Articolo metodologico

Procedura semplice ed efficace per l'emostasi nelle arterie del topo

390 visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/68907

⸱

28 novembre 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University, 2Key Laboratory of Livestock Infectious Diseases, Ministry of Education, and Key Laboratory of Ruminant Infectious Disease Prevention and Control (East), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University, 3Manzhouli International Travel Health Care Center, 4Shenyang Baihao Biotechnology Co., Ltd., 5The Affiliated Animal Hospital of Jinzhou Medical University, Collaborative Innovation Center Zoonosis Prevention and Treatment of Jinzhou Medical University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo studio mira a sviluppare un metodo efficace per raggiungere l'emostasi nelle arterie del topo.

Abstract

Durante la puntura o cannulazione arteriosa nei topi, spesso è necessaria una legatura permanente dell'arteria a causa delle difficoltà di raggiungere l'emostasia dopo il ritiro dell'ago. Questo porta a una lesione ischemica permanente nella regione tissutale fornita. Tale ischemia localizzata spesso induce complicazioni secondarie, compromettendo gli esiti sperimentali nei modelli animali. Il metodo attuale mira a sigillare il sito della puntura dopo la procedura mantenendo il flusso sanguigno normale, prevenendo così l'ischemia post-operatoria. Questo metodo prevede l'estrazione di un frammento di tessuto adiposo dallo stesso animale sperimentale, l'esecuzione di puntura arteriosa con tecniche standard e poi l'avvolgimento del sito della puntura con il cuscinetto adiposo per ottenere l'emostasi mantenendo il flusso sanguigno. In questo studio, è stata eseguita una puntura bilaterale dell'arteria carotide comune su topi, seguita da emostasia con una tecnica di fasciamento del grasso. L'imaging laser a contrasto speckle (LSCI) non ha rilevato differenze nei cambiamenti del flusso sanguigno cerebrale tra i gruppi sham e operato di topi, e non sono state osservate modifiche significative nelle misurazioni preoperatorie e postoperatorie del flusso sanguigno cerebrale nel gruppo operato. La valutazione istologica effettuata a 7, 14 e 28 giorni dall'intervento ha rivelato che: (1) conservazione dell'architettura cerebrale (colorazione H&E), (2) morfologia neuronale intatta senza alterazioni degenerative (colorazione di Nissl) e (3) assenza di alterazioni patologiche nelle sezioni cerebrali. Questa tecnica di emostasi arteriosa sfrutta la natura flessibile del tessuto adiposo e i meccanismi fisiologici della coagulazione. La procedura prevede: (1) avvolgere il grasso autologo attorno al sito della puntura, (2) fissarlo con suture per garantire un contatto ottimale con l'adventizia arteriosa e (3) permettere al sangue in fuga di penetrare l'interfaccia arteria-grassa dove subisce la coagulazione. Questo meccanismo a tripla azione garantisce un'emostasi affidabile preservando la permeabilità arteriosa e prevenendo complicazioni ischemiche post-operatorie. Il metodo dimostra una notevole semplicità procedurale, efficacia clinica e eccellente potenziale traslazionale.

Introduzione

Nei modelli animali, creare lesioni arteriose è un approccio sperimentale ampiamente utilizzato per modellare varie condizioni patologiche, inclusi modelli di ischemia-reperfusione cerebrale, modelli di aterosclerosi carotide (CCA) o aortica (AO) e modelli di ischemia midollare.

Prendendo come esempio il modello di ischemia e riperfusione cerebrale (MCAO) dei topi, l'attuale approccio standard di modellazione 1,2,3 prevede: isolare l'arteria carotide esterna (ECA), collegarne l'estremità distale, clampare l'ECA prossimale con una clip arteriosa mentre si posiziona una sutura di sosta, creare un foro di perforazione tra questi punti, inserire retrogradamente un filamento attraverso la CCA, fissando il vaso e il filamento con la sutura di sosta, tranziando l'ECA tra il sito della puntura e la legatura distale, rilasciando la clip arteriosa, reindirizzando il filamento nell'arteria carotide interna (ICA) per occlusare l'arteria cerebrale media e, al momento del ritiro del filamento, legando l'ECA prossimale.

