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Articolo metodologico

Misurazione della permeabilità della barriera intestinale rilevando il flusso di traccianti fluorescenti attraverso monostrati di colonoidi umani

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DOI:

10.3791/68857

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17 ottobre 2025

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, Children's Hospital Colorado, 2Department of Medicine, Mucosal Inflammation Program, Division of Gastroenterology and Hepatology, University of Colorado, 3Rocky Mountain Veterans Hospital

In questo articolo

Sommario

Descriviamo una tecnica per misurare l'integrità della barriera intestinale, in base alla quale il tasso di traslocazione di uno zucchero marcato in fluorescenza di dimensioni note riflette la permeabilità dei colonoidi intestinali umani derivati dai tessuti.

Abstract

La barriera intestinale è un sito critico di regolazione tra gli antigeni luminali e il sistema immunitario dell'ospite e la sua disregolazione è implicata in molteplici malattie gastrointestinali. Gli organoidi intestinali possono essere uno strumento utile per comprendere e modellare le differenze nell'integrità della barriera intestinale. Qui, descriviamo un protocollo che utilizza colonoidi umani per quantificare le differenze funzionali della barriera intestinale misurando il flusso di traccianti fluorescenti attraverso i monostrati di organoidi. Dopo aver fatto crescere i monostrati fino alla confluenza, aggiungiamo un tracciante fluorescente, come il FITC-destrano, alla camera apicale e rileviamo la sua traslocazione nella camera basolaterale nel tempo. L'aumento della traslocazione del tracciante fluorescente riflette una barriera epiteliale più permeabile o più debole. Questo protocollo è una piattaforma adattabile che consente la valutazione delle differenze funzionali della barriera intestinale in più condizioni in parallelo. Utilizzando variazioni di questo protocollo, è possibile valutare la permeabilità transepiteliale a molecole di varie dimensioni, forma e struttura chimica, nonché le differenze di permeabilità nel contesto di trattamenti isolati o cambiamenti microambientali sui lati apicali o basolaterali delle cellule epiteliali. Ciò consente una comprensione più profonda del meccanismo e del trattamento dell'interruzione della barriera negli stati patologici.

Introduzione

La mucosa intestinale è una struttura complessa che svolge un ruolo importante nella regolazione del contatto tra i metaboliti, gli antigeni e i microbi nel lume intestinale e nel sistema immunitario e nella circolazione enterica. Le cellule epiteliali intestinali sono un componente chiave di questo sistema e, in condizioni di salute, formano una barriera altamente selettiva. Il trasporto attraverso l'epitelio può avvenire attraverso molteplici meccanismi: trasporto transcellulare attivo o passivo, pori paracellulari o vie di perdita regolate da giunzioni strette e giunzioni aderenti. Se uno di questi percorsi può essere utilizzato da una molecola per traslocare attraverso l'epitelio è determinato dall'idrofobicità, dalle dimensioni e dalla struttura chimica. Una volta attraversato l'epitelio, queste molecole possono interagire più facilmente con le cellule immunitarie della mucosa ed entrare nel sangue o nella circolazione linfatica dell'intestino 1,2 L'interruzione della barriera intestinale è un segno distintivo di diverse malattie infiammatorie gastrointestinali, come la malattia infiammatoria intestinale e la celiachia 1,3,4,5,6,7. Si ritiene che questa barriera intestinale indebolita svolga un ruolo nella fisiopatologia di questi processi patologici attraverso la traslocazione disregolata di antigeni patogeni, che possono quindi creare una risposta infiammatoria locale o sistemica.

Esistono diversi protocolli consolidati per la misurazione della barriera intestinale. Gli studi in vitro utilizzano tradizionalmente linee cellulari tumorali, come le cellule T84 o Caco-2, per misurare la resistenza elettrica transepiteliale (TEER) e per quantificare la giunzione stretta e i componenti della giunzione aderente8. Ex vivo, le misurazioni della corrente transepiteliale possono essere effettuate utilizzando camere di Ussing su campioni di biopsia o intestino resecato9. Gli studi in vivo in genere comportano la somministrazione di traccianti inerti per via orale, quindi la misurazione dell'assorbimento di questi traccianti nel sangue o nelle urine10,11. Sebbene queste tecniche si siano dimostrate utili nello studio della barriera intestinale, presentano diversi limiti: le linee cellulari immortali trasformate hanno intrinsecamente cambiamenti metabolici e citoscheletrici che influenzano la barriera intestinale in modi poco definiti; l'accesso ai pazienti, ai campioni dei pazienti o agli organismi modello può essere limitato; Gli studi in vivo sono difficili da controllare per i fattori confondenti o trarre conclusioni a livello molecolare. Pertanto, sebbene l'evidenza di questa rottura della barriera sia stata riportata in diversi modelli di malattia, la comprensione del meccanismo di questi difetti della barriera intestinale rimane limitata e la nostra capacità di mirare e trattare questo aspetto della malattia gastrointestinale è rimasta sfuggente.

