Normalizzazione basata su MTT del rilascio di glicerolo per una quantificazione accurata della lipolisi negli adipociti primari dell'epididimo di ratto

Summary

Gli artefatti sperimentali, tra cui le fluttuazioni della vitalità cellulare e l'interferenza del saggio, ostacolano la quantificazione accurata del rilascio di glicerolo negli adipociti primari ricchi di lipidi. Per mitigare queste sfide, viene utilizzata una strategia di normalizzazione basata su MTT per regolare le misurazioni del glicerolo per l'attività metabolica cellulare, migliorando così l'affidabilità della quantificazione della lipolisi.

Abstract

La lipolisi, una via metabolica critica, comporta l'idrolisi dei trigliceridi immagazzinati in acidi grassi liberi e glicerolo. Tuttavia, la quantificazione accurata dell'output di glicerolo negli adipociti primari ricchi di lipidi è spesso confusa da artefatti sperimentali, come la variabilità nella vitalità cellulare e l'interferenza del saggio. Per ovviare a queste limitazioni, è stato messo a punto un metodo semplice per normalizzare le misurazioni del rilascio di glicerolo utilizzando il saggio di vitalità cellulare basato sul 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT). Questo protocollo sfrutta la differenza di peso specifico tra adipociti e soluzioni acquose, consentendo la quantificazione simultanea dell'output lipolitico e della vitalità cellulare. Negli esperimenti di screening farmacologico, la pravastatina e la simvastatina hanno migliorato significativamente il rilascio di glicerolo dagli adipociti addominali, mentre l'atorvastatina e la lovastatina non hanno alterato significativamente l'output di glicerolo. Questi risultati suggeriscono che la normalizzazione basata su MTT offre un approccio robusto e conveniente per quantificare accuratamente la lipolisi, con potenziali applicazioni nella scoperta di farmaci mirati all'obesità e alla sindrome metabolica. Questo studio sottolinea la necessità di rivalutare i test di lipolisi convenzionali per distinguere le risposte metaboliche autentiche dalla perdita di membrana aspecifica.

Introduction

Il tessuto adiposo può essere suddiviso in tessuto adiposo bianco (WAT) e tessuto adiposo bruno (BAT)¹. Il WAT svolge la funzione di immagazzinamento dell'energia in eccesso sotto forma di trigliceridi, mentre il BAT ha la funzione di generare calore per mantenere la temperatura corporea, che converte l'energia chimica in energia termica sotto la stimolazione del freddo¹. Il tessuto adiposo ha anche funzione endocrina². Può secernere una varietà di ormoni, citochine e metaboliti (collettivamente indicati come adipochine) e controllare l'equilibrio energetico del corpo regolando il comportamento di ricerca del cibo dal sistema nervoso centrale e l'attività metabolica dei tessuti circostanti².

La lipolisi è un processo di idrolisi graduale dei lipidi intracellulari sotto l'azione di una serie di enzimi lipolitici ^3,4. Negli adipociti, i lipidi sono immagazzinati principalmente in goccioline lipidiche sotto forma di trigliceridi⁵. Le goccioline lipidiche sono ricoperte dalla proteina associata alle goccioline lipidiche della famiglia delle perilipine, che impedisce l'idrolisi dei trigliceridi da parte degli enzimi lipolitici ^6,7. Tuttavia, quando il segnale della lipolisi è potenziato, i livelli di espressione della famiglia delle perilipine negli adipociti diminuiscono e gli enzimi lipolitici entrano nelle goccioline lipidiche ^3,4. Di conseguenza, i trigliceridi vengono decomposti in glicerolo e acidi grassi liberi ^3,4,5.

La lipolisi, la scomposizione dei trigliceridi immagazzinati in glicerolo e acidi grassi liberi, è un processo fondamentale nel metabolismo degli adipociti⁸. Mentre la misurazione diretta dei prodotti della lipolisi come il glicerolo fornisce informazioni preziose, una quantificazione accurata è stata impegnativa, in particolare negli adipociti primari sospesi a causa di errori operativi derivanti dalle differenze nel numero di cellule tra i gruppi sperimentali. Questo studio mirava ad affrontare questa sfida impiegando un saggio di vitalità cellulare per normalizzare la quantificazione del rilascio di glicerolo dagli adipociti addominali primari di ratto. Standardizzando il metodo di misurazione, il saggio di rilascio normalizzato di glicerolo è stato applicato come potenziale strumento per la scoperta di farmaci mirati all'obesità e alla sindrome metabolica negli adipociti.

Protocol

Questo protocollo sfrutta la differenza di peso specifico tra adipociti e soluzioni acquose per consentire la misurazione simultanea del rilascio di glicerolo (come indicatore di lipolisi) e della vitalità cellulare 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) negli stessi pozzetti di una piastra a 96 pozzetti, semplificando così il flusso di lavoro sperimentale e migliorando l'efficienza.

