Valutazione dell'eccitabilità e della modulazione dell'eccitabilità della corteccia motoria primaria abbinando la stimolazione magnetica transcranica all'elettromiografia

Summary

Qui, presentiamo un protocollo che delinea la metodologia per valutare l'eccitabilità della corteccia motoria primaria e la modulazione dell'eccitabilità utilizzando la stimolazione magnetica transcranica (TMS) abbinata all'elettromiografia (EMG).

Abstract

Descriviamo un protocollo per valutare l'eccitabilità della corteccia motoria e la sua modulazione, attraverso l'uso accoppiato di elettromiografia (EMG) e stimolazione magnetica transcranica ripetitiva (TMS) della corteccia motoria primaria (M1). Le registrazioni EMG utilizzano un sistema costruito su misura e gli elettrodi di superficie sono posizionati sopra il primo muscolo interosseo dorsale destro (FDI), con un elettrodo di terra sul gomito sinistro. La TMS viene eseguita utilizzando uno stimolatore magnetico con una bobina a forma di otto, guidato da un sistema di neuronavigazione. L'hotspot del motore per l'FDI viene identificato applicando sistematicamente singoli impulsi TMS durante la regolazione del posizionamento della bobina e viene utilizzato come bersaglio per tutte le procedure TMS. La soglia del motore a riposo (rMT) è definita come l'intensità minima richiesta per suscitare potenziali evocati motori (MEP) ≥ 50 μV nella registrazione EMG, in almeno 5 prove su 10, mentre la soglia motoria attiva (aMT) è l'intensità minima necessaria per evocare MEP ≥ 200 μV in almeno 5 impulsi su 10 mentre il partecipante mantiene il 10-20% della massima attivazione muscolare volontaria. L'eccitabilità corticale al basale è definita come l'ampiezza media MEP ottenuta da 40 singoli impulsi TMS applicati al 120% di rMT, con impulsi erogati a intervalli casuali (6-10 s). La modulazione dell'eccitabilità della corteccia motoria si ottiene utilizzando un protocollo di stimolazione theta-burst intermittente (iTBS) (triplette di impulsi a 50 Hz, 80% aMT, 5 Hz per 2 s on/8 s off, ripetuto 20 volte; 600 impulsi in totale). La modulazione dell'eccitabilità viene valutata attraverso la ripetizione delle misurazioni dell'ampiezza MEP in quattro punti temporali post-stimolazione: immediato (T0), 10 min (T10), 20 min (T20) e 30 min (T30). Questo protocollo garantisce una valutazione precisa e riproducibile dell'eccitabilità della corteccia motoria e cattura il picco degli effetti modulatori derivanti da iTBS.

Introduction

La stimolazione magnetica transcranica (TMS) è una tecnica di neurostimolazione non invasiva che induce un campo magnetico in grado di penetrare nel cuoio capelluto e nel cranio, suscitando l'attività neuronale al raggiungimento del tessuto corticale¹. La TMS consente la valutazione in vivo della neurofisiologia del sistema nervoso centrale (SNC) nell'uomo ^2,3,4. Quando viene somministrata in treni ripetuti (TMS ripetitiva o rTMS) a specifiche regioni corticali, la TMS può indurre cambiamenti nell'eccitabilità del bersaglio corticale che si estendono oltre la durata della stimolazione, a seconda dei parametri del protocollo che è stato applicato⁵. La TMS a impulso singolo è comunemente impiegata per misurare l'eccitabilità corticale e, se applicata pre e post rTMS, consente di quantificare la modulazione dell'eccitabilità corticale indotta dalla TMS ^2,3,4. La corteccia motoria primaria (M1) è stata uno dei principali bersagli di tali protocolli, in quanto il suo output funzionale può essere facilmente quantificato attraverso registrazioni elettromiografiche (EMG) ^6,7. Rispetto ad altre tecniche neurofisiologiche e di neuroimaging, come l'elettroencefalografia (EEG) e la risonanza magnetica funzionale (fMRI), TMS-EMG offre maggiori vantaggi per l'implementazione clinica. L'EEG richiede un'ampia configurazione degli elettrodi, un'attenta gestione degli artefatti e una sofisticata elaborazione del segnale⁸, mentre la fMRI comporta costi più elevati, accessibilità limitata e fornisce una risoluzione temporale inferiore⁹. TMS-EMG si basa su registrazioni EMG di superficie relativamente semplici, con analisi incentrate su metriche semplici e oggettive come l'ampiezza e la latenza del potenziale evocato motorio (MEP). Questa semplicità nell'acquisizione e nell'elaborazione, combinata con tempi di configurazione più brevi e minori esigenze infrastrutturali, rende il TMS-EMG particolarmente adatto per la traduzione nella pratica clinica, dove sono richiesti biomarcatori rapidi, affidabili e riproducibili¹⁰.

