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Articolo metodologico

Una valutazione quantitativa della fagocitosi degli eritrociti allogenici e xenogenici da parte dei macrofagi di ratto in vitro

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DOI:

10.3791/68904

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22 agosto 2025

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1Institute of Regenerative Medicine, and Department of Dermatology, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Jiangsu University, 2Haihe Laboratory of Cell Ecosystem, Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences, 3Guangdong Provincial Key Laboratory of Large Animal Models for Biomedicine, and South China Institute of Large Animal Models for Biomedicine, School of Pharmacy and Food Engineering, Wuyi University, 4State Key Laboratory of Cell Biology, Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, University of Chinese Academy of Sciences, 5Innovation and Transformation Center, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, 6Prometheus RegMed Tech Ltd, 7Department of Medicinal and Life Sciences, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Tokyo University of Science

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo lavoro descrive un protocollo standardizzato in vitro per quantificare e confrontare i tassi di fagocitosi dei globuli rossi xenogenici (umani) e allogenici (ratto) mediante macrofagi isolati di ratto.

Abstract

Il trapianto di cellule xenogeniche spesso subisce un significativo rigetto immunitario, anche in modelli animali immunodeficienti. Tra i componenti immunitari residui, i macrofagi possono fagocitare attivamente le cellule umane trapiantate, ponendo una sfida all'attecchimento a lungo termine. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un test standardizzato in vitro per quantificare la fagocitosi mediata dai macrofagi dei globuli rossi (RBC) umani rispetto a quelli di ratto. I macrofagi peritoneali di ratto sono stati isolati, coltivati ed esposti a globuli rossi umani o di ratto. I globuli rossi umani sono stati identificati utilizzando CD235a, mentre i globuli rossi di ratto sono stati pre-marcati con DeepRed. L'analisi della citometria a flusso è stata condotta utilizzando CD163 per identificare l'esclusione dei macrofagi e dello iodio propidio (PI) per le cellule viventi gate. I risultati hanno mostrato una differenza sostanziale nell'attività fagocitica: il 5,08% dei macrofagi ha inghiottito globuli rossi umani, mentre solo l'1,59% ha fagocitato globuli rossi di ratto, producendo un indice di fagocitosi relativo di 3,21. Questo protocollo consente la valutazione quantitativa della compatibilità immunitaria e offre un metodo riproducibile per valutare le risposte immunitarie innate nello xenotrapianto. Ha il potenziale per affinare la selezione donatore-ricevente e guidare le strategie immunosoppressive nella ricerca traslazionale.

Introduzione

L'uso del trapianto di cellule xenogeniche, in particolare l'attecchimento di cellule umane in modelli animali, è una strategia essenziale nella ricerca biomedica1. Consente la valutazione della sopravvivenza cellulare, dell'attecchimento e delle risposte immunitarie in un ambiente controllato in vivo . Mentre i modelli murini hanno storicamente dominato questo campo a causa della loro genetica ben caratterizzata e della facilità di manipolazione, le loro piccole dimensioni presentano una limitazione significativa negli studi che richiedono grandi volumi di sangue o elevate rese cellulari. Al contrario, i ratti offrono diversi vantaggi, tra cui una maggiore massa corporea, una migliore rilevanza fisiologica per i sistemi umani e una maggiore resa di campioni biologici come sangue o macrofagi peritoneali2. Di conseguenza, i modelli di ratto sono sempre più utilizzati negli studi che coinvolgono la ricerca ematopoietica e sul sistema immunitario3.

Una delle principali sfide nel trapianto xenogenico è il rigetto immunitario. Anche nei modelli immunodeficienti in cui le cellule T, le cellule B o le cellule NK sono geneticamente ablate, le cellule immunitarie innate residue, in particolare i macrofagi, rimangono funzionalmente attive4. I macrofagi fungono da difensori di prima linea del sistema immunitario dell'ospite, riconoscendo ed eliminando le cellule estranee attraverso la fagocitosi5. Questo processo è in parte regolato dall'interazione tra la proteina regolatrice del segnale alfa (SIRPα) sui macrofagi e CD47, un segnale "don't eat me" espresso sulla maggior parte dei tipi cellulari. Quando il CD47 delle cellule umane non viene riconosciuto dalla SIRPα dei roditori, questa mancata corrispondenza può portare a un aumento della fagocitosi. Anche in questi animali immunodeficienti permissivi, questo fenomeno esiste anche 6,7.