Gli organoidi intestinali umani offrono una capacità unica ed entusiasmante di chiarire la causa e il trattamento dei difetti della barriera intestinale. Gli organoidi intestinali umani derivati da tessuti sono colture cellulari primarie derivate da cellule staminali adulte situate alla base delle cripte intestinali12. Queste cellule possono essere isolate da campioni bioptici o chirurgici e coltivate per mantenere i cambiamenti genetici ed epigenetici osservati nei pazienti da cui sono state derivate 13,14,15. Servono come modello fisiologicamente più rilevante rispetto alle tradizionali linee cellulari immortali perché non hanno i cambiamenti metabolici delle linee cellulari tumorali e possono essere differenziate nei vari tipi di cellule presenti nell'epitelio intestinale maturo 16,17,18. Inoltre, poiché possono essere espansi in vitro, sono più accessibili e utili per studi controllati dell'effetto cellulare di vari trattamenti e condizioni di crescita in parallelo. Sebbene ci siano limitazioni inerenti anche ai modelli di organoidi intestinali, in particolare l'assenza di altri tipi di cellule non epiteliali e il contesto del sistema dell'intero corpo, è stato dimostrato che gli organoidi intestinali umani forniscono un modello affidabile per molteplici aspetti della malattia gastrointestinale13.

Tra questi, è stato dimostrato che gli organoidi intestinali modellano fedelmente i difetti della barriera intestinale, dimostrando i cambiamenti attesi nell'organizzazione della giunzione stretta e nel TEER nel contesto degli insulti di barriera 19,20,21. Qui, adattiamo una tecnica di valutazione dell'integrità della barriera nei colonoidi umani, in cui viene rilevato il flusso di molecole marcate in fluorescenza attraverso i monostrati di organoidi22. In questo protocollo, gli organoidi vengono coltivati e maturati in monostrati bidimensionali polarizzati su membrane semipermeabili. Il test prevede l'aggiunta di un tracciante fluorescente sulla superficie apicale del monostrato epiteliale e la sua presenza sul lato opposto viene quantificata nel tempo. L'aumento del flusso del tracciante riflette un epitelio più permeabile o più permeabile. Questo test fornisce una lettura della barriera funzionale, che può essere aggiuntiva alle valutazioni della struttura delle giunzioni strette e aderenti. Inoltre, sebbene le misure TEER siano spesso utilizzate per fornire una valutazione di base dell'integrità della barriera, il saggio di flusso qui descritto può essere adattato per rilevare la permeabilità di molecole di varie classi, carica e dimensioni, caratterizzando così la barriera in modo molto più dettagliato. A questo scopo possono essere utilizzati diversi traccianti fluorescenti disponibili in commercio. Inoltre, attraverso l'uso di spettri fluorescenti non sovrapposti, è possibile valutare contemporaneamente la permeabilità a più traccianti. Inoltre, la configurazione monostrato di questo test consente la valutazione della risposta di barriera alle condizioni di crescita applicate specificamente alla sola superficie apicale o basolaterale delle cellule. In questo modo, è possibile una valutazione controllata dell'effetto delle terapie, dei cambiamenti microambientali e delle condizioni di co-coltura.

È noto che i difetti della barriera intestinale svolgono un importante ruolo patogeno nello sviluppo di diverse malattie gastrointestinali, ma il termine "intestino permeabile" è sempre più usato nei media popolari senza precisione23 e gli sforzi per colpire la barriera intestinale difettosa sono stati limitati nel successo. Ciò evidenzia la necessità di modelli migliorati per valutare e caratterizzare la barriera intestinale. Il sistema descritto utilizza monostrati di organoidi intestinali fisiologici derivati da tessuti umani per valutare l'integrità della barriera funzionale in condizioni controllate.

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Protocollo

Tutti i campioni sono stati acquisiti e utilizzati in conformità con un protocollo approvato dall'Institutional Review Board (IRB) dell'Università del Colorado, numero di protocollo 14-2012.

NOTA: Tutte le procedure descritte nei passaggi 1-3 devono essere eseguite in una cappa di biosicurezza sterile con tecnica sterile. Uno schema del protocollo è presentato nella Figura 1.