Le misure di modulazione dell'eccitabilità corticale sono considerate indicatori indiretti della neuroplasticità, definita come la capacità del cervello di subire cambiamenti funzionali e strutturali in risposta a stimoli intrinseci o estrinseci^11,12. Alterazioni della neuroplasticità sono state implicate in varie condizioni neuropsichiatriche, come il disturbo depressivo maggiore (MDD)13,14,15,16. Data la capacità di sondare i meccanismi neuroplastici, in vivo, e l'applicabilità pratica in contesti clinici, la valutazione della modulazione dell'eccitabilità corticale derivata da TMS-EMG è stata studiata come potenziale biomarcatore per i disturbi neuropsichiatrici 17,18,19. Queste misure possono essere promettenti sia come biomarcatore diagnostico¹⁸ che come predittore degli esiti del trattamento^14,15. La TMS a impulsi singoli o accoppiati viene normalmente erogata a intensità espresse come percentuale della soglia motoria a riposo (rMT), ovvero l'intensità minima necessaria per generare una risposta motoria (rMT; comunemente 110-130% rMT), con protocolli che spesso impiegano 20-40 impulsi per stimare in modo affidabile l'eccitabilità corticospinale e diverse centinaia di impulsi per valutare la modulazione pre e post intervento, in diversi punti temporali²⁰. Gli intervalli tra gli impulsi (IPI) dovrebbero generalmente essere di >4 s per ridurre al minimo gli effetti del carry-over e garantire l'indipendenza dei successivi MEP²¹. Quando vengono utilizzati per la modulazione dell'eccitabilità corticale, i protocolli si basano più spesso sulla rTMS a bassa frequenza (rTMS; ≈ 1 Hz, 600-1800 impulsi) o sulla stimolazione theta-burst continua (cTBS; 3 impulsi a 50 Hz, ripetuti ogni 200 ms, continuamente per 40 s) per indurre effetti collaterali inibitori. Per facilitare l'eccitabilità corticale, i protocolli si basano più spesso sulla rTMS ad alta frequenza (rTMS; ≥ 5 Hz, tipicamente 5-20 Hz, 600-2000 impulsi) o sulla stimolazione theta-burst intermittente (iTBS)²². L'iTBS consiste tipicamente di 600 impulsi erogati come raffiche di 3 stimoli a 50 Hz, ripetuti a 5 Hz per 2 s, con treni applicati in modo intermittente ogni 10 s, a intensità intorno all'80% della soglia del motore attivo (aMT). Questo modello è diventato il più ampiamente adottato sia per scopi sperimentali che clinici, grazie alla sua efficienza, durata più breve e robusta facilitazione della plasticità corticale^23,24.

Tuttavia, l'utilità clinica rimane limitata da sfide metodologiche irrisolte. Gli sforzi per affrontare queste sfide, principalmente esaminando e migliorando l'affidabilità delle misurazioni, hanno prodotto risultati incoerenti 25,26,27,28,29. Queste incongruenze possono essere attribuite, almeno in parte, a sostanziali insidie metodologiche e all'eterogeneità tra gli studi, inclusa la variabilità nei parametri rTMS, dove, ad esempio, il numero di impulsi varia da 20 a 1800 impulsi nei paradigmi a bassa frequenza²² e da treni iTBS di 600 impulsi a versioni modificate di 1200 impulsi³⁰. Inoltre, gli studi senza neuronavigazione hanno mostrato variabilità nell'ampiezza della MEP e minori effetti modulatori di un protocollo rTMS rispetto ai protocolli con neuronavigazione³¹. Anche le dimensioni del campione negli studi pubblicati sono state relativamente modeste, spesso tra 10 e 25 partecipanti, limitando la potenza statistica³². Inoltre, sono stati implementati approcci statistici limitati per valutare l'affidabilità, con alcuni studi che si basano su misure diverse dal coefficiente di correlazione intraclasse (ICC)^24,33, che è generalmente considerato l'indice più appropriato per l'affidabilità del test-retest²⁶.

Anche i protocolli per l'acquisizione e l'analisi dell'eccitabilità corticale con paradigmi TMS-EMG possono contribuire a un'ulteriore variabilità. Fattori metodologici specifici, come il numero di impulsi TMS somministrati, possono produrre una scarsa affidabilità, con stime basate su meno di 20 MEP, mentre una media di ≥30 MEP fornisce una misura stabile dell'eccitabilità corticospinale. Allo stesso modo, è stato dimostrato che l'IPI influenza l'eccitabilità con intervalli di 2 s o meno, inducendo cambiamenti nell'eccitabilità corticale dovuti agli effetti cumulativi della stimolazione, mentre intervalli più conservativi di oltre 4 s riducono questi fattori confondenti²¹. Le tecniche di acquisizione EMG^34,35 possono anche influenzare l'affidabilità della misurazione, ad esempio, con la configurazione bipolare che offre una migliore selettività spaziale e una ridotta contaminazione dall'attività dei muscoli vicini rispetto a una configurazione monopolare^34,35. La standardizzazione dei protocolli di acquisizione ed elaborazione dei dati è quindi essenziale per migliorare la valutazione della modulazione dell'eccitabilità corticale e per determinarne la stabilità, un attributo critico di qualsiasi biomarcatore affidabile³⁶.

Pertanto, per perseguire l'uso di misure di modulazione dell'eccitabilità corticale come marcatori candidati per la valutazione neurobiologica e per stabilire la loro affidabilità per l'applicazione clinica, presentiamo un protocollo risultante da un approccio sistematico basato sulle migliori evidenze disponibili nel campo per minimizzare il potenziale impatto dell'eterogeneità metodologica e per garantire una misurazione accurata e riproducibile dell'eccitabilità della corteccia motoria e della sua modulazione^{37, 38}. Ciò includeva l'implementazione di appropriati protocolli di acquisizione EMG³⁴, l'uso di sistemi di neuronavigazione³⁹, la raccolta di un numero sufficiente di deputati MEP²⁰, l'impiego di IPI²¹ adeguati e la segnalazione completa delle procedure di acquisizione e dei metodi di elaborazione del segnale³⁴. I nostri risultati hanno dimostrato una migliore stabilità del segnale rispetto alle migliori pratiche esistenti in letteratura, contribuendo così al rigore metodologico necessario per lo sviluppo di un robusto biomarcatore neurofisiologico.