Quantificare la fagocitosi mediata dai macrofagi in questo contesto è fondamentale per valutare la probabilità di sopravvivenza cellulare e per ottimizzare le strategie di trapianto8. Sebbene siano stati sviluppati vari metodi in vivo ed ex vivo per valutare il rigetto immunitario, i saggi standardizzati in vitro per la fagocitosi dei macrofagi rimangono limitati. I metodi tradizionali basati sulla microscopia sono spesso laboriosi e mancano di rigore quantitativo. La citometria a flusso, al contrario, offre un saggio basato su singole cellule e una piattaforma quantitativa in grado di distinguere con precisione i tipi di cellule e misurare l'assorbimento fagocitario attraverso il rilevamento di marcatori di superficie.

In questo articolo, abbiamo sviluppato un test standardizzato in vitro per valutare la fagocitosi differenziale dei globuli rossi umani e di ratto da parte dei macrofagi peritoneali di ratto. I globuli rossi fungono da modello ideale per i saggi di fagocitosi grazie alla loro struttura semplice e all'espressione di CD47, che agisce come un segnale "self" per inibire la clearance mediata dai macrofagi9. In questo protocollo, i macrofagi peritoneali di ratto vengono raccolti tramite lavaggio peritoneale, coltivati in vitro ed esposti a globuli rossi umani o globuli rossi allogenici di ratto marcati con DeepRed. Dopo la co-incubazione, la citometria a flusso viene utilizzata per valutare l'internalizzazione dei globuli rossi da parte dei macrofagi. I macrofagi sono identificati dall'espressione di CD163, i globuli rossi umani da CD235a e i globuli rossi di ratto dalla fluorescenza DeepRed. Le cellule morte vengono escluse tramite colorazione PI, assicurando che vengano analizzati solo i macrofagi vitali.

Questo approccio consente una valutazione quantitativa accurata dell'attività fagocitaria dei globuli rossi allogenici e xenogenici in vitro, fornendo informazioni sull'entità della clearance immunitaria mediata dai macrofagi. Nei nostri esperimenti, i macrofagi di ratto hanno dimostrato una fagocitosi significativamente più elevata dei globuli rossi umani (5,08%) rispetto ai globuli rossi di ratto (1,59%), producendo un indice di fagocitosi relativo di 3,21. Questi risultati sottolineano l'importanza dei meccanismi immunitari innati in contesti xenogenici ed evidenziano il valore di questo test nella validazione preclinica del modello.

In conclusione, il protocollo qui presentato offre un metodo riproducibile ed efficiente per misurare la fagocitosi dei macrofagi in vitro. È particolarmente utile per i ricercatori che lavorano nei campi dello xenotrapianto, della ricerca sulle cellule staminali ematopoietiche e dei test di compatibilità immunologica. Fornendo un quadro standardizzato per la quantificazione della fagocitosi, questo test può contribuire a migliorare la riproducibilità sperimentale e la comprensione delle risposte immunitarie innate nei modelli di trapianto interspecie.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti che hanno coinvolto gli animali sono stati condotti secondo le politiche e le procedure etiche approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Jiangsu (UJS-IACUC) (Approvazione n. UJS-IACUC-2021090102). Questo studio è stato approvato dall'Institutional Review Board dell'Ospedale Affiliato dell'Università di Jiangsu. Tutti i campioni sono stati raccolti da pazienti che avevano fornito il consenso informato. Il surnatante rimosso deve essere posto in un apposito serbatoio del liquido di scarto e consegnato al reparto di malattie infettive dell'ospedale.

