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Articolo metodologico

Produzione e utilizzo di stampi di agarosio personalizzabili per la coltura di follicoli ovarici di topo senza scaffold

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DOI:

10.3791/68871

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24 ottobre 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 3Roy J. Carver Department of Biomedical Engineering, Pappajohn Biomedical Institute, University of Iowa

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Descriviamo i metodi per coltivare i follicoli ovarici in un nuovo stampo di agarosio privo di scaffold che completa la gametogenesi in vitro .

Abstract

Il follicolo ovarico è l'unità funzionale dell'ovaio che produce ormoni e gameti necessari per sostenere la funzione riproduttiva e la salute femminile. La capacità di ricapitolare la follicologenesi, l'ovulazione e la luteinizzazione in vitro ha un'ampia utilità di base, traslazionale e clinica. I più avanzati sistemi di crescita follicolare in vitro mantengono l'architettura tridimensionale (3D) del follicolo, che è fondamentale per lo sviluppo di ovociti di metafase II meioticamente competenti nell'uomo. Recentemente, è stato sviluppato e convalidato un metodo senza scaffold per la crescita in vitro dei follicoli secondari multistrato di topo. Per questo, sono stati utilizzati stampi stampati in 3D personalizzati per micromodellare l'agarosio con micropozzetti che si adattano all'espansione volumetrica dei follicoli. I follicoli cresciuti in questo ambiente privo di scaffold hanno mostrato una produzione e una vitalità ormonali comparabili rispetto ai sistemi di crescita dei follicoli incapsulati in vitro ( eIVFG) a base di alginato. È importante sottolineare che i micropozzetti di agarosio sono un metodo scalabile, meno impegnativo dal punto di vista tecnico e mostrano una migliore crescita dei follicoli e tassi di ovulazione rispetto all'eIVFG. Questa metodologia produce stampi personalizzabili e biocompatibili con l'ovocita, una cellula altamente sensibile ai percolati specifici del materiale e ad altri contaminanti ambientali. Inoltre, i follicoli di questo sistema vengono coltivati sullo stesso piano focale, consentendo l'imaging e l'analisi in timelapse in tempo reale. Per aumentare l'accessibilità di questo nuovo approccio, questo articolo descrive in dettaglio i metodi necessari per progettare e stampare in 3D stampi master, creare stampi in silicone per piastre da 24 o 96 pozzetti e coltivare follicoli ovarici secondari multistrato isolati negli stampi di agarosio. Questa configurazione può anche essere integrata con un sistema di imaging time-lapse economico, che consente l'analisi morfocinetica. Inoltre, gli stampi possono essere incorporati in paraffina per le analisi istologiche a valle. Nel complesso, questo metodo di facile utilizzo è uno strumento versatile per la coltura dei follicoli e può essere ulteriormente personalizzato per promuovere la differenziazione e la maturazione delle cellule germinali nel contesto del follicolo per sostenere la gametogenesi in vitro completa.

Introduzione

L'ovocita, o gamete femminile, apporta la maggior parte del citoplasma e metà del materiale genetico all'embrione al momento della fecondazione, che è essenziale per lo sviluppo della generazione successiva. L'ovogenesi inizia durante lo sviluppo embrionale quando le cellule germinali primordiali entrano in meiosi e si arrestano nella profase I. Questi ovociti risiedono all'interno dei follicoli primordiali e costituiscono la riserva ovarica, un pool finito e non rinnovabile da cui vengono progressivamente reclutati. I follicoli si sviluppano in un processo noto come follicologenesi, con l'obiettivo di produrre un gamete maturo in grado di fecondare 1,2,3,4,5. Lo sviluppo del follicolo inizia con una fase precoce, indipendente dalle gonadotropine, in cui la segnalazione paracrina è essenziale per la sopravvivenza e la crescita del follicolo. Quando i follicoli maturano allo stadio secondario, diventano dipendenti dalle gonadotropine, segnando un passaggio alla segnalazione endocrina. Una caratteristica chiave dei follicoli secondari è un ovocita circondato da un minimo di due strati completi di cellule della granulosa cuboidale, insieme allo strato di teca di nuova concezione. Le cellule della teca formano lo strato più esterno del follicolo, fornendo androgeni e supporto strutturale 6,7. Infine, si forma una cavità antrale piena di liquido che si rompe in risposta a un picco di ormone luteinizzante (LH) durante l'ovulazione, rilasciando un gamete competente per la fecondazione arrestato alla Meiosi II 2,8,9.

L'ovocita raggiunge la competenza nello sviluppo per la fecondazione e la capacità di sostenere lo sviluppo embrionale preimpianto precoce, indicato come maturazione nucleare e citoplasmatica, durante l'oogenesi e la follicologenesi 10,11,12. La maturazione citoplasmatica è evidente morfologicamente, poiché gli ovociti si espandono durante la follicologenesi. Come risultato della proliferazione delle cellule somatiche, comprese le cellule della teca, della granulosa e del cumulo, i follicoli stessi subiscono una significativa espansione volumetrica. Nei topi, il diametro del follicolo aumenta di cinque volte dai follicoli secondari precoci a quelli pre-ovulatori. La comunicazione bidirezionale tra l'ovocita e le cellule somatiche circostanti è essenziale per l'ovogenesi. Nei follicoli primari, la zona pellucida si forma a partire da proteine secrete dall'ovocita, e la comunicazione tra questi compartimenti follicolari è in parte mediata da proiezioni transzonali, che forniscono il contatto fisico tra questi due compartimenti follicolari13,14. Pertanto, il microambiente follicolare è vitale per orchestrare correttamente la crescita e la maturazione nucleare e citoplasmatica dell'ovocita 2,5. Per comprendere meglio i meccanismi discreti che supportano questi processi, c'è bisogno di tecniche di coltura in vitro avanzate e fisiologicamente rilevanti. La capacità di coltivare follicoli in vitro ha ampie applicazioni, tra cui le tecnologie di riproduzione assistita e la conservazione della fertilità 15,16,17,18, la conservazione delle specie 19,20, lo sviluppo di farmaci21 e lo screening tossicologico22,23.

