È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Modello di glioma circolante per indagini sulla terapia con cellule T del recettore dell'antigene chimerico

406 visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/68881

⸱

17 ottobre 2025

 ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry and Chemical Engineering, Southeast University, 2Department of Immunology, Key Laboratory of Human Functional Genomics of Jiangsu Province, Gusu School, Nanjing Medical University, 3Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, 4Department of Neurosurgery, The Affiliated Brain Hospital of Nanjing Medical University, 5Department of Clinical Laboratory Medicine, Children's Hospital of Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Il presente protocollo stabilisce un modello di glioma circolante mediante iniezione del ventricolo laterale per studiare l'effetto terapeutico della terapia con cellule T del recettore dell'antigene chimerico in vivo.

Abstract

Le cellule tumorali circolanti nel liquido cerebrospinale (CSF) sono un fattore significativo nella recidiva del tumore e nelle metastasi intracraniche nel glioma. Molti studi stanno tentando di identificare strategie efficaci per colpire ed eliminare il tumore circolante nel liquido cerebrospinale. La terapia con cellule T del recettore chimerico dell'antigene (CAR) è stata frequentemente utilizzata per vari tumori circolanti. Tuttavia, la ricerca è limitata a causa della mancanza di un modello di glioma circolante adatto. Qui, un modello di glioma circolante è stato sviluppato e applicato nelle indagini sulla terapia con cellule T CAR. Questo modello è stato costruito utilizzando l'iniezione del ventricolo laterale, che è ampiamente utilizzata nel trattamento locale della malattia intracranica. Le cellule di glioma sono state iniettate nel ventricolo laterale per formare il tumore primario intracranico. I tumori che sono stati eliminati dal ventricolo laterale sono stati utilizzati per indicare il tumore circolante nel liquido cerebrospinale. Il modello è facile da costruire e può essere applicato in vari studi sulla terapia con cellule T CAR del glioma circolante. Di conseguenza, il modello di glioma circolante fornisce un modello unico di metastasi del glioma per studi efficaci di terapia con cellule T CAR del tumore circolante.

Introduzione

Il glioma è il tumore cerebrale maligno primario più comune negli adulti 1,2. I trattamenti attuali, tra cui chirurgia, radioterapia e chemioterapia, mostrano un'efficacia limitata, con una sopravvivenza mediana di soli 14-15 mesi 3,4,5. Le cellule di glioma circolanti nel liquido cerebrospinale svolgono un ruolo cruciale nella recidiva tumorale e nelle metastasi intracraniche 6,7. Pertanto, vi è l'urgente necessità di sviluppare strategie di trattamento più efficaci per eliminare le cellule di glioma circolanti.

Recenti ricerche sul glioma si sono concentrate principalmente sui tumori primari intracranici 8,9. Tuttavia, il problema più importante che deve essere affrontato in clinica è come indirizzare ed eliminare le cellule di glioma circolanti. Pertanto, gli studi sul glioma circolante prima o dopo l'intervento chirurgico richiedono maggiore attenzione. La terapia con cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR) è la strategia più comune utilizzata negli studi sulle cellule tumorali circolanti10,11. Tuttavia, a causa della speciale struttura anatomica dei tumori intracranici, è difficile sviluppare un modello di glioma circolante adatto, che è fondamentale per lo studio del glioma circolante 12,13,14,15,16.

Questo studio ha generato un modello unico di glioma circolante basato sull'iniezione del ventricolo laterale. In questo modello, le cellule di glioma vengono iniettate nel ventricolo laterale e il tumore primario intracranico e il tumore circolante nel liquido cerebrospinale vengono rilevati mediante imaging bioluminescente in vivo e analisi di citometria a flusso nel giorno 10. La terapia CAR-T è stata iniziata quando il carico tumorale nei topi modello di glioma circolante ha raggiunto circa 6,5 × 105p/s. Il carico tumorale è stato monitorato ogni 5 giorni per valutare l'effetto terapeutico delle cellule CAR-T. Questo modello imita lo stato di desquamazione delle cellule tumorali dei pazienti con glioma e può essere utilizzato in vari studi sul glioma circolante.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali in questo studio sono stati tutti approvati e supervisionati dall'Institutional Review Board e dal Comitato Etico Animale dell'Università di Medicina di Nanchino (IACUC-1905048). Per il presente studio sono stati utilizzati topi femmina C57BL/6J, di età compresa tra 6 e 8 settimane. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione degli animali