Protocol

Le procedure qui descritte sono state sviluppate per raccogliere i dati riportati da Seybert et ^al.37 e Faro Viana et ^al.38 Tutti i partecipanti hanno fornito il consenso informato scritto prima della partecipazione, spiegando lo scopo dello studio, le procedure, i rischi e il loro diritto di ritirarsi in qualsiasi momento. Il protocollo è stato approvato dai Comitati Etici del Centro per l'Ignoto Champalimaud e condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. L'uso di questo protocollo in altri studi o sedi deve avvenire solo dopo aver ottenuto l'approvazione dai comitati etici locali competenti e/o da altre autorità competenti. Prima della TMS dovrebbe essere applicata una lista di controllo di sicurezza standardizzata per ridurre al minimo il rischio di effetti collaterali indesiderati, utilizzando le linee guida internazionali^40,41 come quadro di riferimento che può essere adattato a specifici contesti di studio. Il protocollo è progettato per una durata di ~1 h 15 min (Figura 1).

1. Requisiti di configurazione e preparazione

1. Assicurarsi che due tecnici siano disponibili per condurre in modo ottimale la sessione, in cui uno applicherà le procedure TMS e l'altro fornirà supporto nei passaggi aggiuntivi.
2. Assicurarsi che siano disponibili le seguenti apparecchiature: un sistema di neuronavigazione; una sedia comoda; un dispositivo EMG con i rispettivi contatti ed elettrodi; uno stimolatore TMS con una bobina a forma di 8, che consente l'input di iTBS, protocolli a impulso singolo e una connessione con il sistema di neuronavigazione ed EMG. Assicurarsi che siano disponibili uno o due computer per consentire l'osservazione simultanea del software EMG e del software di neuronavigazione. Assicurarsi che il computer disponga di un ricettore di segnale Bluetooth per ricevere il segnale EMG.
3. Assicurarsi che siano disponibili i seguenti materiali di consumo: impacchi di alcol e garze; carta vetrata ad acqua per pulire la pelle dove verranno posizionati gli elettrodi in gel; una cuffia per il partecipante; e tappi per le orecchie sia per il partecipante che per i tecnici.
4. Iniziare la preparazione della configurazione circa 30 minuti prima dell'arrivo del partecipante, per configurare correttamente il sistema di neuronavigazione, la scheda EMG e la macchina TMS, nonché il software necessario per l'acquisizione dei dati fisiologici.
5. Preparare il sistema EMG.
   1. Assicurarsi che la scheda EMG sia completamente carica - se applicabile - e preparare i rispettivi contatti - uno come riferimento (unipolare - da posizionare sul gomito sinistro) e l'altro sul muscolo bersaglio per la registrazione (bipolare - da posizionare sul primo interosseo dorsale destro). È necessario un cavo aggiuntivo per sincronizzare l'uscita dell'impulso TMS con il segnale EMG, collegando il dispositivo TMS alla scheda EMG.
   2. Collegare gli elettrodi di argento/cloruro d'argento (Ag/AgCl) di grado medico ai contatti (saranno necessari 3 elettrodi). Inoltre, collegare un cavo dalla macchina TMS alla scheda EMG per emettere il segnale di trigger di ciascun impulso TMS.
   3. Per il dispositivo EMG interno, spelare il velcro su una superficie stabile. Inserire i contatti nel dispositivo EMG nei rispettivi punti di ingresso.
   4. In uno dei monitor/computer, aprire il software BONSAI⁴² e il rispettivo script di acquisizione dati EMG. Premere il pulsante di avvio , solo quando si è pronti per l'acquisizione dei dati (per ulteriori dettagli, vedere File supplementare 1, passaggio 1).
6. Preparare il dispositivo TMS.
   1. Definire il protocollo di valutazione dell'eccitabilità nel dispositivo TMS. Questo è composto da 40 impulsi singoli, al 120% di rMT, con un IPI casuale di almeno 6 s per evitare effetti di trascinamento dallo stimolo precedente.
   2. Inserire nel dispositivo un protocollo iTBS seguendo a priori i parametri di stimolazione indicati: triplette di impulsi a 50 Hz, 80% aMT, 5 Hz per 2 s on/8 s off, ripetuto 20 volte, 600 impulsi totali.
   3. Applicare strisce di carta in tutte le parti dello schermo della macchina TMS in cui è visibile la massima potenza di stimolazione (MSO - %) in modo che il tecnico sia accecato durante la valutazione rMT e aMT (per ulteriori dettagli, vedere il file supplementare 1, passaggio 2).
7. Preparare il sistema di neuronavigazione ANT Neuro per la TMS.
   1. Assemblare i componenti hardware necessari. Questi includono la telecamera di tracciamento a infrarossi, l'archetto del partecipante con marcatori riflettenti, uno strumento puntatore, una scheda di calibrazione (per la bobina TMS) e un tracker a bobina (un dispositivo circolare che si collega alla bobina per il tracciamento della posizione in tempo reale).
   2. Posiziona la fotocamera sul treppiede e posizionala in una posizione tale da avere una linea di vista libera rispetto a tutti gli altri componenti della neuronavigazione durante l'intera sessione.
   3. Posizionare il tracker e la scheda di calibrazione della bobina sulla bobina TMS.
   4. Aprire il software del sistema di neuronavigazione, inserire l'ID del partecipante e calibrare i componenti di neuronavigazione (per ulteriori dettagli, vedere il file supplementare 1, passaggio 3).