Sebbene questa procedura raggiunga la reperfusione, ripristina solo il flusso sanguigno tra il comune e l'ICA, lasciando l'ECA permanentemente disconnessa. Questa transezione ECA causa danni ischemici alle regioni facciali ipsilaterali, una lesione non intenzionale che non solo complica l'intervento chirurgico, ma introduce anche traumi confondenti negli animali da esperimento, compromettendo potenzialmente gli esiti dello studio. Ancora più preoccupante, in alcuni protocolli sperimentali 4,5, i ricercatori eseguono una puntura CCA diretta, viene inserita una sutura per stabilire il MCAO, poi immediatamente rimossa, seguita da una legatura permanente a entrambe le estremità del sito di puntura per l'emostasi. Tuttavia, questo metodo aumenta direttamente la pressione vascolare, aumentando così il carico cardiaco e potenzialmente portando a insufficienzacardiaca 6.

Utilizzando come esempio il modello di lesione endoteliale CCA o AO del topo con dieta ricca di grassi per stabilire l'aterosclerosi, la metodologiaconvenzionale 7,8,9,10 prevede l'esecuzione di puntura arteriosa nella CCA, nell'aorta addominale (AA) o nell'arteria femorale (CFA), nell'inserimento di un catetere a palloncino per indurre la denudazione endoteliale e nel raggiungimento dell'emostasi legando permanentemente entrambe le estremità del sito della puntura. Questo approccio standard presenta diverse limitazioni critiche: la legatura obbligatoria crea ischemia localizzata distale al sito di occlusione. Ancora più dannoso, l'accumulo di lipidi avviene nei siti di legazione. La validità del modello di compromesso è alterata dall'influenza dell'emodinamica locale, che interferisce con la somministrazione del farmaco alle lesioni bersaglio e distorce gli esiti della valutazione farmacologica.

Nel modello di ischemia del midollo spinale murino, la procedura prevede una puntura arteriosa (tramite accesso CCA, AA o CFA) seguita dall'inserimento di un catetere a palloncino per indurre l'ischemia nelle posizionitarget 11. Dopo il ritiro del palloncino, l'emostasi convenzionale si ottiene legando permanentemente il sito della puntura bilateralmente.

In tutti e tre i modelli menzionati, l'emostasi post-puntura si ottiene uniformemente tramite legatura bilaterale del sito della puntura. Sebbene efficace per il controllo delle emorragie, questo approccio inevitabilmente induce ischemia localizzata, portando a complicazioni secondarie che compromettono la validità del modello. Il mantenimento della permeabilità vascolare durante le procedure emostatiche è quindi fondamentale sia dal punto di vista fisiologico che sperimentale. Pertanto, questo articolo introduce un metodo innovativo, semplice ed efficace per l'emostosi arteriosa per esperimenti con topi. La procedura prevede prima il clampaggio di entrambe le estremità del sito della puntura con clip vascolari arteriose, poi l'avvolgimento dell'arteria con un cuscinetto adiposo da 3 mm × 3 mm × 1 mm per coprire la puntura. Il cuscinetto adiposo è fissato in posizione con una sutura a legatura attorno all'arteria. Le clip arteriose vengono rilasciate gradualmente e la strettezza della legatura viene regolata in base al sanguinamento fino al raggiungimento dell'emostasia completa. Questo approccio ripristina il flusso sanguigno, mantiene l'emodinamica normale e previene i danni ischemici ai tessuti circostanti causati dalla legatura permanente dei vasi. È particolarmente vantaggioso per l'osservazione post-modellazione a lungo termine delle condizioni murine e per la valutazione degli interventi farmacologici, migliorando così significativamente il rigore sperimentale degli studi preclinici.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state condotte in rigorosa conformità con le Linee Guida per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio (Approvazione del Protocollo n. SNLL25040501; Licenza per l'uso degli animali n. SYXK(Liao) 2021 - 0010) istituito dal Comitato per la Cura e l'Uso Istituzionale degli Animali (IACUC) dell'Università Agricola di Shenyang. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione sperimentale