  1. Alloggiare i topi in una barriera, ciclo luce/buio di 12 ore/12 ore, temperatura ambiente di 24 °C e umidità relativa del 50% della gabbia.
  2. Pesare i topi e anestetizzarli (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati) con un'iniezione intraperitoneale di 50 mg/kg di pentobarbital sodico e 10 mg/kg di xilazina17.
    NOTA: La combinazione di pentobarbital sodico e xilazina è ampiamente utilizzata nelle procedure di iniezione stereotassica del topo. Una corretta anestesia è stata confermata dalla mancanza di risposta a un pizzicamento del dito del piede, assicurando che l'animale fosse completamente incosciente prima dell'intervento chirurgico. Per prevenire la secchezza e il danno corneale, durante l'anestesia è stato applicato un unguento oftalmico veterinario sugli occhi.
  3. Rimuovere i peli sulla testa di un topo con un rasoio per animali da laboratorio e fissare la testa e gli arti del topo sull'apparato stereotassico.
  4. Sterilizzare la testa del topo usando lo iodoforo con un batuffolo di cotone e coprire il resto del corpo del topo con l'asciugamano chirurgico sterile.
  5. Tagliare il cuoio capelluto di circa 1 cm lungo la linea mediana sulla parte superiore della fronte destra con un bisturi.
    NOTA: Tutti gli strumenti chirurgici devono essere adeguatamente sterilizzati prima dell'uso per prevenire l'infezione. Prestare attenzione a maneggiare gli strumenti con cautela per evitare lesioni e tutte le procedure devono essere eseguite in un ambiente sterile.
  6. Regolare la clip nasale e l'asta auricolare, assicurandosi che la differenza di altezza dell'asse Z tra la sutura lambda e la bregma sia inferiore o uguale a 0,05 mm.