1. Insediamento di colonoidi umani da colture congelate

NOTA: Assicurarsi che tutti i materiali siano pronti nella cabina di biosicurezza prima di scongelare le cellule per ridurre al minimo l'esposizione degli organoidi scongelati al mezzo di congelamento. Il protocollo inizia con colonoidi umani derivati da tessuti crioconservati. I protocolli per la derivazione e la crioconservazione dei colonoidi umani sono stati descritti in precedenza24.

  1. Preparazione del terreno staminale dell'organoide intestinale umano
    1. Preparare il terreno condizionato Wnt-3A/Noggin/R-Spondin 3 (L-WRN) secondo i protocolli precedentemente descritti25,26.
    2. Integrare i terreni L-WRN con i seguenti fattori di crescita: fattore di crescita epidermico [50 ng/mL], nicotinamide [10 mM], A83-01 [500 nM], SB202190 [10 μM], CHIR99021 [3 μM], tiazovivin [4 μM], SB431542 [4 μM], gastrina I [10 nM].
    3. Miscelare il terreno L-WRN integrato 1:1 con i terreni per organoidi intestinali commerciali.
    4. Poco prima dell'uso, integrare con Y-27632 [10 μM].
      NOTA: La composizione ottimale del terreno staminale dell'organoide intestinale può variare in base al laboratorio e alla linea colonoide. Può essere possibile anche l'uso di soli terreni L-WRN integrati o l'uso di soli terreni organoidi intestinali commerciali. L'uso di questo protocollo di parti uguali di terreni condizionati L-WRN e terreni commerciali è più resistente alla variabilità da lotto a lotto rispetto all'uso dei soli terreni condizionati ed è più conveniente rispetto all'uso dei soli terreni commerciali.
  2. Preparazione del mezzo di differenziazione
    1. Integrare DMEM/F12 con il 10% di siero fetale bovino (FBS), l'1% di penicillina-streptomicina e 2 mM di L-alanil-L-glutammina dipeptide.
    2. Miscelare DMEM/F12 1:1 integrato con il terreno di stelo dell'organoide intestinale della fase 1.1
  3. Preparazione della matrice extracellulare (ECM)
    1. Scongelare l'ECM per una notte in ghiaccio, quindi preparare aliquote da 100 μl.
      NOTA: Le aliquote possono essere ricongelate a -20 °C. Per ulteriori informazioni, vedere le istruzioni del produttore.
    2. Incubare le aliquote sul ghiaccio fino al momento della placcatura delle cellule.
  4. Scongelamento e placcatura di organoidi
    1. Scongelare il contenuto del crioviale a bagnomaria a 37 °C, assicurandosi che la fiala rimanga sommersa, ma il tappo sia sopra l'acqua, fino a quando non viene scongelato.
    2. Trasferire il contenuto del flaconcino in una provetta conica da 15 mL contenente 13 mL di terreno DMEM/F12 integrato con ghiaccio (dal passaggio 1.2.1).
    3. Centrifugare a 200 × g per 5 min a 4 °C.
    4. Aspirare il surnatante, lasciando circa 1 mL di volume residuo sopra il pellet cellulare.
    5. Metti il tubo sul ghiaccio. Aggiungere 1 mL di DMEM/F12 integrato con ghiaccio (dal passaggio 1.2.1) e pipettare la sospensione 10-15 volte per risospendere il pellet.
    6. Centrifugare a 200 × g per 5 min a 4 °C.
    7. Rimuovere il surnatante utilizzando una pipetta, lasciando il minor numero possibile di residui di liquido di lavaggio sul pellet cellulare.
    8. Aggiungere 100 μl di ECM scongelata al pellet. Risospendere accuratamente, assicurandosi che gli organoidi siano distribuiti uniformemente senza grumi. Pipettare lentamente per evitare l'introduzione di bolle d'aria.
    9. Piastra ECM pipettando circa 10 cupole o goccioline tridimensionali di ECM, circa 10 μL ciascuna, in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
    10. Capovolgere rapidamente la piastra e incubare a 37 °C per 5-10 minuti o fino a quando le cupole non si saranno solidificate.
    11. Una volta impostate le cupole, aggiungere 2 ml di terreno di staminali dell'organoide intestinale (dal passaggio 1.1) al pozzetto.
    12. Incubare a 37 °C, in incubatore umidificato con CO2 al 5%. Sostituire il supporto ogni 2 giorni.
    13. Procedere con la fase 2 una volta che gli organoidi occupano più di circa il 75% dell'area della cupola dell'ECM o stanno accumulando detriti centrali.

