In questo studio, presentiamo un saggio cellulare in vitro per l'identificazione di sostanze chimiche teratogene. La dinamica della segnalazione del fattore di crescita dei fibroblasti (FGF)/fattore di risposta sierica (SRF) è stata misurata in cellule reporter staminali pluripotenti indotte (iPS) umane e il rischio di teratogenicità è stato valutato quantificando l'interruzione chimica di questa via di segnalazione.
Articolo metodologico
Test di tossicità per lo sviluppo basato sul monitoraggio in tempo reale dell'interruzione del segnale del fattore di crescita dei fibroblasti nelle cellule staminali pluripotenti indotte umane
In questo articolo
Sommario
Abstract
La tossicità per lo sviluppo (Devtox) è tipicamente valutata in modelli animali. Tuttavia, ci sono sfide nel garantire l'accuratezza, come i falsi negativi dovuti a differenze interspecie e preoccupazioni etiche relative al benessere degli animali. Pertanto, c'è bisogno di nuovi sistemi di test per valutare il Devtox umano e aiutare ad affrontare questi problemi. Abbiamo ipotizzato che i teratogeni interrompano le vie di segnalazione correlate a Devtox essenziali per la morfogenesi, indipendentemente dai loro bersagli molecolari. Per testare questa ipotesi, abbiamo sviluppato un sistema reporter del fattore di crescita dei fibroblasti (FGF) utilizzando cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) umane. Questo sistema consente di quantificare l'interruzione del segnale causata da sostanze chimiche, raggiungendo un tasso di precisione dell'83% per composti teratogeni e non teratogeni noti. Poiché l'attività di segnalazione Devtox cambia nel tempo, è importante catturarne continuamente le dinamiche piuttosto che misurarle a un singolo punto finale. L'uso di un sistema di misurazione della luminescenza in tempo reale è opzionale, ma migliora la risoluzione temporale con meno manodopera. L'intero test può essere completato entro 1 settimana, dalla semina delle cellule in una piastra di coltura all'acquisizione dei dati di luminescenza.
Introduzione
Alcune sostanze chimiche causano tossicità per lo sviluppo (Devtox), tra cui ritardi nella crescita, malformazioni, deficit funzionali e morte1. La valutazione di Devtox è essenziale per garantire la sicurezza di prodotti farmaceutici e pesticidi2. Gli attuali saggi Devtox si basano in genere su più modelli animali. Tuttavia, a causa delle differenze interspecie, i modelli animali hanno limitazioni intrinseche nell'estrapolare i risultati all'uomo3. La talidomide, una nota sostanza tossica per lo sviluppo, è stata prescritta per la prima volta alle donne in gravidanza alla fine degli anni '50 per alleviare la nausea mattutina. Sebbene la teratogenicità non sia stata osservata nei roditori, in tutto il mondo sono state riportate gravi malformazioni degli arti nei neonati umani. Questa tragedia ha evidenziato i limiti dei test di sicurezza sugli animali e ha spinto gli sforzi internazionali per introdurre e rivedere le linee guida sui test Devtox4. Inoltre, ci sono preoccupazioni relative al benessere degli animali, nonché ai notevoli tempi e costi necessari per i test sugli animali. Pertanto, sono necessari saggi in vitro alternativi in grado di prevedere con precisione il Devtox umano5.
Qui, proponiamo un test in vitro per valutare le sostanze tossiche per lo sviluppo basate sull'interruzione delle vie di segnalazione che sono critiche per lo sviluppo embrionale 6,7,8. Il test viene eseguito utilizzando cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) geneticamente modificate per esprimere la luciferasi NanoLuc (Nluc), un gene reporter luminescente, sotto il controllo dell'elemento di risposta sierica (SRE). Il SRE è il sito di legame per il fattore di risposta sierica (SRF), un fattore di trascrizione nella via di segnalazione del fattore di crescita dei fibroblasti (FGF). La SRF integra i segnali provenienti da più ligandi e regola l'espressione di oltre 200 geni che svolgono un ruolo essenziale in diversi processi biologici, tra cui lo sviluppo embrionale9.
