Normalizzazione basata su MTT del rilascio di glicerolo per una quantificazione accurata della lipolisi negli adipociti primari dell'epididimo di ratto

Summary

Gli artefatti sperimentali, tra cui le fluttuazioni della vitalità cellulare e l'interferenza del saggio, ostacolano la quantificazione accurata del rilascio di glicerolo negli adipociti primari ricchi di lipidi. Per mitigare queste sfide, viene utilizzata una strategia di normalizzazione basata su MTT per regolare le misurazioni del glicerolo per l'attività metabolica cellulare, migliorando così l'affidabilità della quantificazione della lipolisi.

Abstract

La lipolisi, una via metabolica critica, comporta l'idrolisi dei trigliceridi immagazzinati in acidi grassi liberi e glicerolo. Tuttavia, la quantificazione accurata dell'output di glicerolo negli adipociti primari ricchi di lipidi è spesso confusa da artefatti sperimentali, come la variabilità nella vitalità cellulare e l'interferenza del saggio. Per ovviare a queste limitazioni, è stato messo a punto un metodo semplice per normalizzare le misurazioni del rilascio di glicerolo utilizzando il saggio di vitalità cellulare basato sul 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT). Questo protocollo sfrutta la differenza di peso specifico tra adipociti e soluzioni acquose, consentendo la quantificazione simultanea dell'output lipolitico e della vitalità cellulare. Negli esperimenti di screening farmacologico, la pravastatina e la simvastatina hanno migliorato significativamente il rilascio di glicerolo dagli adipociti addominali, mentre l'atorvastatina e la lovastatina non hanno alterato significativamente l'output di glicerolo. Questi risultati suggeriscono che la normalizzazione basata su MTT offre un approccio robusto e conveniente per quantificare accuratamente la lipolisi, con potenziali applicazioni nella scoperta di farmaci mirati all'obesità e alla sindrome metabolica. Questo studio sottolinea la necessità di rivalutare i test di lipolisi convenzionali per distinguere le risposte metaboliche autentiche dalla perdita di membrana aspecifica.

Introduction

Il tessuto adiposo può essere suddiviso in tessuto adiposo bianco (WAT) e tessuto adiposo bruno (BAT)¹. Il WAT svolge la funzione di immagazzinamento dell'energia in eccesso sotto forma di trigliceridi, mentre il BAT ha la funzione di generare calore per mantenere la temperatura corporea, che converte l'energia chimica in energia termica sotto la stimolazione del freddo¹. Il tessuto adiposo ha anche funzione endocrina². Può secernere una varietà di ormoni, citochine e metaboliti (collettivamente indicati come adipochine) e controllare l'equilibrio energetico del c....

Protocol

Questo protocollo sfrutta la differenza di peso specifico tra adipociti e soluzioni acquose per consentire la misurazione simultanea del rilascio di glicerolo (come indicatore di lipolisi) e della vitalità cellulare 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) negli stessi pozzetti di una piastra a 96 pozzetti, semplificando così il flusso di lavoro sperimentale e migliorando l'efficienza.

Tutte le procedure sugli animali sono state conformi alle linee guida ARRIVE e sono state condotte in conformità con la Guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da labora....

Results

Dopo lo screening preliminare del farmaco, il farmaco antiiperlipidemizzante statine è stato utilizzato per studiare gli effetti lipolitici negli adipociti con il metodo di rilascio normalizzato del glicerolo⁹.

L'impatto delle statine sul rilascio di glicerolo dagli adipociti addominali primari di ratto
L'effetto delle statine sulla lipolisi negli adipociti addominali primari di ratto è stato valutato trattando le cellule con 50 μM di pravastatina, s.......

Discussion

Questo studio fornisce un metodo più accurato per misurare la lipolisi negli adipociti primari carichi di lipidi. È stato riscontrato che la pravastatina e la simvastatina inducono il rilascio di glicerolo e riducono la vitalità negli adipociti dell'epididimo di ratto, mentre l'atorvastatina e la lovastatina non hanno mostrato effetti significativi. La somministrazione di simvastatina ha determinato un aumento minimo del rilascio di glicerolo dagli adipociti. Per risolvere questo problem.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,22-µ Filtro M	Sangon Biotech Co., Ltd.	F513165-0001	filtro per siringa, sistema AQUO, sterile
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenile tetrazolio bromuro	Sangon Biotech Co., Ltd.	A600799-0001	1 g
Piastre per colture cellulari a 96 pozzetti	Sangon Biotech Co., Ltd.	F603204-0001	sterile
Atorvastatina sale di calcio	Cayman Chimica	10493-5	5 mg
Filtro cellulare	Sangon Biotech Co., Ltd.	F513450-0001	80 maglie dello schermo
Idrato di cloralio	Sangon Biotech Co., Ltd.	A500288-0250	250 g
Dimetilsolfossido	Sangon Biotech Co., Ltd.	A460700-0100	100 ml
Aquila modificata di Dulbecco Medium	Sangon Biotech Co., Ltd.	E600003	500 mL, glicemia alta, sterile
Siero fetale bovino	Sangon Biotech Co., Ltd.	E600001	100 ml, sterile
Kit di dosaggio colorimetrico al glicerolo	Cayman Chimica	10010755-96	96 pozzi
Lovastatina	Cayman Chimica	10010338-5	5 mg
Ratti adulti maschi	Università Putian	Wistar	circa 10-12 settimane
Soluzione di penicillina-streptomicina	Sangon Biotech Co., Ltd.	B540732-0010	10 mL, sterile
Soluzione salina tamponata con fosfato	Sangon Biotech Co., Ltd.	E607009-0500	500 mL, sterile, senza calcio o magnesio
Pravastatina sale sodico	Cayman Chimica	10010343-5	5 mg
Simvastatina	Cayman Chimica	10010344-5	5 mg
Soluzione di tripsina	Sangon Biotech Co., Ltd.	E607003-0100	100 mL, senza EDTA e rosso fenolo, sterile
Collagenasi di tipo II	Sangon Biotech Co., Ltd.	A004174-0100	100 mg