I sistemi di coltura dei follicoli in vitro sono anche un passaggio intermedio essenziale per la capacità di generare gameti da cellule staminali pluripotenti, nota anche come gametogenesi in vitro (IVG)24. I ricercatori hanno utilizzato cellule staminali embrionali, cellule staminali mesenchimali e cellule staminali pluripotenti indotte per sviluppare gameti in una varietà di specie, spesso facendo affidamento su cellule somatiche per ricreare il microambiente nativo del follicolo 25,26,27,28,29,30. Sebbene con questi metodi siano stati raggiunti importanti traguardi di proof-of-concept, c'è ancora una sfida per gli ovociti di bassa qualità, che si riflette nel basso sviluppo embrionale e nei tassi di prole viva dopo la fecondazione in vitro nei topi31,32. In altre specie non sono ancora stati raggiunti nati vivi, sottolineando la necessità di un continuo perfezionamento dei protocolli per supportare pienamente l'ovogenesi e la follicologenesi.

Attualmente, vengono utilizzate diverse strategie per la coltura dei follicoli. Gli approcci tecnicamente meno impegnativi e con la massima produttività sono i metodi senza scaffold, in cui i follicoli vengono inseriti in un piatto di plastica o in un inserto a membrana33,34. Qui, le cellule della granulosa aderiscono alla superficie di coltura, perdendo il contatto con l'ovocita33,34. La rottura dell'architettura follicolare limita l'usabilità e la rilevanza biologica di queste tecniche. Tuttavia, la coltura senza scaffold in placche di attacco basse o gocce invertite consente al follicolo di mantenere l'integrità strutturale in diverse specie di mammiferi 35,36,37. Purtroppo, con queste tecniche, è difficile controllare l'interazione tra i follicoli e la quantità di supporto meccanico che ricevono. Pertanto, per ricapitolare meglio la fisiologia in vivo, sono stati sviluppati metodi di coltura in cui i follicoli sono incapsulati in idrogel con composizioni chimiche e/o proprietà meccaniche definite e regolabili 33,34,38,39,40,41,42,43,44,45,46 ,47,48,49,50,51,52,53. Ad esempio, il sistema di crescita dei follicoli in vitro incapsulato in alginato può ricapitolare le firme trascrittomiche chiave osservate in vivo21.

Nonostante il successo e il valore dei protocolli di coltura incapsulati, ci sono diversi svantaggi. Possono essere tecnicamente impegnativi, laboriosi, a bassa produttività e non sono compatibili con i metodi di imaging automatico. Inoltre, i metodi di coltura incapsulati richiedono approcci a più fasi per le specie di mammiferi più grandi a causa della maggiore espansione volumetrica del follicolo37. Inoltre, le tecniche incapsulate esercitano un supporto uniforme in tutte le direzioni e i follicoli devono essere rilasciati dall'idrogel prima dell'ovulazione. Ciò non si verifica in vivo, dove il follicolo interagisce con il microambiente ovarico circostante, che fornisce un supporto biomeccanico dinamico54. Ad esempio, la corteccia ovarica rigida mantiene la quiescenza dei follicoli primordiali, mentre i follicoli in crescita di grandi dimensioni si trovano tipicamente nel compartimento midollare più morbido55,56. Una volta che un follicolo con un ovocita competente ha raggiunto la sua dimensione terminale, le modifiche della parete del follicolo e della superficie ovarica dell'epitelio consentono l'ovulazione. Pertanto, le tecniche di coltura in cui i follicoli possono crescere in un'unica direzione con poca resistenza potrebbero imitare meglio la fisiologia in vivo.

In un nuovo approccio, è stato sviluppato un metodo di coltura riproducibile, scalabile, tecnicamente meno impegnativo ed economico per i follicoli secondari multistrato di topo57. Qui, i micropozzetti di agarosio a bassissima adesione con geometria (forma, dimensioni) e disposizione spaziale (numero, prossimità) controllabili con precisione vengono prodotti utilizzando metodi convenienti. I follicoli negli stampi di agarosio subiscono un supporto meccanico in tutte le direzioni tranne una e vengono coltivati sullo stesso piano focale, consentendo l'imaging timelapse per l'analisi morfocinetica avanzata. La stampa 3D stereolitografica (SLA) è stata utilizzata come metodo accessibile per produrre uno stampo master, seguita da fasi di stampaggio che creano stampi in silicone privi di percolato per colare l'agarosio. Utilizzando il nuovo sistema è stato ottenuto un miglioramento della crescita dei follicoli e dei risultati dell'ovulazione rispetto all'eIVFG tradizionale, senza compromettere la sopravvivenza complessiva dei follicoli, la maturazione o la luteinizzazione57. Questo documento di protocollo descrive i passaggi necessari per personalizzare e produrre stampi di agarosio, come seminare e coltivare follicoli secondari multistrato, elaborare e infine eseguire l'analisi timelapse (Figura 1).

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Protocollo

Tutte le procedure sugli animali relative a questo protocollo sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Northwestern University ed eseguite in conformità con la National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

1. Adattare il design dello stampo master

Questa sezione descrive le prime fasi eseguite durante la fase di progettazione (Figura 1), in cui i micropozzetti personalizzati vengono introdotti in una progettazione assistita da computer (CAD) di uno stampo master per piastre di coltura a 24 pozzetti, chiamato design della base dello stampo master a 24 pozzetti (File supplementare 1). Le dimensioni dei micropozzetti determinano la quantità di supporto e la dimensione massima di crescita dei follicoli, mentre il numero di pozzetti determina il numero massimo di follicoli per stampo di agarosio. Il design dello stampo master adattato verrà quindi utilizzato nella sezione successiva per creare stampi in silicone biocompatibili per la colata di agarosio.