Tutte le procedure sugli animali sono state conformi alle linee guida ARRIVE e sono state condotte in conformità con la Guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (NIH Publication No. 8023, rivista nel 1978). Il protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (numero di approvazione 202112, approvato il 5 maggio 2021). I ratti maschi Wistar utilizzati in questo studio avevano almeno 8 settimane di età con un peso corporeo di ≥200 g in condizioni di stabulazione standard. Il tessuto adiposo bianco dell'epididimo è stato raccolto con rese tipiche di 0,6-0,8 g per ratto. In particolare, i ratti più anziani o quelli alimentati con diete ricche di grassi hanno mostrato un aumento significativo della massa del tessuto adiposo bianco (spesso 1,5-3 g), richiedendo un aggiustamento proporzionale delle concentrazioni degli enzimi di digestione (ad esempio, collagenasi) per mantenere costante l'efficienza della dissociazione tissutale. L'uso esclusivo di ratti maschi ha evitato potenziali effetti confondenti dovuti alle fluttuazioni ormonali del ciclo estrale femminile. La selezione dei ceppi (ad esempio, Sprague-Dawley, Wistar o Long-Evans) è stata mantenuta in modo coerente all'interno degli esperimenti per garantire l'uniformità genetica nelle risposte del tessuto adiposo. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Isolamento degli adipociti addominali primari di ratto

1. Anestetizzare un ratto Wistar adulto maschio con un'iniezione intraperitoneale di idrato di cloralio al 7% (disciolto in H₂O distillato) (seguendo protocolli istituzionalmente approvati).
2. Confermare l'anestesia completa verificando l'assenza di risposte riflesse, quindi praticare un'incisione addominale sulla linea mediana utilizzando forbici chirurgiche sterili.
3. Rimuovere con cura il tessuto adiposo viscerale dai lati sinistro e destro del cuscinetto adiposo dell'epididimo.
   NOTA: Gli adipociti dell'epididimo sono relativamente grandi e galleggianti, il che facilita la separazione e l'analisi.
4. Trasferire il tessuto raccolto in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; Figura 1A).
5. Lavare il fazzoletto due volte con PBS per rimuovere le impurità, compresi i vasi sanguigni aderenti e i coaguli di sangue.
6. Taglia il fazzoletto lavato in piccoli pezzi.

2. Purificazione degli adipociti addominali primari di ratto

1. Incubare il tessuto adiposo sezionato con tripsina e collagenasi di tipo II (10 mg in 10 mL di soluzione di tripsina) a 37 °C per 2 ore sotto agitazione.
2. Filtrare il tessuto adiposo digerito attraverso un colino cellulare (Figura 1A).
3. Centrifugare il filtrato a 120 × g per 3 minuti a temperatura ambiente per rimuovere l'attività enzimatica residua.
4. Trasferire gli adipociti sospesi (lo strato bianco superiore) in una provetta pulita e lavarli con PBS.
5. Centrifugare il filtrato a 120 × g per 3 minuti a temperatura ambiente per rimuovere il PBS.
6. Incubare gli adipociti filtrati (lo strato bianco superiore) nel terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e una soluzione di penicillina-streptomicina all'1% per non più di 30 minuti.

3. Analisi del rilascio di glicerolo

1. Seminare gli adipociti filtrati (10^{4-10 5} cellule per pozzetto; 200 μL) in una piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti.
   NOTA: Gli adipociti sono stati quantificati utilizzando un emocitometro standard. A causa della grande variazione delle dimensioni degli adipociti, alcune cellule più grandi non potevano essere contate con precisione. Pertanto, la conta cellulare potrebbe non riflettere esattamente il numero effettivo di adipociti. L'obiettivo principale era quello di ottenere una distribuzione uniforme delle cellule tra i pozzetti piuttosto che una quantificazione esatta.
2. Trattare gli adipociti con dimetilsolfossido allo 0,05% (DMSO; come gruppo di controllo) e 50 μM di atorvastatina, pravastatina, lovastatina e simvastatina per 4 ore a 37 °C agitando delicatamente.
   NOTA: Queste condizioni di trattamento sono fornite come riferimento e possono essere modificate secondo necessità in base agli obiettivi specifici e al disegno dell'esperimento.
3. Raccogliere il terreno di coltura cellulare (lo strato rosso inferiore) per analizzare il rilascio di glicerolo, che indica l'inizio della lipolisi (Figura 1B).
4. Utilizzare un kit commerciale per il dosaggio del rilascio di glicerolo per valutare la lipolisi degli adipociti in risposta a diversi trattamenti.
5. Misurare l'assorbanza a 570 nm utilizzando un lettore di micropiastre.