In questo saggio, le cellule reporter sono state esposte a una sostanza chimica in esame e stimolate con FGF per attivare la segnalazione e amplificare qualsiasi interferenza da parte della sostanza chimica. Una caratteristica chiave di questo test è l'acquisizione delle dinamiche dell'attività di segnalazione al variare dell'intensità della luminescenza. Poiché l'attività di segnalazione varia nel tempo, le misurazioni del punto finale in un singolo punto temporale possono essere imprecise10. Infatti, le misurazioni in sette punti temporali per un periodo di 24 ore hanno dimostrato una migliore accuratezza predittiva, con un valore di area sotto la curva (AUC) di 0,837.
Le sostanze chimiche in esame possono essere applicate in un'ampia gamma di concentrazioni, da 0,01 ng/mL a 1000 μg/mL, a seconda della citotossicità e della solubilità. Sono necessarie circa 1,4 × 104 celle per seminare una singola piastra a 96 pozzetti. Una limitazione di questo test è che le sostanze chimiche teratogene possono non essere rilevabili se agiscono attraverso bersagli non espressi in cellule iPS umane indifferenziate. Inoltre, questo test potrebbe non catturare i metaboliti teratogeni. Inoltre, non fornisce informazioni dettagliate sui meccanismi alla base della tossicità teratogena o sui suoi esiti specifici.
L'uso di un sistema di monitoraggio della luminescenza in tempo reale migliora ulteriormente la risoluzione temporale, riduce la manodopera necessaria per le misurazioni continue e riduce al minimo gli artefatti derivanti dalla manipolazione ripetuta delle piastre di coltura. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per il test Devtox basato sull'interruzione del segnale. L'intera procedura può essere completata entro una settimana. Questo approccio può essere automatizzato, rendendolo adatto allo screening chimico e contribuendo a ridurre la sperimentazione animale.
Protocollo
In questo studio sono state utilizzate cellule iPS umane (201B7), con il gene Nluc sotto il controllo di un elemento di risposta sierica (SRE) inserito nel locus Adeno-Associated Virus Integration Site 1 (AAVS1) utilizzando il sistema CRISPR-Cas9 (Figura 1A). I dettagli dell'editing genetico per le cellule reporter (cellule iPS umane SRE-Nluc-knocked-in) sono stati riportati altrove6. Il protocollo si articola principalmente in tre fasi: 1) un test di citotossicità di una sostanza chimica per determinarne la massima concentrazione di esposizione, 2) test di interruzione del segnale e 3) analisi dei dati.
Per ridurre al minimo l'influenza dell'evaporazione media, eseguire tutti gli esperimenti di coltura cellulare utilizzando i 60 pozzetti centrali di una piastra da 96 pozzetti e aggiungere acqua ai pozzetti più esterni e agli spazi tra i pozzetti. Coprire la piastra con una pellicola sigillante permeabile ai gas durante l'incubazione per ridurre ulteriormente l'evaporazione.
1. Preparazione delle cellule
- Colture di cellule reporter per almeno 2 settimane dopo lo scongelamento del materiale congelato. Mantenere le cellule secondo un programma di ripetizione di 7 giorni e utilizzare le cellule del giorno 7 per il saggio. Ottimizza la densità di semina a ~80% di confluenza il giorno del passaggio.
- Seminare singole cellule a 2,0 × 105 cellule/pozzetto in una piastra a sei pozzetti rivestita con ECM con 2 mL di terreno di mantenimento fresco integrato con 10 μM di inibitore ROCK.
- Dopo 24 ore, sostituire il terreno con 2 mL/pozzetto di terreno di mantenimento fresco.
- A 72 h, raccogliere le cellule utilizzando un reagente di dissociazione a base di enzimi per ottenere una sospensione a cellula singola. Seminare a 1,0 × 105 cellule/pozzetto in una piastra a sei pozzetti rivestita ECM con 2 mL di terreno di mantenimento fresco integrato con 10 μM di inibitore ROCK.