  1. Aprire il file .step di progettazione della base dello stampo master a 24 pozzetti utilizzando il software CAD (Figura 2A).
  2. Selezionare l'area della superficie interna dell'oggetto, quindi accedere alla scheda Solido nell'area di lavoro Progettazione e selezionare Crea schizzo per inserire il progetto di microstampo desiderato (Figura 2Bi).
  3. Introdurre le dimensioni xy desiderate e il numero di micropozzetti e selezionare Termina schizzo sulla barra degli strumenti (Figura 2Bii).
    NOTA: Per i follicoli secondari multistrato, in precedenza veniva utilizzata una forma geometrica dello stadio di 500 x 700 μm57. La risoluzione di stampa può variare a seconda delle resine e delle stampanti SLA utilizzate; Consentono una distanza minima di 400 μm tra i micropozzetti.
  4. Creare i micropozzetti profondi 800 μm utilizzando la funzione di estrusione (fare clic su Solido | Crea | Estrude). Assicurarsi di selezionare l'operazione di taglio , creando la cavità del micropozzetto (Figura 2Biii).
  5. Selezionare un raccordo con raggio di 0,100 mm (fare clic su Design | Solido | Modifica | Filetto) per la parte superiore dei micropozzetti
    NOTA: Per creare un micropozzetto a fondo tondo, utilizzare nuovamente l'operazione di raccordo per il fondo del pozzetto di coltura e fare in modo che il valore del raggio sia uguale al raggio del design del micropozzetto. Ad esempio, quando si progettano pozzetti da 500 μm x 700 μm, selezionare un valore di raggio di 0,250 mm (Figura 2Biv).
  6. Esporta una copia del nuovo progetto dello stampo master in formato .step (clicca su File | esporta).

2. Creazione di contenitori per stampi in silicone

NOTA: Per prevenire la lisciviazione di composti citotossici dalle parti stampate in 3D, verranno realizzati due stampi in silicone biocompatibile. Questa sezione descrive le ultime fasi della fase di progettazione (Figura 1) e si tradurrà nei due contenitori utilizzati per lo stampaggio del silicone. In questo caso, verranno utilizzati tre diversi file CAD, vale a dire il nuovo progetto dello stampo master creato dalla sezione 1 e i contenitori fusi in silicone a 24 pozzetti 1 e 2 (Figura 2Ci-ii e File supplementare 2, File supplementare 3, rispettivamente).

  1. Aprire il file 1.step del contenitore in silicone cast a 24 pozzetti e inserire il nuovo progetto dello stampo master come componente esterno (passare a Solido | Inserisci | Inserisci componente).
    1. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul componente e selezionare Interrompi collegamento per rimuovere il riferimento collegato al nuovo progetto dello stampo principale.
  2. Centrare il nuovo design dello stampo master con il contenitore in silicone a 24 pozzetti 1 superficie, assicurandosi che sia rivolto verso l'interno.
    1. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul nuovo oggetto di progettazione dello stampo principale nel browser e selezionare l'opzione Sposta/Copia .
    2. Selezionate l'operazione Spostamento libero nella sezione Tipo di spostamento (Move Type ) e, se necessario, ruotate l'oggetto di 180° sull'asse x.
    3. Selezionate l'operazione Punto a punto (Point to Point) nella sezione Sposta tipo (Move Type ), con il centro del nuovo oggetto di progettazione dello stampo master come punto di origine e il centro della superficie del contenitore 1 in silicone a 24 pozzetti come punto di destinazione.
    4. Selezionare OK per allineare gli oggetti.
  3. Selezionare l'operazione di taglio con il contenitore come corpo di destinazione e lo stampo master come design del corpo dell'utensile (Figura 2Ciii). Questo crea il contenitore per la prima fase dello stampaggio del silicone (Figura 2Civ).
    NOTA: I micropozzetti che sono stati progettati nella prima sezione sono ora micropilastri che verranno stampati in 3D come descritto nella sezione 3. La stampa SLA è un metodo di produzione additiva; Pertanto, la stampa di micropilastri migliora la risoluzione di stampa rispetto alla stampa di micropozzetti.
  4. Salva ed esporta il nuovo stampo in silicone a 24 pozzetti 1 risultante come file .stl e .step.

3. 3D stampa di contenitori in silicone

NOTA: Questa sezione descrive le prime fasi eseguite durante la fase di produzione (Figura 1) in cui vengono stampati in 3D i nuovi progetti CAD con le caratteristiche di progettazione dei micropozzetti desiderate.

  1. Apri i file .stl del nuovo stampo in silicone a 24 pozzetti 1 e del contenitore in silicone a 24 pozzetti 2 con il software di preparazione della stampa 3D.
  2. Orientare la stampa con i micropilastri rivolti verso l'alto e utilizzare la funzione di foro per creare un'apertura larga 1 mm (Figura 2D). Assicurarsi che questo canale sia aperto sul lato della stampa.
    NOTA: Il foro che evita gli effetti di coppettazione durante la stampa e può essere riempito dopo la stampa, oppure il materiale siliconico in eccesso può essere rimosso dopo il primo stampaggio in silicone.
  3. Stampa i due design dei contenitori con uno spessore dello strato di 25 μm (Figura 3A).
    NOTA: Stampare ogni modello in triplice copia per tenere conto di imperfezioni di stampa o danni durante l'elaborazione.
  4. Rimuovere gli stampi dalla piattaforma di stampa e lavarli con isopropanolo al 95% secondo le istruzioni del produttore. Spruzzare abbondantemente la sezione del micropilastro con isopropanolo al 95% (Figura 3B). Rimuovere l'etanolo residuo con aria compressa.
  5. Lasciare evaporare l'etanolo rimanente per almeno 30 minuti.
    NOTA: In questa fase, il canale di foratura largo 1 mm può essere sigillato. Questo può essere fatto applicando una piccola goccia di resina non polimerizzata con una punta per pipetta p200 all'esterno della stampa. Le forze capillari riempiranno il canale.
  6. Polimerizzare le stampe 3D a 60 °C con luce ultravioletta per 15 minuti.
  7. Ispeziona ogni stampa utilizzando uno stereomicroscopio ed elimina tutte le stampe 3D con imperfezioni (Figura 3C-F). Ispezionare accuratamente ogni stampa visivamente, assicurandosi che tutti i micropilastri siano separati e uniformi nelle dimensioni e nell'aspetto (Figura 3D). Scartare gli stampi master difettosi con micropilastri uniti (Figura 3E).
    NOTA: I problemi più comuni sono i micropilastri o i ponti danneggiati dalla resina non lavata rimasta (Figura 3Fi, ii).
  8. Coprire l'esterno della stampa con parafilm se il canale di foratura non è riempito e conservare fino a nuovo utilizzo.