2. Costruzione del modello di glioma circolante

  1. Segna il punto a 1,5 mm sul lato destro della linea mediana e a 1,1 mm sul lato posteriore della bregma usando un batuffolo di cotone imbevuto di violetta di genziana (coordinate: AP -1,1 mm, ML -1,5 mm da bregma).
  2. Utilizzando un trapano cranico in miniatura con un diametro di 0,5 mm, praticare dei fori in corrispondenza delle coordinate target per esporre la dura madre.
  3. Risciacquare con soluzione fisiologica per rimuovere i detriti ossei.
  4. Prelevare 5 μL di sospensione di cellule tumorali utilizzando una microsiringa con tappo limitatore di profondità (GL261-Luc-Gfp, 1×105 cellule/μL in PBS contenente lo 0,1% di BSA).
  5. Inserire l'ago a una velocità di 0,2 mm/s a una profondità di 3,0 mm e riportare l'ago di 0,5 mm, fare una pausa di 10 s per stabilizzare la pressione dei tessuti.
  6. Iniettare le cellule a 1 μL/min utilizzando una pompa di microiniezione calibrata, con un tempo di permanenza di 10 minuti dopo l'iniezione per ridurre al minimo il riflusso.
  7. Estrarre lentamente la microsiringa, applicare pressione sul sito di iniezione con un batuffolo di cotone sterile per 30-60 s.
  8. Sutura il cuoio capelluto con sutura chirurgica riassorbibile (6-0) e disinfettare nuovamente l'incisione con iodoforo.
  9. Posiziona il mouse su un termoforo a 37 °C controllato con precisione per il riscaldamento e monitora il suo stato di salute.
  10. Rimetti il topo in una gabbia pulita dopo aver dimostrato un riflesso raddrizzante sostenuto e una locomozione spontanea.
  11. Visualizzare il topo con un sistema di imaging bioluminescente in vivo (IVIS Spectrum) per rilevare il tumore trapiantato il 10° giorno dopo la portatura del tumore.
  12. Iniettare nel topo per via intraperitoneale con sale di potassio D-luciferina (150 mg/kg).
    NOTA: Diluire il sale di potassio D-Luciferina utilizzando D-PBS sterile.
  13. Indurre l'anestesia utilizzando isoflurano al 2% in 1 L/min O2 durante il periodo di attesa di 10 minuti.
    NOTA: L'isoflurano deve essere utilizzato in una cappa chimica ventilata per ridurre al minimo l'esposizione ai vapori anestetici. Questo per garantire la sicurezza sia degli animali che dei ricercatori durante la procedura.
  14. Mantenere l'anestesia all'1,5% di isoflurano attraverso il cono nasale.
  15. Esegui l'imaging bioluminescente utilizzando IVIS Spectrum.
  16. Eseguire la raccolta del liquido cerebrospinale perforando la cisterna cerebellulare nel topo.
    NOTA: Il liquido cerebrospinale è stato raccolto perforando la cisterna cerebellulare midollare nei topi in anestesia con isoflurano. Tutte le procedure, tra cui l'anestesia, l'esposizione chirurgica e la raccolta dei campioni, sono state eseguite in condizioni SPF per ridurre al minimo la contaminazione e il rischio di infezione. I topi sono stati posti in posizione prona su un telaio stereotassico e la cisterna magna è stata accuratamente esposta al microscopio da dissezione. Un ago per siringa Hamilton da 27 g è stato utilizzato per perforare la cisterna e raccogliere il liquido cerebrospinale utilizzando una tecnica a mano libera. Da ciascun topo sono stati ottenuti circa 5-10 μL di liquido cerebrospinale trasparente. Per ridurre ulteriormente il rischio di infezione, il sito chirurgico è stato sterilizzato con Iodophor prima della puntura e tutti gli strumenti chirurgici sono stati sterilizzati in autoclave. Dopo la raccolta del liquido cerebrospinale, il sito di puntura è stato compresso delicatamente con cotone sterile per fermare qualsiasi perdita di liquido. I topi sono stati quindi posizionati su un cuscinetto riscaldante e monitorati continuamente fino al completo recupero dall'anestesia. Sono stati somministrati analgesici postoperatori per alleviare il disagio. Gli animali sono stati osservati quotidianamente per almeno tre giorni consecutivi per garantire l'assenza di sintomi neurologici o segni di infezione.
  17. Eseguire la citometria a flusso per rilevare le cellule tumorali nel liquido cerebrospinale. La popolazione GFP+ rappresenta le cellule tumorali.
    NOTA: La linea cellulare di glioma murino GL261 è stata ingegnerizzata per trasportare la luciferasi (Luc). Quando il valore di fluorescenza raggiunge ~5 × vengono rilevate cellule tumorali 105p/sand nel liquido cerebrospinale, la procedura ha successo. Il software di imaging utilizzato era Living Image 4.5.2 e i parametri di imaging erano impostati su Luminescente.
  18. Selezionare i topi con successo nella procreazione del tumore per valutare l'efficacia terapeutica delle cellule CAR-T.