  1. Dettagli e documentazione sugli animali: Documentare tutti i dati della ricerca sugli animali seguendo le linee guida ARRIVE (Ricerca sugli animali: segnalazione degli esperimenti In Vivo). Usa topi maschi Balb/C di età 6-8 settimane, che pesano 22 g ± 4 g. Mantenere le condizioni abitative a 24 ± 2 °C con umidità relativa del 55% ± 5% in un ciclo di luce e buio di 12 ore.
  2. Preparazione degli animali
    1. Anestetizzare i topi utilizzando un vaporizzatore a isoflurano (seguendo i protocolli approvati dall'istituzione). Indurre l'anestesia con isoflurano al 4%, poi mantenere con isoflurano al 2%.
    2. Dopo l'anestesia, si depilano le regioni cervicale e cranica e si disinfetta la pelle esposta con povidone-iodio, seguita da etanolo al 75% per rimuovere i residui.
    3. Posizionare i topi su una borsa termica a 37 °C per tutte le procedure sperimentali successive.
  3. Misurazione del flusso sanguigno cerebrale di base nei topi
    1. Posiziona i topi in posizione prona. Fai un'incisione al cuoio capelluto mediano per esporre le ossa parietali. Dissezionare con attenzione e rimuovere lo strato fasciale sovrastante dalla superficie del cranio.
    2. Regolare il sistema LSCI per scansionare l'osso parietale esposto del topo a un ingrandimento di 10 volte e registrare i dati di base del flusso sanguigno cerebrale.
  4. Prelevate il cuscinetto adiposo ed esecuzione della puntura arteriosa
    1. Riposiziona i topi in posizione supina. Fai un'incisione cervicale a metà della linea. Prelevare un innesto di tessuto adiposo sottocutaneo di 3 mm × 3 mm × 1 mm per un uso successivo.
    2. Eseguire una dissezione contusiva della ghiandola submandibolare, del muscolo sternohioideo e del muscolo sternocleidomastoideo. Espone entrambi i CCA.
    3. Liberare il CCA per esporre l'ICA e l'ECA.
    4. Applicare la pinza vascolare 1 all'estremità distale della CCA e posizionare la pinza vascolare 2 all'estremità prossimale.
    5. Perfora il CCA tra le due pinze usando un ago da 23 G.
  5. Applicazione del cuscinetto grasso
    1. Dopo la rimozione dell'ago, avvolgi il CCA nel punto di puntura con la superficie tagliata (lato non serosa) del cuscinetto adiposo.
    2. Posiziona una sutura 4-0 sotto l'area avvolta nel grasso; poi legare delicatamente un solo tiro sulla superficie grassa per applicare pressione e garantire un contatto sicuro tra il pad grasso e la parete del recipiente; Infine, regolare gradualmente la legatura per ottenere un equilibrio di pressione per l'emostasi.
    3. Eleva la CCA distale con uno cotton fibb umido. Rilascia la pinza vascolare 1 e ritira lentamente il tampone per permettere un flusso sanguigno graduale verso il sito della puntura.
    4. Controlla il flusso sanguigno; se è stato osservato un sanguinamento attivo, riprendere la CCA distale con pinza vascolare 1.
    5. Aspettare 1 minuto, poi rilasciare lentamente la pinza vascolare 1; in caso di sanguinamento, riposizionare il cuscinetto adiposo o stringere leggermente il singolo stiro della legatura per aumentare la pressione; Continuare questi aggiustamenti fino a raggiungere l'emostasia completa.
    6. Eleva la CCA prossimale con un cotton fioc umido. Rilascia la pinza vascolare 2 e ritira gradualmente il tampone per permettere un flusso sanguigno controllato verso il sito della puntura.
    7. Se si verifica un'emorragia, rimuovere la CCA distale con una pinza vascolare 2.
    8. Stringere leggermente il singolo scorrimento della sutura per aumentare la pressione; aspettare 1 minuto, poi sollevare la CCA prossimale e rilasciare la pinza vascolare 2; Arrotolando lentamente il cotton fioc inumidito verso il punto della puntura.
    9. Se il sanguinamento persiste, ripetere i due passaggi precedenti fino a raggiungere l'emostosi completa.
    10. Inserire un ulteriore tiro con la sutura per formare un doppio nodo sopra quello iniziale, fissando così meglio il cuscinetto adiposo alla parete del vaso e ottenendo l'emostasi tramite pressioni intravascolari ed esterne equilibrate.
    11. Confermare che le arterie carotidii comuni su entrambi i lati del cuscinetto adiposo siano state riempite e presentino un diametro costante del vaso; Considera questo come un ripristino del flusso sanguigno e un'emostasi riuscite.
    12. Ripetere la stessa procedura per eseguire l'emostasi da puntura sull'arteria carotide comune controlaterale.
    13. Espone le arterie carotidie comuni bilaterali nei topi finti senza eseguire puntura arteriosia o fasciatura del cuscinetto, mantenendo tutte le altre procedure identiche al gruppo operato.
    14. Sutura l'incisione chirurgica cervicale e applica un antisettico.
  6. Esecuzione della valutazione postoperatoria del flusso sanguigno cerebrale
    1. Dopo il completamento dell'emostasia bilaterale da puntura CCA nei topi, si regola il sistema LSCI per scansionare l'osso parietale esposto e acquisire immagini ingrandite 10x; Poi annota i cambiamenti del flusso sanguigno cerebrale.
    2. Sutura l'incisione del cuoio capelluto e applica un antisettico, lascia che i topi si riprendano su un cuscinetto riscaldante a 37 °C prima di riportarli nella gabbia per cure continue.
  7. Monitoraggio post-operatorio e raccolta dei tessuti
    1. Monitorare e registrare quotidianamente lo stato di sopravvivenza, l'attività motoria e eventuali segni di sanguinamento nella regione cermicomandibolare dei topi durante il periodo post-operatorio.
    2. Nei giorni postoperatori 7, 14 e 28, sopporta i topi con anidride carbonica (seguendo i protocolli approvati dall'istituzione) e fissa i tessuti cerebrali con paraformaldeide al 4%.