4. Produzione di stampi in silicone

NOTA: Questa sezione descrive le fasi finali della fase di produzione (Figura 1), in cui avverranno due fasi di stampaggio del silicone. Ciò è necessario per prevenire il rilascio di percolati tossici da parte delle parti stampate in 3D.

  1. Preparare il silicone secondo le istruzioni del produttore, in sintesi:
    1. Mescolare accuratamente il contenuto dei contenitori delle parti A e B , posizionare un becher su una bilancia e versare nel contenitore in un rapporto 1A:1B in peso. Assicurati di avere materiale in eccesso.
    2. Mescolare accuratamente per 3 minuti, assicurandosi di raschiare i lati e il fondo.
    3. Mettere il materiale in un essiccatore sottovuoto e lasciare agire per 5 minuti per eliminare le bolle d'aria intrappolate. Ripetere il degasaggio fino a 2 volte se rimangono bolle d'aria.
  2. Versare il composto con un flusso uniforme nel contenitore dello stampo in silicone 1. Assicurarsi che il livello della miscela sia allo stesso livello della stampa 3D o leggermente inferiore per garantire la planarità dello stampo in silicone (Figura 4Ai, ii).
    1. Rimuovere l'aria intrappolata utilizzando un puntale per pipetta p200 e, se necessario, utilizzare il degasaggio sottovuoto.
  3. Polimerizzare il silicone a temperatura ambiente per almeno 5 ore e preferibilmente durante la notte prima di sformarlo.
  4. Rimuovere il silicone dallo stampo stampato in 3D e confermare visivamente l'integrità dei microstampi utilizzando uno stereomicroscopio (Figura 4Aiii, B). Se necessario, rimuovere il materiale in eccesso dal canale di perforazione (Figura 4Aiv). Scartare gli stampi con micropozzetti a ponte o compromessi (Figura 4C).
  5. Posizionare lo stampo in silicone nel contenitore dello stampo in silicone 2 per la seconda fase di stampaggio del silicone (Figura 4Av). Il contenitore in silicone 2 ha un'apertura di 1 mm nella parete laterale che verrà coperta una volta posizionato lo stampo in silicone.
  6. Spruzzare leggermente lo stampo in silicone con olio minerale sicuro per gli embrioni e rimuovere l'olio in eccesso dai micropozzetti. Questo fungerà da agente distaccante per separare entrambe le parti in silicone dopo l'indurimento.
  7. Ripetere le fasi di miscelazione descritte al punto 4.1 e versare il composto nel contenitore dello stampo in silicone 2. Assicurarsi che il livello della miscela sia inferiore o alla stessa altezza della stampa 3D per garantire la planarità dello stampo in silicone (Figura 4Avi).
  8. Lasciare indurire il silicone a temperatura ambiente per almeno 5 ore, preferibilmente durante la notte, prima di sformarlo.
  9. Rimuovere il silicone dallo stampo stampato in 3D e separare gli stampi in silicone 1 e 2 l'uno dall'altro (Figura 4Avii). Confermare visivamente l'integrità dei micropilastri utilizzando uno stereomicroscopio (Figura 4D). Scartare lo stampo se nei micropozzetti erano presenti bolle o olio in eccesso (Figura 4E).
  10. Lavare lo stampo in silicone con etanolo al 70% e lasciare asciugare all'aria per 30 minuti in una cappa a flusso laminare.
  11. Mettere in una busta di sterilizzazione e in autoclave utilizzando un ciclo a secco per sterilizzare (pressione della camicia: 20 psi, temperatura della camera: 250 °F, tempo di sterilizzazione: 15 min).

5. Preparazione dei terreni di coltura

NOTA: La digestione del tessuto ovarico per l'isolamento e la coltura dei follicoli, la maturazione in vitro degli ovociti e la luteinizzazione richiede sei tipi di terreni: terreni di dissezione (DM), terreni enzimatici (EM), terreni di mantenimento (MM), terreni di crescita (GM), terreni di maturazione (IVM) e terreni di luteinizzazione (LM). La preparazione di questi terreni può essere trovata come precedentemente descritto da Converse et al.38 con una spiegazione dell'importanza dei diversi componenti dei media analizzati da Simon et al.33, e il loro scopo è brevemente menzionato nella Tabella 1.

  1. Preparare il terreno fino a 1 settimana prima e conservarlo a 4 °C.

6. Fusione e stoccaggio di stampi personalizzati di agarosio e coltura di follicoli

NOTA: Questa sezione descrive come fondere stampi di agarosio personalizzati per la coltura dei follicoli dagli stampi in silicone generati nella sezione 4. Gli stampi di agarosio possono essere realizzati e conservati a 4 °C fino a 2 settimane prima della coltura del follicolo.