4. Analisi della vitalità cellulare

1. Sciogliere la polvere di MTT a una concentrazione di 5 mg/mL in H₂O distillato e sterilizzare attraverso un filtro da 0,22 μm prima dell'uso.
2. Dopo l'analisi del rilascio di glicerolo, aggiungere la soluzione MTT (fino a 0,5 mg/mL) finale alle cellule e incubare a 37 °C per 2 ore.
3. Trasferire gli adipociti sospesi (lo strato viola superiore) in una provetta pulita contenente DMSO per l'analisi della vitalità cellulare (Figura 1B).
4. Vortice brevemente per solubilizzare i cristalli di formazan viola formati.
5. Misurare l'assorbanza a 570 nm utilizzando un lettore di micropiastre.

5. Calcolo della normalizzazione

1. Condurre tutti gli esperimenti in triplice copia e ripetere quattro volte (n = 4).
   NOTA: Per ogni esperimento indipendente (n = 4), gli adipociti sono stati isolati da tre ratti e ogni condizione di trattamento è stata eseguita in triplicato.
2. Per ciascun gruppo di trattamento, dividere il valore di assorbanza del rilascio di glicerolo per il corrispondente valore di assorbanza della vitalità cellulare.
3. Presenta i dati come media ± deviazione standard (SD).
   NOTA: La media e la SD sono state calcolate utilizzando Microsoft Excel con le funzioni =MEDIA(intervallo) e =DEV.ST. S(intervallo). Per i confronti di gruppo, sono stati eseguiti t-test a due code non accoppiati utilizzando GraphPad Prism 6 con la funzione t-test di Confronta medie.
4. Determinare la significatività statistica delle differenze tra i gruppi utilizzando il test t di Student, con un valore P inferiore a 0,05 considerato statisticamente significativo.

Results

Dopo lo screening preliminare del farmaco, il farmaco antiiperlipidemizzante statine è stato utilizzato per studiare gli effetti lipolitici negli adipociti con il metodo di rilascio normalizzato del glicerolo⁹.

L'impatto delle statine sul rilascio di glicerolo dagli adipociti addominali primari di ratto
L'effetto delle statine sulla lipolisi negli adipociti addominali primari di ratto è stato valutato trattando le cellule con 50 μM di pravastatina, s...

Discussion

Questo studio fornisce un metodo più accurato per misurare la lipolisi negli adipociti primari carichi di lipidi. È stato riscontrato che la pravastatina e la simvastatina inducono il rilascio di glicerolo e riducono la vitalità negli adipociti dell'epididimo di ratto, mentre l'atorvastatina e la lovastatina non hanno mostrato effetti significativi. La somministrazione di simvastatina ha determinato un aumento minimo del rilascio di glicerolo dagli adipociti. Per risolvere questo problem...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,22-µ Filtro M	Sangon Biotech Co., Ltd.	F513165-0001	filtro per siringa, sistema AQUO, sterile
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenile tetrazolio bromuro	Sangon Biotech Co., Ltd.	A600799-0001	1 g
Piastre per colture cellulari a 96 pozzetti	Sangon Biotech Co., Ltd.	F603204-0001	sterile
Atorvastatina sale di calcio	Cayman Chimica	10493-5	5 mg
Filtro cellulare	Sangon Biotech Co., Ltd.	F513450-0001	80 maglie dello schermo
Idrato di cloralio	Sangon Biotech Co., Ltd.	A500288-0250	250 g
Dimetilsolfossido	Sangon Biotech Co., Ltd.	A460700-0100	100 ml
Aquila modificata di Dulbecco Medium	Sangon Biotech Co., Ltd.	E600003	500 mL, glicemia alta, sterile
Siero fetale bovino	Sangon Biotech Co., Ltd.	E600001	100 ml, sterile
Kit di dosaggio colorimetrico al glicerolo	Cayman Chimica	10010755-96	96 pozzi
Lovastatina	Cayman Chimica	10010338-5	5 mg
Ratti adulti maschi	Università Putian	Wistar	circa 10-12 settimane
Soluzione di penicillina-streptomicina	Sangon Biotech Co., Ltd.	B540732-0010	10 mL, sterile
Soluzione salina tamponata con fosfato	Sangon Biotech Co., Ltd.	E607009-0500	500 mL, sterile, senza calcio o magnesio
Pravastatina sale sodico	Cayman Chimica	10010343-5	5 mg
Simvastatina	Cayman Chimica	10010344-5	5 mg
Soluzione di tripsina	Sangon Biotech Co., Ltd.	E607003-0100	100 mL, senza EDTA e rosso fenolo, sterile
Collagenasi di tipo II	Sangon Biotech Co., Ltd.	A004174-0100	100 mg