2. Passaggio ed espansione dei colonoidi umani

  1. Per ogni pozzetto, aspirare il terreno di coltura dai pozzetti senza interrompere le cupole ECM.
  2. Lavare delicatamente le cupole con 1 ml di soluzione salina ghiacciata tamponata con fosfato (PBS), quindi rimuovere il PBS.
  3. Aggiungere 1 ml di tripsina ghiacciata in ogni pozzetto. Utilizzare una pipetta per rompere le cupole dell'ECM pipettando su e giù. Pipettare la miscela 10-15 volte per dissociare completamente la MEC.
  4. Incubare la piastra a 37 °C per 3-5 minuti.
  5. Aggiungere 1 mL di DMEM/F12 integrato con ghiaccio freddo (dal passaggio 1.2.1) al pozzetto per neutralizzare la tripsina. Pipettare energicamente la miscela 20-30 volte fino a quando le cellule non sono dissociate in gruppi di 2-3 cellule ciascuno.
  6. Trasferire la sospensione cellulare in una coppia conica da 15 mL.
  7. Utilizzare un ulteriore 1 mL di DMEM/F12 integrato (dal passaggio 1.2.1) per lavare il pozzetto e aggiungere la soluzione di lavaggio al conico da 15 mL.
  8. Aggiungere DMEM/F12 integrato (dal passaggio 1.2.1) per raggiungere un volume totale di 13 mL nel conico da 15 mL.
  9. Procedere con i passaggi 1.4.3-1.4.12 del passaggio 1 utilizzando una quantità appropriata di ECM per espandersi in pozzetti aggiuntivi.
    NOTA: Un pozzetto confluente di organoidi in 100 μL di ECM può tipicamente essere fatto passare in 2-3 pozzetti (200-300 μL di ECM). Un pozzetto confluente di organoidi è sufficiente per circa 3-6 monostrati nella fase 3.

3. Generazione di monostrati di colonoide umano

  1. Inserti per colture cellulari con rivestimento in collagene
    1. Posizionare gli inserti per colture cellulari in polistirene (dimensione dei pori di 0,4 μm) in una piastra a 24 pozzetti e aggiungere 100 μl di soluzione di rivestimento in collagene nella camera apicale di ciascun inserto.
    2. Sigillare la piastra con pellicola sigillante per evitare l'evaporazione.
    3. Incubare a 4 °C per 4-24 h.
      NOTA: Non vi è alcuna differenza nei risultati all'interno di questo tempo di incubazione, ma è possibile scegliere un tempo di incubazione più breve o più lungo per adattarsi a un comodo punto di pausa.
  2. Monostrati di organoidi galvanici
    1. Seguire i passaggi 2.1-2.5 per dissociare gli organoidi.
    2. Passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 μm in una provetta conica da 50 mL.
    3. Sciacquare i pozzetti con 1 mL ciascuno di DMEM/F12 integrato (dal passaggio 1.2.1). Raccogliere questo mezzo di lavaggio e passarlo attraverso il filtro cellulare.
    4. Lavare il filtro cellulare con DMEM/F12 integrato (dal passaggio 1.2.1) fino a quando il volume totale nella provetta conica da 50 mL raggiunge i 15 mL.
    5. Trasferire il filtrato in una coppia conica da 15 mL.
    6. Centrifugare a 200 × g per 5 min a 4 °C.
    7. Aspirare il surnatante, lasciando 1 mL sopra il pellet.
    8. Aggiungere un ulteriore 1 mL di terreno DMEM/F12 integrato (dal passaggio 1.2.1) e risuspendare.
    9. Esaminare la sospensione al microscopio per confermare la completa dissociazione. Se necessario, pipettare energicamente le cellule fino a quando non sono per lo più cellule singole.
    10. Centrifugare a 200 × g per 5 min a 4 °C. Rimuovere il surnatante utilizzando una pipetta, lasciando il minor numero possibile di residui di liquido di lavaggio sul pellet cellulare.
    11. Risospendere in un piccolo volume (200-1000 μL) di terreno staminale dell'organoide intestinale (dal passaggio 1.1). Mantenere il ghiaccio.
    12. Prelevare un'aliquota della sospensione cellulare da utilizzare per contare le cellule vitali utilizzando il metodo preferito. Utilizzare la conta delle cellule vitali per determinare il volume di sospensione cellulare necessario per piastrare 100.000 cellule vitali per inserto.
    13. Aspirare la soluzione di rivestimento in collagene da ciascun inserto senza toccare la membrana dell'inserto.
    14. Aggiungere il volume appropriato di terreno staminale dell'organoide intestinale (dal passaggio 1.1) alla camera apicale di ciascun inserto per portare il volume finale a 200 μl una volta aggiunta la sospensione cellulare.
      NOTA: Se si preferisce, la sospensione cellulare al punto 3.2.12 può essere regolata a una concentrazione finale di 100.000 cellule/200 μL, quindi 200 μL possono essere piastrate nella camera apicale. Tuttavia, se l'intera sospensione cellulare non viene utilizzata per la placcatura monostrato, ciò può portare a un eccessivo spreco di fluidi.
    15. Aggiungere il volume appropriato di sospensione cellulare alla camera apicale.
    16. Aggiungere 500-1000 μl di terreno staminale dell'organoide intestinale nella camera basolaterale.
      NOTA: 500 μl sono sufficienti per i colonoidi tipici. Se le cellule sono metabolicamente più attive o comunque sensibili all'accumulo di prodotti di scarto, l'uso di un volume maggiore nella camera basolaterale può essere utile per mantenere la crescita.
    17. Ripetere per tutti gli inserti/pozzetti.
    18. Incubare a 37 °C, in incubatore umidificato con CO2 al 5%.
    19. Sostituire il supporto una volta alla settimana.
      NOTA: I trattamenti di interesse possono essere applicati alle camere apicali e/o basolaterali degli inserti in qualsiasi momento prima o dopo la placcatura.