  1. Posizionare gli stampi in una busta di sterilizzazione e in autoclave utilizzando un ciclo a secco come descritto nella sezione 4.11. Lasciare raffreddare gli stampini prima dell'uso.
  2. Preparare la soluzione di agarosio sciogliendo una soluzione sterile di agarosio all'1,5% (p/v) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) in un forno a microonde o in una piastra calda. Utilizzare un tubo conico sterile che viene posto in un becher con acqua per consentire un riscaldamento più uniforme dell'agarosio e per rallentare la solidificazione della soluzione liquida di agarosio.
  3. Pipettare la soluzione sterile di agarosio in calchi di silicio in una cappa a flusso laminare. Pipettare lentamente e senza intoppi per ridurre al minimo la formazione di bolle e assicurarsi che la parte superiore dello stampo sia piatta e non convessa o concava. La parte superiore durante la colata sarà la parte inferiore dello stampo durante la coltura e dovrebbe essere piatta. Utilizzare circa 600 μl di agarosio per un microstampo per piastra a 24 pozzetti e 85 μl per un microstampo che si inserisce in una piastra a 96 pozzetti.
  4. Lasciare raffreddare i microstampi per ~3 minuti fino a quando non si saranno solidificati. Capovolgere il calco di silicone per espellere i microstampi su una piastra di Petri da 100 mm.
  5. Valutare i microstampi al microscopio per eventuali deformità, tra cui crepe, fusione di micropozzetti o bordi incompleti. Posizionare i microstampi in PBS sterile + 1% Penicillina-Streptomicina e conservare a 4 °C per un massimo di 2 settimane prima dell'uso.
    NOTA: Realizzare più stampi del necessario per tenere conto del degrado nel tempo o dei danni ai microstampi durante il trasferimento tra le piastre.
  6. Equilibrare i microstampi in 750 μL di terreno di manutenzione 2x per almeno 1 ora (totale di due incubazioni) il giorno dell'isolamento del follicolo.
  7. Rimuovere tutti i terreni di manutenzione, aggiungere 750 μL di terreno di coltura e riporre nell'incubatore per 1 ora.
  8. Sostituire con terreni di coltura freschi ed equilibrati prima della semina.

7. Isolamento e coltura dei follicoli secondari tardivi

NOTA: Questa sezione spiega come isolare e seminare i follicoli nei microstampi di agarosio per la coltura dei follicoli. I secondari multistrato vengono coltivati per 8 giorni, devono avere una vitalità superiore all'80% e produrre ovociti maturi. L'isolamento e la coltura dei follicoli secondari sono stati descritti in modo significativo altrove38. L'isolamento e la selezione dei follicoli per l'incapsulamento dell'alginato e per la semina in stampi di agarosio sono coerenti.

  1. Sezionare le ovaie dai topi e rimuoverle dal tessuto adiposo periovarico e dalla borsa. Immergere le ovaie in 2,5 mL di terreno enzimatico e incubare in un agitatore orbitale a 37 °C per 20 minuti come descritto in precedenza57.
  2. Pipettare 2 mL di terreno di mantenimento in una piastra per fecondazione in vitro e metterli in un'incubatrice (37 °C, 5% CO2) prima dell'isolamento del follicolo.
  3. Reazione di spegnimento con 250 μL di FBS. Selezionare i follicoli secondari tardivi dopo l'isolamento enzimatico e trasferirli in una piastra di fecondazione in vitro con DM.
  4. Trasferire i follicoli in una piastra per fecondazione in vitro con terreno di mantenimento pre-bilanciato e metterli in un'incubatrice (37 °C, 5% CO2) per 1 ora.
    NOTA: La dimensione iniziale dei follicoli secondari tardivi è di 150-180 μm con più di due strati di cellule della granulosa presenti.
  5. Aggiungere 750 μl di GM fresco ai microstampi di agarosio e conservare nell'incubatore per prepararsi alla semina. Aggiungere PBS sterile ai pozzetti adiacenti che circondano i microstampi di agarosio per mantenere l'umidità e ridurre al minimo l'evaporazione dei terreni durante il periodo di coltura.
  6. Seme i follicoli in stampi di agarosio che sono stati pre-equilibrati e sono immersi in GM. Trasferire follicoli secondari multistrato di alta qualità in microstampi di agarosio al microscopio utilizzando una punta di stripper da 200 μm. Assicurarsi che 10 follicoli siano trasferiti in ciascun microstampo in una piastra a 24 pozzetti e che ogni follicolo si trovi in un micropozzetto separato ma adiacente.
    1. Piegare la punta dello stripper per consentire una manipolazione e un trasferimento più precisi dei follicoli nei micropozzetti.
    2. Trasferisci rapidamente i follicoli per ridurre al minimo le variazioni di temperatura e pH poiché MM e GM sono tamponati con CO2 .
    3. Assicurarsi che i follicoli all'interno di un microstampo abbiano una dimensione iniziale simile una volta trasferiti tutti e 10 i follicoli.
  7. Riposizionare i microstampi seminati nell'incubatore per almeno 1 ora per consentire ai follicoli di riprendersi prima dell'imaging.
  8. Immagine dei follicoli con ingrandimento 4x e 10x a giorni alterni per quantificare la sopravvivenza dei follicoli e i risultati della crescita.
    NOTA: L'imaging timelapse può anche essere impostato per eseguire misurazioni morfocinetiche e sono descritte più dettagliatamente nella sezione 9.
  9. Cambia il 50% dei terreni di coltura a giorni alterni.
  10. Congelare i terreni esauriti con ghiaccio secco e conservarli a -80 °C. Utilizzare questo terreno condizionato per valutare la produzione di ormoni attraverso gli ELISA di estradiolo.
    NOTA: Se l'OGM viene prodotto il giorno della semina (inizio del periodo di coltura), il terreno può essere conservato a 4 °C e utilizzato per l'intero periodo di coltura.
  11. Rimuovere e congelare a scatto tutti i terreni di coltura (750 μL) all'8° giorno di coltura.
  12. Sostituire i terreni di crescita con i terreni IVM per consentire l'ovulazione in vitro .
    NOTA: L'ovulazione può verificarsi anche con l'imaging timelapse per valutare le caratteristiche di tempistica e rottura.
  13. Rimuovere i complessi cumulo-ovociti (COC) 14-16 ore dopo l'aggiunta del terreno IVM e valutare lo stato di maturazione.
    1. Definire lo stato di maturazione è il seguente: identificare MII per estrusione del primo globulo polare (risultato atteso per ovociti sani), GVBD/MI per mancanza di un corpo polare o di vescicola germinale (maturazione ritardata), GV per nucleo sferico visibile al centro dell'ovocita (mancanza di progressione meiotica) o ovocita degenerato-appiattito e/o scurito.
  14. Opzionale: poiché i parametri del fuso degli ovociti MII, tra cui l'allineamento, la forma e il volume cromosomico, sono strettamente correlati con la qualità degli ovociti e gli esiti embrionali58,59, utilizzali per valutare il successo dell'oogenesi in vitro. Per valutare la morfologia del fuso, fissare e colorare le uova di MII attraverso l'immunocitochimica a montatura intera.
    1. Fissaggio: Fissare le uova in PFA al 3,8% con Triton X-100 allo 0,1% a 37 °C per 20 minuti. Lavare le uova 3 volte in tampone bloccante (PBS con calcio e magnesio (PBS +/+) con il 10% di Tween-20 e lo 0,3% di BSA).
    2. Colorazione del mandrino:
      1. Incubare le uova nel tampone di permeabilizzazione (PBS +/+ con Triton X-100 allo 0,1% e BSA allo 0,3%) per 15 minuti a temperatura ambiente
      2. Risciacquare 2 volte nel tampone bloccante.
      3. Incubare le uova nell'anti-alfa-tubulina coniugata Alexa Fluor 488 a una concentrazione di 1 μg/mL su un bilanciere avvolto in un foglio per 2 ore a temperatura ambiente.
      4. Lavare le uova per 3 x 20 minuti in tampone di blocco prima di montarle su vetrini da microscopio con mezzo di montaggio contenente DAPI.
      5. Per osservare il citoscheletro dell'ovocita, includere la falloidina di rodamina 1:50 durante la colorazione.
    3. Immagini di campioni su un microscopio confocale utilizzando un obiettivo 63x con uno z-stack a una larghezza di 1,0 μm su tutto il mandrino.