1. Isolamento dei macrofagi

  1. Preparazione: Preparare i materiali necessari, inclusi ratti sperimentali, contenitori per anestesia, becher e isoflurano come anestetico e preraffreddare la centrifuga a 4 °C.
  2. Anestetizzare e sacrificare i ratti: seguendo le linee guida istituzionali per la cura degli animali, sopprimere i ratti dopo aver inalato un'eccessiva anestesia con isoflurano.
  3. Disinfezione alcolica: Metti il ratto sacrificato in un becher e aggiungi una quantità sufficiente di etanolo al 75% per coprire completamente il ratto. Lasciare in ammollo per 10 min.
  4. Iniezione e miscelazione di liquido addominale: disinfettare l'addome del ratto e iniettare 50 ml di PBS sterile ghiacciato nella cavità addominale lungo la linea mediana utilizzando una siringa.
    1. Scuotere delicatamente il ratto e massaggiare la parete addominale con le dita per garantire una miscelazione accurata del fluido nella cavità addominale. Massaggiare per 2-3 min.
  5. Raccolta del liquido addominale: praticare una piccola incisione nella parete addominale del ratto, inclinare leggermente il corpo e aspirare il liquido addominale con una siringa.
  6. Centrifugazione: centrifugare il fluido raccolto a 500 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
  7. Lisi dei globuli rossi: aggiungere 3-5 volte il volume del pellet cellulare del tampone di lisi dei globuli rossi e mescolare delicatamente per 1-2 minuti.
    NOTA: Ad esempio, se il volume del pellet della cella è di 1 mL, aggiungere 3-5 mL di tampone di lisi. Questo passaggio può essere eseguito a temperatura ambiente o a 4 °C, seguito da centrifugazione a 400-500 x g per 5 minuti. La centrifugazione a 4 °C è più efficace. A causa della pressione osmotica, i globuli rossi si liseranno e la soluzione diventerà rossa. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante rosso.
    1. Ricetta tampone per lisi dei globuli rossi (RBC): sciogliere 8,3 g di NH4Cl, 1,0 g di KHCO3 e 1,8 mL di EDTA al 5% in 800 mL di H2O distillato e sterilizzare con un filtro da 0,2 μm, qs a 1000 mL con H2O distillato e regolare il pH 7,2~7,4. Se il precipitato rosso è ancora visibile, ripetere questo passaggio fino a quando la soluzione non diventa limpida e trasparente. In genere, una piccola quantità di globuli rossi residui non influisce sui saggi successivi (se ci sono pochi globuli rossi nel pellet, questo passaggio può essere omesso).
  8. Lavaggio delle celle: Lavare le celle due volte con circa 10 mL di terreno RPMI 1640 pre-raffreddato. Centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C ogni volta ed eliminare il surnatante.
  9. Risospensione e conteggio cellulare: risospendere le cellule in un terreno preraffreddato costituito da RPMI 1640 + 1 % FBS + 1% PS, contare le cellule utilizzando la colorazione con Trypan Blue e valutare la vitalità cellulare.
  10. Coltura cellulare: se è necessaria la coltura, seminare le cellule a una densità di 1 ×10 6/mL in una piastra di coltura a 24 pozzetti, con 1 mL di terreno RPMI 1640-10% FBS-1% PS per pozzetto. Dopo 2 ore di incubazione, sostituire il terreno e lavare i pozzetti 1-2 volte con il terreno RPMI 1640 per rimuovere le cellule non aderenti.
    NOTA: Le cellule aderenti formeranno un monostrato di macrofagi. Se è necessaria l'estrazione dell'RNA, aggiungere 1 mL di Trizol al pellet cellulare, pipettare più volte per disgregare le cellule e trasferire la miscela in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL per l'estrazione immediata dell'RNA o conservarla a -80 °C. Per l'analisi FACS, regolare la conta cellulare su 1 × 106 per provetta, aggiungere 20 μl di tampone FACS e procedere con la colorazione FACS. Tampone FACS: DPBS + 2% FBS, filtro sterilizzare attraverso un filtro da 0,22 μm, conservato a 4 °C).