4. Misurazione della resistenza elettrica transepiteliale (TEER) e della maturazione del monostrato

  1. Misura la resistenza
    1. Utilizzare un volt/ohmmetro epiteliale sull'impostazione ohm. Pulire la sonda strofinandola con una salvietta imbevuta di etanolo al 70%. Posizionare il braccio più lungo dell'elettrodo nel compartimento basolaterale e il braccio più corto nel compartimento apicale dell'inserto. Registra la misurazione.
      NOTA: Se anche le misurazioni TEER sono un punto finale di interesse, eseguire anche le misurazioni della resistenza di un inserto rivestito di collagene senza celle come sfondo. Quindi, il TEER viene calcolato come (resistenza - resistenza dell'inserto di fondo) x area della superficie dell'inserto. La superficie dell'inserto in questo protocollo è di 0,33 cm2. Questo calcolo darà TEER in ohm·cm2. Se si utilizza un volt/ohmmetro epiteliale diverso da quello elencato nella Tabella dei materiali, utilizzare le istruzioni per l'uso del produttore del misuratore per misurare la resistenza.
    2. Ripetere ogni giorno fino a quando le misurazioni non si stabilizzano.
      NOTA: Il plateau si verifica tipicamente dopo 2 o 3 settimane con TEER superiore a 200 ohm·cm2, ma varia in base alla linea colonoide e alle condizioni di crescita.
  2. Una volta che la resistenza si è stabilizzata, avviare la maturazione degli organoidi sostituendo i terreni staminali con mezzi di differenziazione (dal passaggio 1.2).
  3. Continuare le misurazioni TEER giornaliere. Aspettatevi un aumento del TEER e un secondo plateau.
    NOTA: Il secondo plateau si verifica tipicamente intorno ai 7 giorni con TEER di 1500-2500 ohm·cm2, ma questo varia in base alla linea colonoide e alle condizioni di crescita.
  4. Una volta che le misurazioni TEER si sono stabilizzate una seconda volta, procedere con il passaggio 5.

5. Saggio del flusso di FITC-destrano

NOTA: Questo protocollo utilizza FITC-destrano 4 kDa (raggio di Stokes 14 Å). Tuttavia, a seconda delle esigenze sperimentali, possono essere utilizzati traccianti fluorescenti di diverse dimensioni, cariche e fluorofori22. Possono essere utilizzati anche più traccianti contemporaneamente, nel qual caso devono essere confermati spettri di eccitazione ed emissione di fluorescenza non sovrapposti. Si consiglia di eseguire i passaggi 5.1-5.3 in una camera di riscaldamento (non umidificata, incubatrice non CO2 ) impostata a 37 °C. Se questo non è disponibile, i reagenti devono essere riscaldati a 37 °C prima dell'uso e le cellule, i tamponi e i campioni raccolti devono essere mantenuti a 37 °C durante i periodi di incubazione.