2. Preparazione del partecipante

1. Una volta arrivato il partecipante, valutare la sicurezza per l'applicazione della TMS attraverso l'uso di un questionario e/o di un'intervista strutturata basata sulle linee guida pubblicate^40,41. Includi elementi riguardanti l'anamnesi di disturbi psichiatrici e neurologici, perdita di coscienza, problemi di udito, nonché la presenza di impianti metallici o magnetici, farmaci in corso e stato di gravidanza. Procedere con il protocollo solo se non vengono sollevati problemi di sicurezza.
2. Far accomodare il partecipante su una sedia comoda in cui entrambi gli avambracci possono essere posizionati in posizione di riposo. Assicurarsi che il partecipante si trovi a un'angolazione appropriata affinché la bobina sia posizionata comodamente sulla sua testa.
3. Chiedere al paziente di rimuovere eventuali occhiali, fermagli per capelli o spille, nonché eventuali orecchini o altri dispositivi metallici e/o elettronici. Fornire tappi per le orecchie e assicurarsi che siano posizionati correttamente e stabilmente. Chiedi al partecipante di rimanere sveglio, silenzioso e rilassato. Assicurarsi che il partecipante sia sempre sveglio per ridurre, per quanto possibile, le fluttuazioni del segnale fisiologico.
4. Per migliorare la qualità dell'interfaccia elettrodo-pelle e migliorare la conduttanza del segnale elettrico, pulire la pelle sopra l'FDI strofinando delicatamente l'area con carta vetrata ad acqua seguita da un rapido risciacquo con una garza incorporata nell'alcol³⁵. Ripetere questa procedura sul gomito controlaterale. Una volta che la pelle è asciutta, posizionare l'elettrodo di terra sul gomito per fornire un punto di riferimento a tensione zero e l'elettrodo di registrazione sulla mano controlaterale sopra l'FDI, con il suo centro a circa 2,5 cm in direzione del tendine muscolare (vedere la Figura 2).
5. Posiziona una cuffia sulla testa dei partecipanti per tracciare riferimenti per la posizione del sito di stimolazione TMS:
   1. Posizionare una cuffia da nuoto sulla testa del partecipante con orientamento antero-posteriore. Assicurati che il cappuccio sia allineato con la linea del sopracciglio del partecipante nella parte anteriore e alla radice dell'elica delle orecchie su ciascun lato. Posizionalo sul cuoio capelluto, lasciando le orecchie libere e scoperte.
   2. Tracciare la linea sagittale mediale e la linea dell'intertrago sul cappuccio per ottenere il punto di intercettazione sul vertice (Figura 3A, B).
   3. Dal punto di intercettazione, misurare 5 cm a sinistra sulla linea dell'intertrago e anteriormente sulla linea sagittale, per definire 2 punti aggiuntivi (Figura 3C, D).
   4. Tracciare una linea diagonale per collegare il punto laterale al punto anteriore mediale (Figura 3E).
   5. Partendo dal punto laterale, misurare 2,5 cm in direzione antero-mediale sulla linea diagonale per segnare la stima iniziale dell'hotspot motorio (Figura 3F).
   6. Segnare 4 punti in un raggio di 0,5 cm attorno a quella stima iniziale, per fornire ulteriori punti di prova per il punto caldo del motore. Contrassegnare la regione considerata per l'hotspot del motore (linea rossa) (Figura 3E, F).
6. Configura il sistema di neuronavigazione per il partecipante.
   1. Posiziona l'elastico sulla testa del partecipante, assicurandoti che la striscia di marcatura sia rivolta verso la fotocamera e sia comoda, poiché deve rimanere in posizione per tutta la sessione.
   2. Utilizzare il puntatore per definire i punti di riferimento anatomici chiave sulla testa del partecipante (nasion, trago sinistro e destro e punti di forma della testa), che consentiranno al sistema di allineare e tracciare i bersagli di stimolazione rispetto all'anatomia della testa del partecipante (nasion, trago, punti di riferimento del cuoio capelluto e forma della testa), se si utilizza uno spazio MNI standard e ulteriori aspetti dell'anatomia, compresa l'anatomia del cervello, se si utilizzano scansioni MRI individualizzate. Ciò garantisce che il posizionamento della bobina sia accurato per quanto riguarda l'anatomia individuale durante la procedura TMS (per ulteriori dettagli, vedere il file supplementare 1, passaggio 3).