2. Raccolta di globuli rossi di ratto o umani

  1. Preparazione: Pre-sciacquare 15 mL di provette da centrifuga e 10 mL di siringhe con eparina.
  2. Raccolta del sangue del cuore di ratto: Dopo aver anestetizzato e sacrificato il topo, tagliare con cura una piccola sezione della coda del topo con le forbici e raccogliere il sangue dalla vena della coda.
  3. Raccolta di sangue umano: Raccogli il sangue umano utilizzando la tecnica della venipuntura.
  4. Miscelazione di campioni di sangue: Mescolare 1 mL di PBS con 1 mL di sangue venoso umano o di ratto.
  5. Separazione in gradiente di densità di Ficoll: aggiungere 1,5 mL di soluzione di Ficoll con una densità di 1,077 a una provetta da centrifuga da 15 mL per sangue periferico umano; aggiungere 1,5 mL di soluzione di Ficoll con una densità di 1,084 a una provetta da centrifuga da 15 mL per sangue di ratto.
  6. Stratificazione dei campioni di sangue: sovrapporre lentamente i campioni di sangue diluiti lungo la parete della provetta da centrifuga sulla soluzione a gradiente di densità corrispondente.
  7. Centrifugazione: Centrifugare a 400 x g per 30 min ad una temperatura di 18-20 °C.
  8. Rimozione degli strati plasmatici e linfocitari: rimuovere lo strato plasmatico superiore, lo strato linfocitario e lo strato di soluzione di Ficoll, lasciando solo lo strato inferiore dei globuli rossi.
  9. Lavaggio dei globuli rossi: lavare i globuli rossi una volta con 10 ml di PBS.
  10. Centrifugazione e rimozione del surnatante: Centrifugare a 400 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
  11. Risospensione e conta cellulare: aggiungere 1 mL di terreno RPMI 1640 a una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, miscelare con una quantità appropriata di pellet di globuli rossi ed eseguire la conta cellulare.

3. Saggio di fagocitosi in vitro

  1. Isolamento e coltura dei macrofagi: Isolare i macrofagi e seminarli a una densità di 1 × 106 cellule/pozzetto in una piastra di coltura a 12 pozzetti. Incubare a 37 °C con il 5% di CO2 per 2 ore per consentire alle cellule di aderire.
  2. Rimozione delle cellule non aderenti: Dopo 2 ore di incubazione, rimuovere con cura le cellule non aderenti e lavare delicatamente con terreno RPMI 1640.
  3. Coltura continua: Continuare a coltivare i macrofagi aderenti per un massimo di 2 ore per garantire la completa adesione al fondo della piastra di coltura.
  4. Trattamento per fame: dopo 2 ore, sostituire il terreno con RPMI 1640 privo di siero e incubare in condizioni di fame per 2 ore per migliorare l'attività fagocitaria dei macrofagi.
  5. Aggiunta di cellule umane: aggiungere cellule umane precolorate con DeepRed alla piastra di coltura e incubare a 37 °C con CO2 al 5% per 2 ore per consentire ai macrofagi di fagocitare le cellule umane.
  6. Conclusione e analisi: Dopo il test di fagocitosi, osservare l'attività fagocitaria al microscopio o quantificare utilizzando la citometria a flusso (FACS).