  1. Preparazione del reagente
    1. Preparare la soluzione salina tamponata di Hank (HBSS) con 10 mM di HEPES e regolare il pH a 7,4. Caldo a 37 °C.
      NOTA: Se necessario, preparare HBSS+HEPES con trattamenti di interesse. Preparare una quantità sufficiente per 80 μL/pozzetto nella camera apicale e 1 mL/pozzetto nella camera basolaterale.
    2. Versare circa 50 ml di HBSS+HEPES caldo in un piccolo becher per risciacquare gli inserti. Tieni un bicchiere più grande nelle vicinanze per i rifiuti liquidi.
    3. Scongelare completamente FITC-destrano 4 kDa. Preparare una soluzione da 1,25 mg/mL in HBSS con HEPES. Preparare un volume adeguato di soluzione di FITC-destrano per allocare 80 μl per pozzetto e 1 μl per la curva standard.
      NOTA: La concentrazione iniziale può essere regolata in base alle dimensioni e alla permeabilità prevista del tracciante. Ad esempio, è possibile aggiungere traccianti più piccoli o più permeabili a una concentrazione inferiore per conservare i reagenti. Se è necessario applicare trattamenti alla camera apicale, preparare una soluzione di FITC-destrano in HBSS+HEPES opportunamente trattato.
  2. Applicazione di FITC-destrano su monostrati
    1. Preparare una nuova piastra a 24 pozzetti aggiungendo 1 mL di HBSS+HEPES (con trattamento se lo si desidera) nei pozzetti appropriati.
    2. Lavare i monostrati di organoidi afferrando l'inserto con una pinza, sollevandolo dal pozzetto, immergendolo nel becher contenente HBSS+HEPES caldo (dal passaggio 5.1.2) per riempire la camera apicale, quindi capovolgendolo sul becher di scarto per svuotare la soluzione di lavaggio.
    3. Ripetere questo lavaggio altre 2 volte.
    4. Posizionare l'inserto nell'apposito pozzetto della piastra fresca preparata al punto 5.2.1.
    5. Pipettare delicatamente 80 μl di soluzione di FITC-destrano nella camera apicale. Pipettare sul lato dell'inserto per evitare di disturbare il monostrato.
    6. Ripetere il passaggio 5.2.5 per tutti i monostrati.
    7. Aggiungere HBSS o PBS a tutti i pozzetti vuoti per mantenere l'umidità.
  3. Raccolta di campioni di flusso
    1. Immediatamente dopo il passaggio 5.2.7, raccogliere 70 μl dalla camera basolaterale di ciascun pozzetto in un pozzetto di una piastra nera piatta a 96 pozzetti a fondo trasparente e proteggerlo dalla luce a 37 °C. Questo sarà il punto temporale 0.
    2. Incubare la piastra, al riparo dalla luce, a 37 °C.
    3. Ogni 30 minuti per 2 ore, miscelare il tampone nel pozzetto basolaterale, quindi raccogliere altri 70 μl nei pozzetti vuoti della piastra a 96 pozzetti a fondo trasparente dal passaggio 5.3.1.
  4. Preparazione della curva standard
    1. Aggiungere 1 μl della soluzione riservata di FITC-destrano (1,25 mg/mL; passaggio 5.1.3) in 999 μl di HBSS+HEPES. Questa sarà la diluizione 1:1000 o 1,25 μg/mL per la curva standard.
    2. Diluire in serie questa soluzione 1:1 prendendo 150 μl della soluzione e aggiungendola a 150 μl di HBSS+HEPES, quindi mescolando bene. Ripeti l'operazione in serie altre dieci volte per un totale di una diluizione in 12 fasi.
      NOTA: Questo creerà una curva standard di: 1250, 625, 312,5, 156,25, 78,13, 39,06, 19,53, 9,77, 4,88, 2,44, 1,22 e 0,61 ng/mL. A seconda della permeabilità delle linee cellulari, potrebbe essere necessario concentrare maggiormente o meno la curva standard. La prima volta che si esegue l'esperimento, riservare un'ulteriore soluzione di FITC-destrano da 1,25 mg/mL nel caso in cui la curva standard debba essere rifatta a una concentrazione diversa.
    3. Pipettare 70 μl di ciascuna diluizione della curva standard in pozzetti vuoti della piastra inferiore trasparente a 96 pozzetti dei passaggi 5.3.1 e 5.3.3. Ripetere l'operazione per la seconda replica.
  5. Misurare la fluorescenza su un lettore di piastre fluorescenti con le seguenti impostazioni: eccitazione 490 nm, emissione a 520 nm, lettura dal fondo della piastra, con un guadagno di 100 e un'altezza di lettura di 7 mm.
    NOTA: Regolare le lunghezze d'onda di eccitazione/emissione in base alle esigenze del fluoroforo scelto.
  6. Analisi dei dati
    1. Traccia la curva standard con la concentrazione sull'asse x e la fluorescenza sull'asse y. Utilizzare questa opzione per determinare l'equazione di regressione lineare.
    2. Utilizzare questa equazione di regressione lineare e le letture fluorescenti dei campioni per calcolare la concentrazione di destrano FITC in ogni punto temporale per ciascun campione.
    3. Tracciare la concentrazione nel tempo per ciascun campione e calcolare la pendenza di un'equazione di regressione lineare, che rappresenta microgrammi/min (μg/min). Dividere questo per la superficie dell'inserto di coltura cellulare (0,33 cm) per determinare la velocità di flusso in microgrammi al minuto per centimetro quadrato (μg/min/cm2).