3. Valutazione fisiologica TMS-EMG

1. Avviare l'esecuzione dello script BONSAI⁴² per l'acquisizione dei dati EMG. Durante la registrazione, monitorare il partecipante per segni di contrazione facciale, movimento degli arti, riposizionamento involontario della cuffia o altri comportamenti che potrebbero influire sulla fisiologia del partecipante e sull'acquisizione dei dati fisiologici.
2. Misurare l'hotspot del motore.
   1. Posizionare la bobina TMS tangenzialmente al cuoio capelluto del partecipante con l'impugnatura rivolta posteriormente con un angolo di 45° rispetto alla linea sagittale media e il suo centro sopra la posizione contrassegnata nel passaggio 2.5 - questa posizione verrà utilizzata per tutte le procedure TMS.
   2. Applicare impulsi al 30% dell'MSO rispetto alla stima iniziale dell'hotspot del motore.
   3. Aumentare l'intensità della stimolazione in incrementi del 5-10% di MSO fino a quando non si osserva una risposta motoria costante.
   4. Applicare singoli impulsi alla stima iniziale e in diverse posizioni circostanti per determinare la posizione che più costantemente si traduce in MEP di ampiezza più elevata e, quando possibile, dove la contrazione visibile era limitata all'IDE - questo è il punto caldo del motore per l'FDI (MH).
   5. Nel software del sistema di neuronavigazione, selezionare l'impulso che ha determinato l'MH per guidare l'ulteriore stimolazione.
3. Stabilire l'rMT.
   1. Utilizzare il sistema di neuronavigazione per guidare la bobina verso l'MH che si trova al passaggio 3.2: l'rMT è la % minima di MSO necessaria per suscitare MEP di almeno 50 μV nell'FDI controlaterale in almeno 5 dei 10 singoli impulsi TMS erogati qui, separati approssimativamente da un intervallo interstimolo di 5 s.
   2. A partire dalla % MSO utilizzata per definire l'MH, ridurre l'intensità in incrementi del 2% fino a quando meno di 5 singoli impulsi TMS su 10 suscitano una risposta di almeno 50 μV nell'FDI controlaterale.
   3. Incrementare l'MSO in incrementi dell'1% fino a quando almeno 5 singoli impulsi TMS su 10 suscitano una risposta di almeno 50 μV nell'FDI controlaterale.
   4. Registrare la % MSO per l'rMT.
4. Determinare la massima attivazione muscolare volontaria.
   1. Istruire il paziente a produrre la massima attivazione muscolare volontaria del primo muscolo interosseo dorsale (FDI) attraverso la produzione della forma di un cerchio spingendo l'unghia indice contro il ventre del pollice con la massima forza.
   2. Circa 2 secondi dopo che il partecipante ha iniziato la contrazione muscolare, registrare il punto temporale corrispondente premendo la barra spaziatrice sul computer che esegue lo script BONSAI, saltando l'aumento iniziale dell'attività e i picchi derivanti dal movimento degli elettrodi.
   3. Ripeti il processo tre volte, con ogni contrazione separata da un periodo di riposo di 1 minuto per prevenire l'affaticamento e garantire il recupero.
5. Stabilire l'aMT.
   1. Utilizzare il sistema di neuronavigazione per guidare la bobina verso l'MH che si trova al passaggio 3.2: l'aMT è la % minima di MSO che produce MEP di almeno 200 μV di ampiezza picco-picco in almeno 5 su 10 singoli impulsi TMS erogati qui, durante una leggera contrazione volontaria.
   2. Chiedere al partecipante di mantenere una contrazione submassimale, compresa tra il 10% e il 20% di MViC, utilizzando l'EMG per monitorare la contrazione in corso e fornire un feedback in tempo reale (per ulteriori dettagli, vedere il File supplementare 1, passaggio 1).
   3. Partendo dalla % di MSO per l'rMT, diminuire l'intensità in incrementi del 2% fino a quando non vengono prodotti MEP di almeno 200 μV in meno di 5 singoli impulsi TMS su 10.
   4. Incrementare l'MSO in incrementi dell'1% fino a produrre MEP di almeno 200 μV in almeno 5 singoli impulsi TMS su 10.
   5. Registrare la % MSO per l'aMT.
6. Definire l'eccitabilità corticale di base.
   NOTA: Questa fase ha lo scopo di stabilire l'ampiezza di base del MEP del partecipante, fungendo da riferimento per i successivi confronti.
   1. Utilizzare il sistema di neuronavigazione per posizionare con precisione la bobina sopra l'hotspot del motore, come definito al punto 3.2.
   2. Verificare che gli elettrodi EMG di superficie siano posizionati correttamente sul muscolo bersaglio (ad esempio, il primo interosseo dorsale) e verificare la qualità del segnale (rumore minimo e MEP chiari)
   3. Caricare il protocollo di stimolazione a impulsi singoli sul dispositivo TMS.
   4. Inserire l'rMT precedentemente definito e avviare il protocollo (parametri di stimolazione descritti al punto 1.6.1).
   5. Valutare l'eccitabilità corticale basale facendo la media delle ampiezze picco-picco di 40 MEP.
      NOTA: L'ampiezza picco-picco è definita come la differenza di tensione tra i punti minimo e massimo di ogni singola forma d'onda MEP. Per ulteriori analisi, le ampiezze MEP possono essere normalizzate ai valori basali per controllare la variabilità interindividuale, seguendo le procedure descritte nella letteratura precedente³².
7. Applicare il protocollo di modulazione dell'eccitabilità corticale.
   NOTA: Questo passaggio prevede la consegna di un protocollo iTBS per modulare l'eccitabilità corticale.
   1. Caricare il protocollo iTBS sul dispositivo TMS.
   2. Inserire l'aMT precedentemente definito e avviare il protocollo (parametri di stimolazione descritti al punto 1.6.2).
   3. Subito dopo la fine del protocollo iTBS, avviare un cronometro per monitorare gli intervalli post-stimolazione.
8. Valutare la modulazione dell'eccitabilità corticale.
   1. T0, cioè immediatamente dopo la fine del protocollo di modulazione dell'eccitabilità corticale, riapplicare il protocollo di stimolazione a singolo impulso utilizzando il 120% di rMT, come descritto al punto 3.6.
   2. Convalida l'accuratezza della neuronavigazione posizionando il puntatore sul nasione e verificando l'allineamento nel software del sistema di neuronavigazione. Assicurarsi che la deviazione spaziale sia < 5 mm. Registrare il valore.
   3. T10, T20 e T30, cioè 10, 20 e 30 minuti dopo il protocollo di modulazione dell'eccitabilità corticale - ripetere il protocollo di stimolazione a impulso singolo come al punto 3.8.1. Riconvalida l'accuratezza della neuronavigazione come nel passaggio 3.8.2.
   4. Al termine del blocco di stimolazione finale, interrompere lo script BONSAI. Finalizza la sessione di neuronavigazione nel software. Un file "bin." viene generato dall'acquisizione dei dati del bonsai.
   5. Valutare l'eccitabilità corticale nei punti temporali di post-modulazione (T0, T10, T20 e T30) utilizzando la stessa procedura del basale, ovvero calcolando la media delle ampiezze picco-picco di 40 MEP registrate in ciascun punto temporale. Ciò consente di confrontare le variazioni di eccitabilità rispetto al basale seguendo il protocollo di modulazione.
   6. Calcolo della modulazione dell'eccitabilità corticale: Quantificare la modulazione dell'eccitabilità corticale indotta dal protocollo di stimolazione calcolando il delta MEP (ΔMEP), definito come la differenza tra l'ampiezza media dei MEP registrati in ogni punto temporale post-intervento (T0, T10, T20, T30) e l'ampiezza media dei MEP registrati al basale, normalizzata dall'ampiezza media dei MEP registrati al basale. Questa misura consente di valutare l'entità e la durata delle variazioni di eccitabilità corticale indotte dal protocollo iTBS.
       