2. Esame patologico

  1. Dopo una fissazione di 24 ore, disidratare i tessuti cerebrali tramite un gradiente di etanolo, trasparire con xilene e inserire nella paraffina per la sezionazione.
  2. Esegui la colorazione H&E su sezioni ippocampali ed esamina la morfologia del tessuto cerebrale al microscopio.
  3. Eseguire la colorazione di Nissl su sezioni ippocampali ed esaminare l'architettura neuronale al microscopio.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

L'analisi dei dati di contrasto laser speckle pre- e postoperatorio e delle misurazioni relative di perfusione sia nel gruppo sham che operato non ha rilevato cambiamenti significativi, dimostrando che questa tecnica di emostasi arteriosa ha sigillato con successo il comune sito di puntura dell'arteria carotide senza compromettere il flusso sanguigno cerebrale (Figura 1).

I topi del gruppo operato sono stati monitorati continuamen...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Nei modelli MCAO, la conservazione dell'ECA riproduce meglio la patologia clinica prevenendo danni ischemici facciali associati alla legatura e alla transezione dell'ECA. Sebbene l'approccio convenzionale di inserimento del filamento tramite puntura CCA offra semplicità tecnica, richiede una legatura bilaterale del sito della puntura, con conseguente perfusione cerebrale che dipende dalla circolazione collaterale del Cerchio di Willis, una rappresentazione subottimale della vera...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal Progetto di Ricerca Scientifica dell'Amministrazione Generale della Dogana (Grant n. 2005HK006) sotto il titolo "Ricerca e Sviluppo e Applicazione della Tecnologia di Rilevamento Multiplex di Patogeni per Malattie Infettive Trasmesse da Vettori nelle Aree di Confine della Cina settentrionale". Questo lavoro è stato inoltre supportato dal National Key R&D Program of China (Grant No. 2022YFC2302700) e dal International Science & Technology Cooperation Program del Ministero della Scienza e della Tecnologia (Grant No. KY201901014). Lo sviluppo riuscito di questo metodo di emostasi arteriosa deve profonda gratitudine al Professor Perry (Direttore responsabile del Perry Manual of Mouse Experiments) per la sua guida esperta e a RWD Life Science Co., Ltd. (Shenzhen) per aver fornito il sistema di imaging a contrasto con macchie laser (Speckle Contrast). Un sincero ringraziamento è stato rivolto al Professor Han Xiaohu, nostro mentore, e alla Shenyang Biohao Biotech Co., Ltd., per il loro prezioso supporto. Un sincero apprezzamento viene espresso anche a tutti i contributori che hanno reso possibile questa ricerca.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
4-0 con ago da cucito a filoShanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd
Topo Balb/CBeijing Huafukang Biotechnology Co., Ltd6-8 settimane, maschio
Forno di riscaldamento e asciugatura della serie DHGShanghai Yiheng Technology Co., LtdDHG-9123A
Ematossilina ed eosina (H&; E) Kit di Tintura ad Alta DefinizioneServicebioG1076-500ML
IsofluranoShenzhen Ruiwode Life Technology Co., LtdR510-22
Analizzatore laser di speckleShenzhen Ruiwode Life Technology Co., LtdRFLSI ZW
Soluzione di colorante NisslServicebioG1036-100ML
Macchina di embedding organizzativaLeicaHistoCore Arcadia H
Sistema di imaging a scansione di vetrineShenzhen Shengqiang Technology Co., LtdSQS-40R
Macchina per anestesia per piccoli animaliShenzhen Ruiwode Life Technology Co., LtdR500
Disidratatore tissutaleLeicaPerla HistoCore
Sistema Ultrapuro per l'AcquaThermo50132370
Microtomo semiautomatico ultra-sottileLeicaHistoCore MULTICUT