8. Applicazioni a valle di stampi personalizzati per agarosio

NOTA: I microstampi di agarosio possono essere utilizzati per l'analisi istologica, consentendo la quantificazione e la localizzazione di diversi geni o proteine di interesse. I microstampi creano un microarray di follicoli che consente di colorare più follicoli in parallelo. La tomografia a coerenza ottica (OCT) può essere eseguita anche senza dover trasferire i follicoli (Figura 1, Applicazione). La tomografia a coerenza ottica è una tecnica di imaging che consente la ricostruzione 3D dei campioni e ha una profondità di penetrazione e una risoluzione più elevate rispetto alla microscopia confocale, consentendo un migliore imaging di campioni 3D come i follicoli coltivati in vitro60.

  1. Per le applicazioni istologiche, preparare una soluzione di agarosio (1,5% p/v) come descritto al punto 6.2.
    1. Rimuovere tutti i terreni che circondano i microstampi di agarosio nel pozzetto e rimuovere con cura i terreni nella cavità del microstampo utilizzando una pipetta p200 agli angoli della cavità.
    2. Pipettare con cura 100 μL di soluzione liquida di agarosio per riempire e sigillare i micropozzetti e la cavità senza agitare i follicoli; Assicurarsi che la parte superiore sia piatta. Rimuovere eventuali bolle con un puntale per pipetta P10 sterile.
    3. Lasciare solidificare l'agarosio a temperatura ambiente per 2 min. Assicurarsi al microscopio che il microstampo sia completamente sigillato.
    4. Fissare i microstampi per una notte a 4 °C con un leggero oscillazione in 750 μL di fissativo (soluzione di Davidson modificata o paraformaldeide al 3,8%).
    5. Aspirare il fissativo e lavare i microstampi sigillati in concentrazioni crescenti di etanolo, iniziando con il 50% e infine il 70% di EtOH.
    6. Processo utilizzando un processatore di tessuti automatizzato che utilizza protocolli di lavorazione standard (Tabella 2) e incorporato in cera di paraffina. Durante l'incorporamento, prendere nota dell'orientamento dei microstampi. Assicurarsi che ci sia cera prima e dopo il campione durante il processo di inclusione per ridurre al minimo la perdita di tessuto durante il sezionamento.
    7. Sezionare in serie i campioni incorporati a 5 μm di spessore e posizionarli su vetrini da microscopio carichi.
    8. Eseguire la colorazione H&E con un coloratore automatico e sigillare con il mezzo di montaggio prima dell'imaging.
  2. Quando si esegue l'OCT, posizionare il microstampo con i follicoli in un piatto da 50 mm contenente terreni IVM.
    1. Per seguire la procedura utilizzata per generare le immagini OCT rappresentative, acquisire l'immagine utilizzando un sistema OCT personalizzato operante all'interno della gamma spettrale della luce visibile con una risoluzione assiale di 1,3 μm e una risoluzione laterale di 9,4 μm61,62.
    2. Scansiona i follicoli in un campo visivo di 1,58 x 1,58 mm2 , composto da 512 linee A e 512 scansioni B, ripetute 2 volte per scansione B e 3 volte per volume.
    3. Elabora le immagini OCT utilizzando ImageJ per visualizzare la struttura 3D dei follicoli e quantificare i volumi.
      1. Carica le immagini in ImageJ come Z-stack trascinando i file nell'applicazione aperta.
      2. Visualizza lo z-stack come un'immagine 3D andando su Plugin|3D|Visualizzatore volumi. Ruota l'immagine 3D per visualizzare diverse angolazioni in diversi punti temporali.
      3. Vai a File| Salva con nome |Tiff per salvare l'immagine nella posizione desiderata.

9. Analisi timelapse della coltura follicolare

NOTA: I follicoli cresciuti nel sistema di coltura senza scaffold risiedono sullo stesso piano focale e sono compatibili con l'imaging timelapse nell'incubatore. L'imaging timelapse può essere avviato dopo la semina dei follicoli nel passaggio 7.7 (Figura 1, Applicazione).

Assicurati che tutte le modifiche siano accurate durante il timelapse. Quindi, passa attraverso l'intera pila dopo ogni passaggio per assicurarti che non ci siano discrepanze nelle misurazioni.