9. Interrogare il partecipante su eventuali disagi e fornire i mezzi di contatto in caso di necessità o domande che possono sorgere dopo la sessione.

Results

Questo protocollo è stato progettato per fornire una valutazione affidabile e riproducibile dell'eccitabilità corticospinale pur rimanendo generalizzabile tra diversi sistemi EMG e configurazioni TMS. Abbiamo optato per la procedura convenzionale di caccia alla soglia in quanto è ampiamente convalidata, riproducibile e comparabile tra gli studi, pur riconoscendo che anche i metodi alternativi sono ben consolidati (ad esempio, metodi di caccia alla soglia basati sulla stima dei parametri mediante test sequenziali)^43,44. La raccolta di un totale di 40 stimoli TMS a impulso singolo garantisce che vengano registrati un numero sufficiente di MEP per una stima affidabile dell'ampiezza dei MEP, anche quando alcuni impulsi non riescono a suscitare una risposta²⁰. Gli intervalli tra gli impulsi sono randomizzati con un minimo di 6 s per prevenire gli effetti di trascinamento da stimoli precedenti²¹ e per rendere imprevedibile la sequenza degli impulsi, riducendo la pre-attivazione anticipatoria del muscolo. L'utilizzo di un'intensità TMS a impulso singolo del 120% rMT è uno standard consolidato che suscita MEP misurabili e cattura le variazioni di plasticità indotte da iTBS in modo coerente tra i partecipanti. L'elaborazione EMG offline, che include il filtraggio, la rimozione degli artefatti e il monitoraggio dell'attività muscolare di fondo, garantisce che i MEP misurati riflettano la vera eccitabilità corticospinale piuttosto che il rumore e non siano influenzati dalla pre-attivazione muscolare (vedere il File supplementare 1, passaggio 4 per i dettagli). Sebbene sia possibile acquisire MEP post-iTBS per più di 30 minuti utilizzando questo protocollo, abbiamo scelto di terminare l'acquisizione dei dati a T30 post-iTBS, il che è coerente con l'evidenza che la plasticità LTP-like risultante da questo protocollo si verifica prevalentemente all'interno di questa finestra³². Nel complesso, il protocollo enfatizza la riproducibilità, l'affidabilità e la generalizzabilità concettuale, indipendentemente da dispositivi o software specifici.

Tutto il personale coinvolto nelle sessioni TMS dovrebbe essere formato sui protocolli di sicurezza istituzionali per garantire il benessere dei partecipanti. Durante la sessione, se un partecipante riporta sintomi lievi come stordimento, la sessione deve essere messa in pausa, al partecipante deve essere fornita acqua e/o sdraiato con le gambe sollevate, se necessario. A seconda dei casi, è necessario contattare un infermiere o un medico. Il mal di testa può verificarsi durante o subito dopo la sessione. I partecipanti devono essere informati che ciò è previsto e possono assumere semplici analgesici da banco, se necessario. Se il mal di testa persiste, è necessario contattare il team di ricerca. Nel raro caso di sequestro, la sessione deve essere immediatamente interrotta e devono essere avviate le procedure di emergenza secondo i protocolli istituzionali.

I dati di 47 volontari sani sono stati raccolti utilizzando il protocollo strutturato e standardizzato qui descritto. Questa metodologia, progettata per migliorare l'affidabilità delle valutazioni di eccitabilità corticale, ha effettivamente prodotto risultati coerenti in due valutazioni condotte a distanza di 6 settimane l'una dall'altra³⁷. Una modulazione significativa dell'eccitabilità della corteccia motoria sinistra, valutata dalla variazione post-iTBS dell'ampiezza dei MEP (ΔMEP) è stata osservata a T0, T10 e T20 alla prima valutazione, mentre l'effetto a T30 non ha raggiunto la significatività (T0: W = 259, p < 0,01, r = 0,42; T10: W = 320, p < 0,01, r = 0,51; T20: W = 291, p < 0,01, r = 0,46; T30: W = 190, p = 0,06, r = 0,32), e in tutti i punti temporali 6 settimane dopo (T0: W = 293, p < 0,01, r = 0,48; T10: W = 278, p < 0,01, r = 0,46; T20: W = 315, p < 0,01, r = 0,52; T30: W = 275, p < 0,01, r = 0,45), che indica una robusta modulazione dell'eccitabilità nel tempo (Figura 4A). La stabilità della modulazione dell'eccitabilità a T0 è stata ulteriormente supportata da un ICC di 0,67 (IC 95% = 0,31-0,85; p < 0,01), dimostrando un'affidabilità test-retest da moderata a buona nei primi momenti dopo l'iTBS (Figura 4B). Tuttavia, l'affidabilità temporale dell'eccitabilità corticale a T10, T20 e T30 non è stata osservata, suggerendo limitazioni nell'applicazione di questo protocollo per valutare fenomeni simili alla plasticità in punti temporali successivi. Inoltre, i parametri neurofisiologici chiave, tra cui aMT, rMT e ampiezza MEP al basale, sono rimasti stabili per tutto il periodo di studio, sottolineando ulteriormente la coerenza interna e l'affidabilità procedurale del protocollo. Infine, è stata valutata sistematicamente l'influenza di potenziali fattori confondenti, tra cui la manualità, l'ansia di stato, l'aspettativa riguardo agli effetti della TMS, il sesso e l'età. Non sono state trovate associazioni significative tra queste variabili e la modulazione dell'eccitabilità corticale, supportando la robustezza degli effetti osservati e del protocollo tra le caratteristiche individuali, come riportato in Seybert et ^al.37.