Riferimenti

  1. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  2. Yang, X. Y., Wang, K. K., Liu, D. N. Relationship between cerebral ischemia-reperfusion injury and mitochondrial autophagy in mice. Chin J Comp Med. 33 (2), 48-55 (2023).
  3. Wang, Y., Wang, T., Zhao, L., Li, L. The effect of local cerebral ischemia-reperfusion injury on TMEM166 gene and neuronal autophagy in mice. Chin J Comp Med. 28 (7), 28-32 (2018).
  4. Xue, J., Sun, F., Liu, T. The effect of mononucleoside on Wnt7a and APC expression in focal cerebral ischemia-reperfusion rats. Chin J Comp Med. 9, 9-13 (2014).
  5. Hu, Z., Zhao, J., Song, W., et al. Protective effect of ginkgo biloba extract on the brain in a cerebral ischemia-reperfusion injury rat model. Chin J Comp Med. 32 (9), 55-61 (2022).
  6. Chen, Z., et al. Cardiac damage after permanent focal cerebral ischemia in mice. CNS Neurosci Ther. 20 (11), 989-997 (2014).
  7. Wang, C., Ma, X. Experimental study on establishing atherosclerotic animal models using high-fat diet combined with arterial intimal mechanical injury. J Pract Tradit Chin Intern Med. 26 (6), 31-33 (2012).
  8. Zhang, C., Li, L., Qi, W., Zhao, Y., Zhang, H. Intervention effect of puerarin on restenosis after carotid artery balloon injury in rats based on Wnt signaling pathway analysis. J Integr Tradit Chin West Med Cardiovasc Cerebrovasc Dis. 21 (4), 662-665 (2023).
  9. Cai, B., Xie, M. Effect of Xiaoyu Tablet on the stability of atherosclerotic plaque in rabbit abdominal aorta. J Chin Med Pharm. 5, 855-857 (2006).
  10. Liu, Z. Study on the mechanism of detoxification and blood circulation formula promoting vascular re-endothelialization after balloon injury of rat thoracic aorta. , Jiangxi Univ Tradit Chin Med. (2023).
  11. Chen, H., et al. N-methyl-D-aspartate receptor-mediated spinal cord ischemia-reperfusion injury and its protective mechanism. Folia Neuropathol. 60 (3), 308-315 (2022).
  12. Comba, F. G., Smith, J. A., Jones, R. B. The mechanical properties of human adipose tissues and their relationships to the structure and composition of the extracellular matrix. Am J Physiol Cell Physiol. 325 (5), C1226-C1240 (2023).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Emostasi arteriosaavvolgimento con grassopuntura arteriosa nel topoarteria carotide comuneinnesto di grasso autologopreservazione del flusso sanguignoimaging laser speckleflusso sanguigno cerebraleprevenzione dell ischemiavalutazione istologica

Articoli correlati