  1. Configurazione timelapse:
    1. Posizionare un cappuccio del focheggiatore/concentratore di luce sul microscopio portatile.
    2. Inserire il microscopio portatile con supporto per montatura nell'incubatrice e collegarlo a un laptop con il software installato.
    3. Posizionare e allineare bene la coltura sotto il microscopio e regolare l'altezza e la messa a fuoco del microscopio in modo che tutti i follicoli siano a fuoco. Utilizzando il bilanciamento automatico del bianco (AWB), scegliere le condizioni di illuminazione ottimali utilizzando il controllo LED, disattivare l'esposizione automatica (AE) e selezionare il tempo di esposizione ottimale.
      NOTA: Assicurarsi che l'allineamento dello stampo sia lo stesso prima e dopo ogni cambio di supporto; In caso contrario, l'analisi dovrà essere effettuata separatamente per ogni 2 giorni di cultura.
    4. Avvia l'imaging timelapse, selezionando una durata di 8 giorni e un intervallo di 30 minuti. Seleziona la foto e spegni il LED quando non scatti foto.
  2. Specificare quali misurazioni verranno registrate nella finestra di dialogo Imposta misurazioni (fare clic su Analizza | imposta misure) prima dell'analisi ImageJ.
    NOTA: Per ulteriori informazioni sulle possibili misurazioni incorporate nel software ImageJ, vedere la guida per l'utente sottosezione 30.763.
  3. Posiziona tutte le immagini in una cartella di analisi separata per avviare l'analisi.
  4. Trascinare la cartella di analisi nel software ImageJ per aprire il timelapse come una pila. Assicurarsi che l'ordinamento numerico dei nomi sia selezionato e se le sequenze di immagini non rientrano nella RAM del computer, selezionare lo stack virtuale.
  5. Usa lo strumento di selezione rettangolare per selezionare un'area in cui sono presenti tutti i follicoli durante il timelapse. Per questo, usa prima l'ultima immagine e scorri la pila per assicurarti che nessuno dei follicoli venga tagliato. Quindi, ritaglia la selezione (vai a Immagine | Ritaglia o Ctrl+Maiusc+X, Figura 5Ai,ii).
  6. Impostare la barra di scala per la pila timelapse (Analizza | Imposta scala). Utilizza l'immagine del giorno 0 realizzata con l'imager e misura tre caratteristiche identificabili come follicoli o micropozzetti. Utilizzare l'immagine dello stesso giorno 0 dallo stack timelapse e definire la scala per una delle misurazioni; Utilizzare le altre due misurazioni per confermare che la scala precisa è impostata.
  7. Allinea tutte le immagini utilizzando il plug-in SIFT (vai a Plugin | Iscrizione | Allineamento lineare della pila con SIFT, (Figura 5Bi, ii). Utilizzare le seguenti impostazioni standard, che possono essere regolate caso per caso: Allineamento lineare della pila con SIFT, initial_gaussian_blur = 1,60 steps_per_scale_octave = 3 minimum_image_size = 64 maximum_image_size = 1024 feature_descriptor_size = 4 feature_descriptor_orientation_bins = 8 più vicino/next_closest_ratio = 0,92 maximal_alignment_error = 25 inlier_ratio = 0,05 expected_transformation=Interpolazione rigida.
  8. Converti lo stack in scala di grigi a 8 bit (Immagine | Tipologia | 8 bit).
  9. Rimuovi lo sfondo utilizzando la sottrazione dello sfondo Rolling Ball (fai clic su Elabora | Sottrarre sfondo, Figura 5Ci,ii) utilizzando le seguenti impostazioni, che possono essere regolate caso per caso: raggio della palla rotante = 70,0 pixel; Seleziona Disabilita levigatura.
  10. Soglia l'immagine (vai a Immagine | Regola | Threshold) per dividere le immagini timelapse in due classi di pixel, utilizzando le seguenti impostazioni: setThreshold(35, 255, "raw"); run("Apply LUT", "stack"); setOption("BlackBackground", true); run("Convert to Mask", "method=Intermodes background=Dark calculate black").
  11. Misurare ogni follicolo singolarmente utilizzando la selezione rettangolare, quindi selezionare la funzione di analisi delle particelle (fare clic su Analizza | Analizza particelle). Utilizzare le seguenti impostazioni: Analizza particelle...", "size= 8000-Infinity display exclude include summarize overlay add composite stack (Figura 5Di,ii).
    1. Prima di salvare i risultati, verificare che il ROI di ciascuna immagine sia accurato (Figura 5Ei, ii). Salva il riepilogo e i risultati in . Formato CSV.
    2. Ripeti l'operazione per tutti gli altri follicoli.

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Risultati

Per determinare se la sopravvivenza e la crescita dei follicoli sono state supportate utilizzando questa nuova tecnologia, come descritto nella sezione 7 del protocollo, i follicoli degli stessi topi sono stati isolati e coltivati in parallelo in microstampi di agarosio o incapsulati in alginato allo 0,5%. Immagini rappresentative di follicoli provenienti da un giorno sì e uno no di coltura hanno dimostrato il normale sviluppo, crescita e formazione di una cavità antrale durante il perio...

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Discussione

La gametogenesi e la maturazione in vitro sono tecnologie chiave per la comprensione fondamentale della biologia degli ovociti, con potenziali applicazioni nella tecnologia di riproduzione assistita, nella conservazione della fertilità e nella conservazione delle specie. I metodi a supporto dell'IVG spesso si basano sulla co-coltura con cellule somatiche per creare ovaie ricostruite30. L'importanza di queste cellule di supporto è ben nota in vivo,