Figura 1: Eccitabilità M1 a sinistra e sua valutazione della modulazione - panoramica del protocollo sperimentale. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.

Figura 2: Posizionamento degli elettrodi per la registrazione EMG sul primo muscolo interosseo dorsale (FDI). (a) dito indice; (b) regione tendinea; c) ventre muscolare IDE; (d) pollice. L'elettrodo attivo viene posizionato sul ventre dell'FDI e il secondo elettrodo viene posizionato a circa 2,5 cm distalmente verso il tendine. L'elettrodo di riferimento deve essere posizionato sul gomito opposto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Procedura di marcatura del tappo. (A,B) Identificazione delle linee anatomiche di riferimento: la linea sagittale mediale e la linea intertrago e determinazione del vertice; (C, D) Dal vertice, due punti di riferimento sono contrassegnati misurando cm lateralmente lungo la linea dell'intertrago (a sinistra) e 5 cm anteriormente lungo la linea sagittale; (E) Costruzione di una linea diagonale che collega il punto laterale al punto anteriore. Lungo la diagonale, un punto è segnato a 2,5 cm in direzione antero-mediale dal punto laterale, che rappresenta la stima iniziale dell'hotspot motorio. Perfezionamento della stima dell'hotspot contrassegnando quattro punti aggiuntivi entro un raggio di 0,5 cm dalla stima iniziale, creando un cluster di siti di stimolazione per la determinazione della soglia motoria; (F) Istituzione dell'hotspot del motore e rispettiva marcatura sul tappo (linea rossa). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Risultati rappresentativi dello studio. (A) Modulazione dell'eccitabilità della corteccia motoria sinistra dopo iTBS, riflessa dalle variazioni dell'ampiezza MEP (ΔMEP) a T0, T10 e T20 durante il basale e la sessione di follow-up; (B) Affidabilità test-retest a T0 indicata da un coefficiente di correlazione intraclasse (ICC) di 0,67 (IC 95%: 0,31-0,85; p < 0,01), che supporta una coerenza da moderata a buona nella modulazione dell'eccitabilità. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: Ulteriori dettagli sul protocollo. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Qui, presentiamo un protocollo completo e rigorosamente strutturato che descrive una metodologia per valutare l'eccitabilità corticale e la modulazione dell'eccitabilità dell'M1 utilizzando la TMS combinata con l'EMG. Descrive, in dettaglio, tutti i passaggi necessari per la conduzione ottimale della sessione sperimentale, compresa la preparazione della configurazione sperimentale e la calibrazione del sistema di neuronavigazione, la configurazione delle apparecchiature TMS ed EMG e le procedure standardizzate per identificare MH, rMT e aMT. Questi passaggi preparatori del protocollo sono necessari per la sequenza finale di passaggi, tra cui la valutazione di base dell'eccitabilità corticale, la neuromodulazione attraverso l'applicazione di iTBS e la rivalutazione dell'eccitabilità corticale per quantificare la modulazione risultante.

Un punto di forza di questa metodologia è il suo alto grado di standardizzazione e rigore, che affronta molte delle limitazioni riscontrate negli studi precedenti. I lavori passati nel campo hanno spesso sofferto di incoerenza metodologica, descrizione limitata dei metodi e alta variabilità intra e inter-soggetto³⁵. La variabilità metodologica include il numero di MEP raccolti²⁰, IPI²¹ e metodi di filtraggio EMG che potrebbero aver compromesso la riproducibilità dei risultati³⁴. Il protocollo qui descritto evita le insidie metodologiche incorporando la neuronavigazione per garantire un posizionamento preciso della bobina³⁹, utilizzando procedure EMG convalidate³⁴ e adottando le migliori pratiche consolidate per la stimolazione e l'acquisizione del segnale⁴⁵. Sebbene il contributo specifico di ciascuna di queste procedure non sia stato quantificato, l'applicazione collettiva di questi elementi ha portato a una migliore stabilità e affidabilità degli effetti osservati rispetto agli studi precedenti 25,26,27,28,29,30.

Mentre il rigore metodologico e la standardizzazione sono alla base di misurazioni affidabili, gli aspetti pratici della preparazione dei partecipanti e della gestione delle sessioni sono alcuni dei passaggi più importanti del protocollo che influenzano la qualità dei dati acquisiti. Un'adeguata pulizia della pelle per il posizionamento degli elettrodi, la garanzia che gli elettrodi siano posizionati adiacenti e in modo sicuro e la verifica che l'archetto per neuronavigazione si adatti comodamente ma saldamente, sono fondamentali per ridurre al minimo la variabilità da sessione a sessione. Durante la sessione, è necessario un monitoraggio continuo dello stato dei partecipanti, tra cui la vigilanza, il movimento della mano e la stabilità degli elettrodi, per prevenire artefatti e mantenere registrazioni di alta qualità. In presenza di problemi nell'acquisizione dei dati TMS-EMG, è importante regolare rapidamente il posizionamento della bobina o i parametri di stimolazione. La verifica regolare della qualità del segnale EMG è essenziale per affrontare problemi tecnici comuni, come la perdita di segnale, il distacco dell'elettrodo o una piccola deriva di navigazione. Un sottile riposizionamento della bobina, la garanzia di un contatto stabile dell'elettrodo o la ricalibrazione del sistema di neuronavigazione possono spesso ripristinare la qualità del segnale e mantenere la coerenza. È anche importante riconoscere che alcune fluttuazioni nella variabilità correlata al segnale o ai partecipanti possono essere inevitabili nonostante i migliori sforzi. In questi casi, piuttosto che compromettere l'integrità dei dati, potrebbe essere preferibile mettere in pausa la sessione, ripetere le misurazioni critiche o addirittura riprogrammare per garantire che si ottengano risultati affidabili e interpretabili.