4. Citometria a flusso

  1. Preparazione delle cellule: Digerire le cellule con lo 0,05% di tripsina-EDTA e interrompere la digestione utilizzando il terreno RPMI 1640 contenente il 10% di FBS. Centrifugare le cellule, scartare il surnatante, risospendere le cellule nel tampone FACS e contarle. Preparare 1 × 106 cellule per provetta in due provette. Inoltre, preparare una provetta di globuli rossi umani e una provetta di globuli rossi di ratto.
  2. Preparazione della provetta con colorazione singola: aggiungere l'anticorpo CD163 di topo anti-ratto a una provetta campione, l'anticorpo CD235a anti-umano di topo alla provetta dei globuli rossi umani e DeepRed alla provetta dei globuli rossi di ratto.
    1. Incubare queste provette su ghiaccio, al riparo dalla luce, per 30 minuti, mescolando ogni 10 minuti. Aggiungere 1 mL di tampone FACS per lavare via eventuali anticorpi non legati, centrifugare ed eliminare il surnatante. Risospendere le cellule in 500 μl di tampone FACS.
  3. Preparazione del campione: Aggiungere alle provette del campione CD163 anti-ratto di topo, anticorpi CD235a anti-umani di topo e DeepRed. Incubare su ghiaccio, al riparo dalla luce, per 30 min, mescolando ogni 10 min. Aggiungere 1 mL di tampone FACS a ciascuna provetta per eliminare eventuali anticorpi non legati, centrifugare e rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule in 500 μl di tampone FACS.
  4. Analisi: Escludere l'adesione cellulare mediante gating su FSC-H rispetto a FSC-A. Utilizzare i tubi a colorazione singola per regolare le impostazioni di tensione e compensazione appropriate prima di analizzare i campioni (Figura 1). Analizza i dati utilizzando il software FlowJo v10.8.1.
    NOTA: Per impostare la compensazione sono stati utilizzati i controlli CD163-FITC e PI a colorazione singola.

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Risultati

Attraverso l'analisi della citometria a flusso, possiamo dedurre il tasso di fagocitosi dei macrofagi di ratto verso i globuli rossi umani e i globuli rossi di ratto. Le cellule morte vengono prima escluse utilizzando il PI. I macrofagi CD163-positivi che esprimono CD235a-positivo indicano la fagocitosi dei globuli rossi umani. La proporzione di macrofagi che hanno fagocitato i globuli rossi è definita come il tasso di fagocitosi dei macrofagi di ratto rispetto ai globuli rossi umani. La...

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Discussione

Questo studio ha stabilito un test in vitro robusto e riproducibile per valutare la fagocitosi mediata da macrofagi di globuli rossi xenogenici e allogenici. In questo studio, i globuli rossi umani sono stati marcati con CD235a-BV421, mentre i globuli rossi di ratto sono stati colorati con il colorante DeepRed. Quando i macrofagi fagocitano i globuli rossi marcati, gli anticorpi coniugati (CD235a-BV421) o il colorante (DeepRed) vengono internalizzati insieme. Di conseguenza, i m...

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Dichiarazioni

JYG è un consulente scientifico di Prometheus RegMed Tech Ltd. Gli autori di sinistra dichiarano di non avere alcun potenziale conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare la signora Mei Fang, la signora Min Ma, la signora Yu-Tong Meng e il signor Quan-Kai Lei per i loro contributi iniziali. Questa ricerca è stata finanziata in parte dalla National Natural Science Foundation of China (82270697), dal Science and Technology Planning Project della provincia cinese del Guangdong (2021B1212040016), dalla Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2023A1515012574), dall'Unità di coltivazione della disciplina medica chiave della provincia di Jiangsu (JSDW202229) e dall'Haihe Laboratory of Cell Ecosystem Innovation Fund (HH24KYZX0008), dalla China Foundation for Youth Entrepreneurship and Employment -Incaier Public Welfare Fondo (HH25KYHX0003).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,05% Tripsina-EDTAThermoFisher25300062
Tracciatore di Cellule Rosse ProfondeThermoFisher  C34565La polvere (15 & mu; g) fu sciolto nel DMSO (20 e mu; L)
Dimetil Solfossido (DMSO)SigmaD2650
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)ThermoFisherC10010500BT
Ficoll-Paque PLUSCytiva17144002
Ficoll-Paque PREMIUMCytiva17544602
Anticorpo anti-umano CD235a BV421 per topiBD in Biologia562938
Anticorpo FITC Anti-Rat del topo CD163BIO-RADMCA342F
Proteina KSigmaP2308
RPMI 1640ThermoFisher11875093

Riferimenti

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  11. Joffe, A. M., Bakalar, M. H., Fletcher, D. A. Macrophage phagocytosis assay with reconstituted target particles. Nat Protoc. 15 (7), 2230-2246 (2020).

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