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Risultati

Utilizzando questo protocollo, è stata analizzata la permeabilità di colonoidi umani sani in presenza e assenza di segnalazione infiammatoria. L'aggiunta di una miscela di citochine infiammatorie, denominata cytomix, che include IFNγ, TNFα e IL-1β (ciascuno a 10 ng/ml), ha precedentemente dimostrato di indurre una disfunzione della barriera intestinale misurata da TEER in modelli di cellule epiteliali intestinali 20,27. Abbiamo cercato di determinare se questa di...

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Discussione

Si tratta di un protocollo per valutare la barriera intestinale nel modello fisiologicamente rappresentativo di monostrati di colonoidi umani. Il saggio di flusso del tracciante fluorescente qui descritto fornisce informazioni sull'integrità funzionale della barriera oltre a quanto raccolto con altri tipi di saggi di barriera, come TEER, misurazioni della camera di Ussing o valutazione dell'espressione proteica a giunzione stretta. Inoltre, l'uso di modelli di organoidi intestinali deriv...

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Dichiarazioni

Non ci sono divulgazioni o conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Il Dr. Sean Colgan è finanziato dalle sovvenzioni NIH DK1047893, DK50189, DK095491, DK103639 e VA Merit BX002182.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette da centrifuga coniche da 15 mLCelltreat229411
Fiala criogenica filettata interna da 2 mLCorning430488
Provette da centrifuga coniche da 50 mLCelltreat229421
piastra a 6 pozzetti, trattamento per coltura tissutaleCelltreat229106
70 μ Filtro cellulare MFalcone352350
Piastra inferiore a 96 pozzetti nera/trasparenteTermo Scientifico165305
A83-01 R& D2939
Lettore di piastre BioTek SynergyAgilentSinergia H1
Cellometro Auto T4 Contatore di cellule in campo chiaroNexcelcomCMT-AT4P
Camere di conteggio delle celle del cellometroNexcelcomNC1531583
CHIR99021Sigma-AldrichSML1046-5 MG
Soluzione di rivestimento in collagene Applicazioni cellulari125-50
DMEM/F-12Gibco11330057
DMSOSigma-AldrichD2650-100ML
Etanolo 100%Fisher ScientificoVisualizzazione del materiale A4094
Voltohmmetro EVOM2 con elettrodo Stx2Strumenti di precisione mondialiNC9792051
Siero fetale bovino (FBS)CitivaSH30396.03HI
Puntali per pipette filtrantiFisher Scientifico02-707-000, 02-707-002, 02-707-006, 02-707-008
Isotiocianato di fluoresceina (FITC)-destrano, 4kDaSigma-Aldrich46944
Gastrin I (Umano)R& D3006
GlutaMAX Fisher Scientifico35050061200 mM di L-alanil-L-glutammina dipeptide
Soluzione salina tamponata Hanks 10xTermo Scientifico14065056
HEPES 1MTermo Scientifico15630080
Interferone gamma ricombinante umanoBioLeggenda575308
Interleuchina 1 beta ricombinante umanaTermo scientifico200-01B-500UG
IntestiCult Terreno di Crescita Organoidi Intestinali (Umano)Tecnologie STEMCELL06010 Terreni organoidi intestinali commerciali
Microscopio invertito dal vivoOlimpoIX85
MatrigelCorning354234Matrice extracellulare (ECM)
Incubatore microbiologicoFisher Scientifico151030515
Piastra multipozzetto per coltura in sospensione, 24 pozzettiGreiner Bio-one662102
NicotinammideR& D4106
ParafilmMillipore SigmaHS234526BPellicola sigillante
Pipette Pasteur (vetro borosilicato)Fisher Scientifico13-678-20B
PBS Gibco10010-023
Penicillina streptomicina (10.000 U/mL)Gibco15140122
Fattore di crescita epidermico ricombinanteR& D2028-EG
Centrifuga refrigerataBeckman CoulterBE-AX15R
SB202190 R& D1264
TiazovicinaR& D3845
Inserto per colture cellulari ThinCert per piastra a 24 pozzetti, 0,4 &; mGreiner Bio-one662641
Tripsina-EDTA (0,25%)Fisher Scientifico25200114
Fattore di necrosi tumorale alfa ricombinante umanoR& D10291-TA-100
Y-27632 dicloridrato TocrisTB1254-GMP