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Child Health and Human Development (R01HD105752 to F.E.D e T32HD094699 to E.J.Z) e dal programma SenNet del NIH Common Fund (U54AG075932 and UH3CA268105 to F.E.D.) e dal Bill & Melinda Gates Foundation Grant (INV-003385 to F.E.D.). In base alle condizioni di concessione della Bill & Melinda Gates Foundation, una licenza Creative Commons Attribution 4.0 Generic è già stata assegnata alla versione del manoscritto accettato dall'autore che potrebbe derivare da questa presentazione.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Materiali e Sostanze Chimiche
  Tubi centrifughe in polistirene da 50 mLGlobe Scientific941-11017-CS
Tubi microcentrifughe da 1,5 mLFisher ScientificMCT-150Per bloccare e conservare i media
Disco da 100 mm, non trattatoFisher Scientific08-757-100D Per realizzare e conservare microstampi di agarosio
100% etanoloMercedes Scientific1200Lavorazione dei tessuti
1000 & micro; L  Punte per pipette, bassa ritenzioneMIDSCIPR-1000BKConsigli culturali 
200 & micro; L  Punte per pipette, bassa ritenzioneMIDSCIPR-200BKConsigli culturali 
Piastra a 24 pozziCorning353047Cultura
Antenne da 35 mmFalcone351008Isolare ovaie e incubare in mezzi enizzatici
95% etanoloMercedes Scientific1210Lavorazione dei tessuti
AgaroseHoeferGR140Micromodelli
Olio Minerale BioXtra, Olio Leggero, Adatto per la coltura di cellule embrionali di topoSigma-AldrichM5310-500MLUtilizzato come agente biocompatibile per lo smoldaggio
Albumina Sieroica Bovina  MP Biomedici103700Media di crescita
Spolverini per la pulizia, 10 oz., confezione da 6Deposito Uffici  110284Aria compressa
Resina V4 trasparente 1 LFormlabs, IncRS-F2-GPCL-04Stampa 3D in resina
Becher Corning in plastica riutilizzabile a bassa forma da 100 mL, polipropilene, graduatoCorning1000P-100Becher per miscelare componenti in silicone & nbsp;
DNAse IQiagen79254Media enzimatici
Ecoflex 00-45 Quasi LiberoSmooth-On, IncB09M8Y9PTVMateriale in silicone
F-12 + GlutaMAXGibco31765-035Media di crescita
Feto bovino fetaleSigmaF-3385Media di crescita
Siero Fetale Bovino (FBS)Siero di piccoPS-FB2Media di dissezione e media enzimatica,   Media di Manutenzione e Supporto Media di maturazione
Fisherbrand  Sacche di sterilizzazioneFisher Scientific01-812-50 Sacche di sterilizzazione
Ormone follicolo-stimolante (FSH)EMD Serono, Inc.Solo Gonal-F Rx Media di crescita e Media di maturazione
Gibco & nbsp; DPBS, calcio, magnesioFisher Scientific14-040-182 Soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco
Gonadotropina corionica umana (hCG)Sigma AldrichC1063-1VLMedia di maturazione
Insulina-transferrina-selenio (ITS)ThermoFisher41400045Media di crescita
Sonde molecolari di Invitrogen Rhodamine PhalloidinFisher ScientificR415Colorazione del citoscheletro dell'uovo
Piatti per la FIVThermo Scientific150260Isolare, selezionare e pre-equilibrare i follicoli
Leibovit'z 15 (L15)Gibco11415-064Media di dissezione e dissezione Media enzimatici
LiberaseSigma Aldrich5401119001Media enzimatici
MEM? + GlutaMAXGibco32561-037Media di Manutenzione,   Media di crescita e Media di maturazione
Fattore di crescita epidermica del topo (EGF)BD in Biologia354010Media di maturazione
Essiccatore Nalgene Garden Polycarbonate Classic DesignThermo Scientific5311-0250Essiccatore a vuoto 
ParaffinaFisher Scientific83-30Lavorazione dei tessuti e lavorazione Incorporamento
Penicillina-streptomicinaGibco15140-122Media di dissezione, mezzi enzimatici e Media di Manutenzione
Punte per spogliarellisteOrigioMXL3-200Cultura
Mezzo di montaggio antifade VECTASHIELD PLUS con DAPILaboratori VectorH-2000Colorazione del nucleo dell'uovo
XyleneMercedes Scientific9840Lavorazione dei tessuti
α-Tubulina (11H10) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Coniugato)Tecnologia di segnalazione cellulare5063SColorazione con tubulina dell'uovo
Equipaggiamento
Build Platform 2Formlabs, IncBP-F3-02-01 Componente della stampante 3D
Dino-Lite Edge AF4915ZTL, USB 2.0Dino-LiteAF4915ZTLImager per l'impostazione timelapse
Forma 3 Serbatoio in resina V2.1 Formlabs, IncRT-F3-02-01Componente della stampante 3D
Stampante 3D Form 3B+Formlabs, IncF3B-P StampanteStampante 3D stereolitografia (SLA) di Formlabs
Cura della forma Formlabs, IncFH-CU-01Piattaforma di polimerizzazione  
Lavaggio di formaFormlabs, IncFH-WA-01Piattaforma per il lavaggio
Bottiglia spray con vaporizzatore a pompaVWR0309-3005Per applicare l'agente smoldante
Focatore/condensatore per luce per la serie Edge (esclusi i modelli T5, T8)Dino-LiteN3C-RComponente dell'imager per l'impostazione del timelapse
Bundle Mount Holder che combina il rack RK-10 e l'estensione del braccio RK-10-EXDino-LiteRK-10AComponente dell'imager per l'impostazione del timelapse
Incorporatore di tessutiLeicaHistoCore ArcadiaPer incorporare micromodelli
Processore di tessutiLeicaTP1020Per processare i microstampi
Incubatore Scuotente 211DS (Scuotendo Orbitale)Labnet InternationalI-5211-DSIncubare ovaie in mezzi enzimatici per il rilascio dei follicoli
Software 
Autodesk FusionAutodesk, IncSoftware di progettazione assistita da computer (CAD). Autodesk offre accesso educativo gratuito tramite il programma Autodesk Education.
DinoCapture 3.0 versione 1.1.1.3 Dino-Lite
ImageJIstituti Nazionali di SaluteAnalizzare immagini OCT e misurare i follicoli
PreFormFormlabs, IncSoftware gratuito di preparazione alla stampa progettato per funzionare con le stampanti stereolitografia (SLA) di Formlabs.

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