crepe, usata per coprire le estremità distali degli arti operati.
Stimuplex D, 22 Ga. x 2 in. (50 mm) Ago isolato con set di prolunga, 30&grad; Smusso (STIMD2250/30)	BBRAUN		Anestesia locale perineurale
Cloridrato di tramadolo	Cristá Lia		Analgesia postoperatoria
Trapano Trephine	Trapano a trefina osseo, diametro mm e ndash; modello: contra-angle, marchio: surgical WF		Trapano per la raccolta ossa con trefina 8,0 mm; prodotta in acciaio chirurgico; utilizzata in interventi di innesto osseo; serve a rimuovere il blocco osseo per analisi istologiche o autoinnesti.
Xilazina 10%	VETNIL		Procedura di eutanasia