I risultati ottenuti utilizzando questo protocollo hanno mostrato che l'eccitabilità corticale nell'M1 sinistro era significativamente modulata dopo l'applicazione di iTBS. Questa modulazione era altrettanto evidente 6 settimane dopo, con la misura della modulazione dell'eccitabilità che rivelava la stabilità all'interno dell'individuo solo quando veniva valutata immediatamente dopo l'iTBS, suggerendo una finestra di stabilità temporalmente specifica. In particolare, gli effetti di eccitabilità non sono stati mantenuti in modo coerente nei punti temporali successivi, una limitazione probabilmente guidata da un aumento della variabilità nel tempo^25,27. Questa osservazione rafforza l'idea che la tempistica delle misurazioni dell'eccitabilità corticale sia fondamentale, in particolare se si considera il suo potenziale ruolo come biomarcatore per scopi diagnostici o predittivi. Infatti, nonostante l'interesse di lunga data nell'utilizzo dell'eccitabilità della corteccia motoria e della modulazione dell'eccitabilità della corteccia (ΔMEP) come marcatore clinico, la sua applicazione è stata limitata dalla scarsa affidabilità e dall'elevata variabilità. Mentre alcuni studi hanno riportato una riproducibilità moderata, molti altri hanno riscontrato che l'ΔMEP manca della stabilità necessaria per l'uso clinico^18,19. L'attuale protocollo affronta direttamente questo problema fornendo un quadro replicabile per misurare l'eccitabilità con coerenza. Una solida metodologia TMS-EMG fornisce anche preziose informazioni sui meccanismi neurobiologici sottostanti sia nella salute che nella malattia, facilitando una valutazione affidabile di fenomeni simili alla neuroplasticità nella corteccia motoria umana. In particolare, si ritiene che l'iTBS attivi processi simili al potenziamento a lungo termine, inducendo aumenti dell'efficacia sinaptica dipendenti dal recettore NMDA, modulando gli interneuroni inibitori e promuovendo la disinibizione corticale, che collettivamente aumentano le ampiezze MEP post-stimolazione²⁴. Questa interpretazione è coerente con le prove dei modelli animali. Nei roditori e nei primati non umani, è stato dimostrato che la TBS induce un potenziamento duraturo dell'eccitabilità corticospinale e della forza sinaptica, dimostrando meccanismi omologhi simili alla plasticità tra le specie¹². Pertanto, i cambiamenti osservati nei MEP a seguito di iTBS negli esseri umani probabilmente riflettono processi neurali correlati alla plasticità con una forte base traduzionale.

Oltre a valutare i protocolli neuromodulatori come iTBS, la metodologia standardizzata TMS-EMG qui descritta è promettente per diverse applicazioni. Nei paradigmi dell'apprendimento motorio, i cambiamenti nell'eccitabilità corticospinale possono fungere da biomarcatori per l'acquisizione di abilità e la neuroplasticità. Ad esempio, gli studi hanno dimostrato che l'apprendimento visuomotorio migliora l'eccitabilità corticospinale, riflettendo gli adattamenti neurali sottostanti⁴⁶. Nella riabilitazione dell'ictus, la valutazione dell'eccitabilità corticospinale può informare le strategie terapeutiche, con il neurofeedback TMS utilizzato per sovraregolare l'eccitabilità nella corteccia motoria interessata, aiutando potenzialmente il recupero⁴⁷. Dal punto di vista farmacologico, le valutazioni TMS-EMG possono rilevare i cambiamenti di eccitabilità corticale indotti da sostanze, fornendo informazioni sui loro effetti sul SNC⁴⁸. Inoltre, sono state documentate differenze legate all'età nell'eccitabilità corticospinale, con gli anziani che spesso mostrano una ridotta eccitabilità, che può influenzare le prestazioni motorie e l'apprendimento⁴⁹. Estendendo l'applicazione di questo protocollo standardizzato a queste aree, i ricercatori possono ottenere una comprensione più completa delle dinamiche corticospinali in diversi contesti e popolazioni.

Pertanto, proponiamo che questo protocollo offra una base preziosa per la ricerca futura volta a stabilire biomarcatori affidabili di plasticità corticale. In particolare, gli studi dovrebbero cercare di replicare questi effetti in popolazioni più ampie e diversificate, compresi i gruppi clinici. La ricerca futura dovrebbe valutare se l'eccitabilità corticale misurata immediatamente dopo l'iTBS è in grado di distinguere costantemente tra profili sani e clinici, per comprendere la sensibilità diagnostica, nonché le proprietà prognostiche, ad esempio, nella previsione della risposta al trattamento. In conclusione, la metodologia qui descritta rappresenta un progresso significativo nella standardizzazione della valutazione dell'eccitabilità corticale. Mitigando le fonti comuni di variabilità e sottolineando la precisione nel disegno sperimentale, questo protocollo fornisce un approccio robusto e riproducibile allo studio dei fenomeni simili alla plasticità corticale e delle sue potenziali applicazioni cliniche.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Software BONSAI per l'acquisizione di dati fisiologici ("MT_ACQ.bonsai" scipt)	Bonsai	https://bonsai-rx.org/
Elettromiografia (EMG) sviluppata dalla Scientific Hardware Development Platform presso la Champalimaud Foundation & nbsp;	Ricerca su Champalimaud	https://www.cf-hw.org/home	Sito web della Piattaforma di Sviluppo Scientifico di Hardware e Software: https://www.cf-hw.org/home
Stimolatore MagPro X100 con bobina Cool-B65 a otto	Magventure	Stimolatore: 9016E0731;   bobina:9016E0491
Sistema di neuronavigazione Visor2	ANT Neuro		Software e hardware della stessa azienda