3. Trattamento del glioma circolante mediante iniezione di cellule CAR-T nel ventricolo laterale

  1. Quando la dimensione del tumore nei topi modello di glioma circolante diventa ~6,5 × 105 p/s, selezionare questi topi per il trattamento CAR-T.
  2. Pesare i topi modello di glioma circolanti e anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di 50 mg/kg di pentobarbital sodico e 50 mg/kg di xilazina.
  3. Ripetere la procedura dei passaggi 1.3-1.5.
  4. Separare il cuoio capelluto e il cranio e individuare con precisione il foro di perforazione praticato durante la costruzione del modello di glioma circolante e seguire la procedura menzionata nei passaggi 2.2-2.3.
  5. Aspirare 10 μl di sospensione di cellule CAR-T con una micro siringa, inserire con cautela l'ago nel ventricolo laterale del topo, regolare la profondità di iniezione utilizzando l'apparato stereotassico e somministrare lentamente la soluzione di cellule CAR-T.
    NOTA: Coerentemente con l'iniezione di cellule GL261, le cellule CAR-T sono state iniettate nel ventricolo laterale destro (coordinate: AP -1,1 mm, ML -1,5 mm da bregma), con una profondità di iniezione di 2,5 mm. Il gruppo di controllo è stato trattato con PBS invece che con cellule CAR-T.
  6. Trattenere l'ago per 10 minuti, quindi rimuovere lentamente l'ago e premere leggermente il punto di iniezione con una garza sterile per evitare qualsiasi sanguinamento dopo aver completato l'iniezione. Sutura il cuoio capelluto con sutura chirurgica riassorbibile (6-0) e disinfettare l'incisione.
  7. Posiziona il mouse su un termoforo a 37 °C controllato con precisione per il riscaldamento e monitora il suo stato di salute.
  8. Rimetti il topo in una gabbia pulita dopo aver dimostrato un riflesso raddrizzante sostenuto e una locomozione spontanea.
  9. Eseguire l'imaging bioluminescente in vivo per monitorare la crescita dei tumori nei topi. L'imaging ottico consente di valutare l'efficacia terapeutica delle cellule CAR-T.
  10. Pesare i topi a giorni alterni ed eseguire l'imaging BLI ogni 5 giorni per monitorare in modo più accurato la crescita del tumore fino al raggiungimento dell'endpoint terminale.
  11. Eutanasia del topo e fissare il tessuto cerebrale in paraformaldeide al 4% per 24-48 ore.
  12. Incorporare i tessuti nella paraffina e sezionarli in fette spesse 5 μm.
  13. Deparaffinare le sezioni, reidratarle con alcoli graduati, colorare con ematossilina, controcolorare con eosina e montare le sezioni con un vetrino coprioggetti.
    NOTA: Per il presente studio, l'endpoint terminale era il giorno 30 e i topi sono stati soppressi con un sovradosaggio di pentobarbital sodico con un'iniezione intraperitoneale. Le carcasse di topo sono state consegnate al Medical Experimental Animal Center dell'Università di Medicina di Nanchino per lo smaltimento. Gli aghi scartati sono stati posti in un contenitore per oggetti taglienti e consegnati al Dipartimento di Gestione dei Laboratori e delle Attrezzature dell'Università di Medicina di Nanchino per lo smaltimento centralizzato.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Il diagramma schematico del modello di glioma circolante per la terapia CAR-T è mostrato nella Figura 1. Le cellule CAR-T sono state iniettate nel ventricolo laterale utilizzando una microsiringa per dimostrare il loro effetto terapeutico. Questo metodo consente la consegna diretta delle cellule CAR-T al cervello, mirando alle cellule di glioma circolanti. La procedura di iniezione è stata eseguita l'11° giorno, dopo l'impianto delle cellule GL261 nel ventric...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Il modello di glioma circolante stabilito in questo studio utilizzando l'iniezione del ventricolo laterale fornisce un progresso significativo, offrendo diversi vantaggi rispetto ai modelli esistenti. La tecnica di iniezione del ventricolo laterale è altamente riproducibile e consente una modellazione coerente del tumore in un lasso di tempo relativamente breve. Questo lo rende uno strumento prezioso per i ricercatori che cercano di studiare la disseminazione delle cellule tumorali nel l...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo studio è stato finanziato dalla National Natural Science Foundation of China (82230059), dal Jiangsu Provincial Key Research Development Program of China (BE2022770).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Sutura chirurgica riassorbibileShanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LtdR611
CAR-TBiolaboratori creativi
D-luciferina sale di potassioMCEHY-12591B
GL261-Luc-GfpShanghai Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co., Ltd.ZQ0932
Sistema di imaging bioluminescente in vivoTanonTanon ABL X6
Rasoio per animali da laboratorioBeyotime BiotecnologieStampante FS600
TopiAnimal Core Facility dell'Università di Medicina di Nanchino
Pompa per microiniezioneRWDR462
MicrosiringaHamilton87943
Mini trapano cranicoRWD78001
Pentobarbital sodico ChemSrc57-33-0
Apparato stereotassicoRWD68043
XilazinaChemSrc7361-61-7