Riferimenti

  1. Vanuytsel, T., Tack, J., Farre, R. The role of intestinal permeability in gastrointestinal disorders and current methods of evaluation. Front Nutr. 8, 717925(2021).
  2. Tsai, P. Y., et al. Il-22 upregulates epithelial claudin-2 to drive diarrhea and enteric pathogen clearance. Cell Host Microbe. 21 (6), 671-681.e4 (2017).
  3. Bjarnason, I., O'morain, C., Levi, A. J., Peters, T. J. Absorption of 51chromium-labeled ethylenediaminetetraacetate in inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 85 (2), 318-322 (1983).
  4. Bjarnason, I., Peters, T. J., Veall, N. A persistent defect in intestinal permeability in coeliac disease demonstrated by a 51cr-labelled EDTA absorption test. Lancet. 1 (8320), 323-325 (1983).
  5. Schulzke, J. D., Bentzel, C. J., Schulzke, I., Riecken, E. O., Fromm, M. Epithelial tight junction structure in the jejunum of children with acute and treated celiac sprue. Pediatr Res. 43 (4 Pt 1), 435-441 (1998).
  6. Schumann, M., et al. Cell polarity-determining proteins par-3 and pp-1 are involved in epithelial tight junction defects in coeliac disease. Gut. 61 (2), 220-228 (2012).
  7. Zeissig, S., et al. Changes in expression and distribution of claudin 2, 5 and 8 lead to discontinuous tight junctions and barrier dysfunction in active Crohn's disease. Gut. 56 (1), 61-72 (2007).
  8. Schoultz, I., KeitaÅ, V. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909(2020).
  9. Thomson, A., et al. The ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterol. 19 (1), 98(2019).
  10. Gan, J., et al. A case for improved assessment of gut permeability: A meta-analysis quantifying the lactulose:Mannitol ratio in coeliac and Crohn's disease. BMC Gastroenterol. 22 (1), 16(2022).
  11. Sequeira, I. R., Lentle, R. G., Kruger, M. C., Hurst, R. D. Standardising the lactulose mannitol test of gut permeability to minimise error and promote comparability. PLoS One. 9 (6), e99256(2014).
  12. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  13. Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
  14. Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).
  15. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  16. Yin, X., et al. Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny. Nat Methods. 11 (1), 106-112 (2014).
  17. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  18. Basak, O., et al. Induced quiescence of Lgr5+ stem cells in intestinal organoids enables differentiation of hormone-producing enteroendocrine cells. Cell Stem Cell. 20 (2), 177-190.e4 (2017).
  19. Jelinsky, S. A., et al. Molecular and functional characterization of human intestinal organoids and monolayers for modeling epithelial barrier. Inflamm Bowel Dis. 29 (2), 195-206 (2023).
  20. Kollmann, C., et al. Human organoids are superior to cell culture models for intestinal barrier research. Front Cell Dev Biol. 11, 1223032(2023).
  21. Parente, I. A., Chiara, L., Bertoni, S. Exploring the potential of human intestinal organoids: Applications, challenges, and future directions. Life Sci. 352, 122875(2024).
  22. Sanders, S. E., Madara, J. L., McGuirk, D. K., Gelman, D. S., Colgan, S. P. Assessment of inflammatory events in epithelial permeability: A rapid screening method using fluorescein dextrans. Epithelial Cell Biol. 4 (1), 25-34 (1995).
  23. Lacy, B. E., Wise, J. L., Cangemi, D. J. Leaky gut syndrome: Myths and management. Gastroenterol Hepatol. 20 (5), 264-272 (2024).
  24. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and Culture of Human Intestinal Organoids Derived from Adult Stem Cells. Curr Protoc Immunol. 130 (1), e106(2020).
  25. Vandussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-wrn conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Res. 37, 101430(2019).
  26. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  27. Wang, R. X., Lee, J. S., Campbell, E. L., Colgan, S. P. Microbiota-derived butyrate dynamically regulates intestinal homeostasis through regulation of actin-associated protein synaptopodin. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (21), 11648-11657 (2020).
  28. Al-Qadami, G., et al. Intestinal organoid coculture systems: Current approaches, challenges, and future directions. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 328 (3), G252-G276 (2025).
  29. Wang, Y., Kim, R., Sims, C. E., Allbritton, N. L. Building a thick mucus hydrogel layer to improve the physiological relevance of in vitro primary colonic epithelial models. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 8 (4), 653-655.e5 (2019).
  30. Yang, L., et al. A tunable human intestinal organoid system achieves controlled balance between self-renewal and differentiation. Nat Commun. 16 (1), 315(2025).
  31. Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (4), 659-668 (2018).

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