Riferimenti

  1. Lim, M., Xia, Y., Bettegowda, C., Weller, M. Current state of immunotherapy for glioblastoma. Nat Rev Clin Oncol. 15 (7), 422-442 (2018).
  2. Weller, M., et al. Glioma. Nat Rev Dis Primers. 10 (1), 33(2024).
  3. Van Den Bent, M. J., et al. Primary brain tumours in adults. Lancet. 402 (10412), 1564-1579 (2023).
  4. Capper, D., et al. Eano guideline on rational molecular testing of gliomas, glioneuronal, and neuronal tumors in adults for targeted therapy selection. Neuro Oncol. 25 (5), 813-826 (2023).
  5. Nicholson, J. G., Fine, H. A. Diffuse glioma heterogeneity and its therapeutic implications. Cancer Discov. 11 (3), 575-590 (2021).
  6. Schaff, L. R., Mellinghoff, I. K. Glioblastoma and other primary brain malignancies in adults: A review. JAMA. 329 (7), 574-587 (2023).
  7. Wang, A. P. A review of glioblastoma and other primary brain malignancies. JAMA. 330 (2), 188-189 (2023).
  8. Steeg, P. S. The blood-tumour barrier in cancer biology and therapy. Nat Rev Clin Oncol. 18 (11), 696-714 (2021).
  9. Sun, S., et al. Targeting golph3l improves glioblastoma radiotherapy by regulating Sting-NLRP3-mediated tumor immune microenvironment reprogramming. Sci Transl Med. 17 (788), eado0020(2025).
  10. Bagley, S. J., et al. Intrathecal bivalent CAR-T cells targeting EGFR and IL-13Rα2 in recurrent glioblastoma: Phase 1 trial interim results. Nat Med. 30 (5), 1320-1329 (2024).
  11. Nikanjam, M., Kato, S., Kurzrock, R. Liquid biopsy: Current technology and clinical applications. J Hematol Oncol. 15 (1), 131(2022).
  12. Akhoundi, M., Mohammadi, M., Sahraei, S. S., Sheykhhasan, M., Fayazi, N. CAR T cell therapy as a promising approach in cancer immunotherapy: Challenges and opportunities. Cellular Oncol. 44 (3), 495-523 (2021).
  13. Das, A. K., et al. T-cell therapy: A potential treatment strategy for pediatric midline gliomas. Acta Neurol Belgica. 124 (4), 1251-1261 (2024).
  14. Lin, H. L., Cheng, J. L., Mu, W., Zhou, J. F., Zhu, L. Advances in universal CAR-T cell therapy. Front Immunol. 12, 744823(2021).
  15. Lin, Y. J., Mashouf, L. A., Lim, M. CAR-T cell therapy in primary brain tumors: Current investigations and the future. Front Immunol. 13, 817296(2022).
  16. Zhu, Y. X., Feng, J. G., Wan, R. X., Huang, W. H. CAR T cell therapy: Remedies of current challenges in design, injection, infiltration and working. Drug Design Develop Ther. 17, 1783-1792 (2023).
  17. Aswendt, M., Adamczak, J., Couillard-Despres, S., Hoehn, M. Boosting bioluminescence neuroimaging: An optimized protocol for brain studies. Plos One. 8 (2), e55662(2013).
  18. Vaughn-Beaucaire, P., Choi, M. J., Liang, O. L., Lawler, S. E. Intracranial CAR-T cell delivery in glioblastoma patients. Trends Cancer. 10 (6), 478-480 (2024).
  19. Choi, B. D., et al. Intraventricular carv3-team-e T cells in recurrent glioblastoma. New England J Med. 390 (14), 1290-1298 (2024).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Terapia con cellule CAR Ttumore del liquido cerebrospinalemetastasi da gliomainiezione nel ventricolo lateraletumore intracranicorecidiva tumoralecellule tumorali circolantimetastasi intracraniche
Contattaci
Raccomanda alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.