- Dopo 24 ore, sostituire il terreno con 4 mL/pozzetto di terreno di mantenimento fresco.
- Dopo 96 ore, raccogliere le cellule come sospensione a cellula singola utilizzando un reagente di dissociazione a base di enzimi. Utilizzare queste celle per il test reporter.
2. Saggio di citotossicità
- Test preliminare
- Seminare singole cellule a 2,0 × 104 cellule/pozzetto in una piastra a 96 pozzetti rivestita con ECM con 200 μL di terreno di mantenimento fresco integrato con 10 μM di inibitore ROCK. Sigillare la piastra con una pellicola permeabile ai gas.
- A 24 ore, sostituire il terreno con 200 μL/pozzetto di terreno di manutenzione fresco e richiudere la piastra con una pellicola permeabile ai gas.
- A 72 ore, sostituire il terreno con 100 μL/pozzetto di terreno di prova e richiudere la piastra con una pellicola permeabile ai gas.
- A 96 ore, sostituire il terreno con 100 μL/pozzetto di terreno di prova.
NOTA: Se non si raggiunge il 100% di confluenza, interrompere il test. Poiché il tasso di crescita può variare in base alla linea cellulare, ottimizzare la densità di semina per garantire la piena confluenza il giorno del saggio. - Sciogliere la sostanza chimica in esame nel terreno di prova fino alla sua massima solubilità.
NOTA: Quando si utilizza il dimetilsolfossido (DMSO) come solvente, la concentrazione finale di DMSO non deve superare lo 0,1%. - Preparare una diluizione seriale di cinque punti e cinque volte della sostanza chimica in esame nel mezzo di saggio utilizzando la soluzione di cui al punto 2.1.5.
- Aggiungere 11 μL/pozzetto delle soluzioni chimiche del passaggio 2.1.6. Per il controllo del veicolo, aggiungere 11 μL/pozzetto di terreno di prova contenente la stessa concentrazione di DMSO.
- Dopo 48 h, incubare le piastre a 25 °C per 30 minuti.
- Aggiungere 111 μL/pozzetto di reagente per il saggio di vitalità cellulare luminescente pre-bilanciato a base di ATP a 25 °C. Per il bianco, preparare un pozzetto contenente 111 μL di terreno di prova e 111 μL di reagente.
- Agitare la piastra a 300 giri/min per 2 minuti utilizzando uno shaker per micropiastre.
- Trasferire 200 μl della miscela su una piastra nera per la misurazione della luminescenza. Incubare le piastre a 25 °C per 10 minuti.
- Misurare l'intensità della luminescenza per stimare la conta cellulare.
- Calcola la vitalità cellulare utilizzando la seguente formula:
Vitalità cellulare (%) = (RLU_sample − RLU_blank) / (RLU_vehicle − RLU_blank) × 100
NOTA: Determinare i passaggi successivi in base alla vitalità cellulare. Se la vitalità è del >50% a tutte le concentrazioni testate, procedere alla fase 2.2 con la massima concentrazione di solubilità. Se la vitalità supera il 50% entro l'intervallo testato, procedere al test di determinazione utilizzando la concentrazione più alta con vitalità >50%. Se la vitalità è del <50% a tutte le concentrazioni, ripetere la prova preliminare partendo da una concentrazione più bassa.
- Test di determinazione
- Seminare singole cellule a 2,0 × 104 cellule/pozzetto in una piastra a 96 pozzetti rivestita con ECM con 200 μL di terreno di mantenimento fresco integrato con 10 μM di inibitore ROCK. Sigillare la piastra con una pellicola permeabile ai gas.
- A 24 ore, sostituire il terreno con 200 μL/pozzetto di terreno di manutenzione fresco e richiudere la piastra con una pellicola permeabile ai gas.
- A 72 ore, sostituire il terreno con 100 μL/pozzetto di terreno di prova e richiudere la piastra con una pellicola permeabile ai gas.
- A 96 ore, sostituire il terreno con 100 μL/pozzetto di terreno di prova.
NOTA: Se non si raggiunge il 100% di confluenza, interrompere il test. Ottimizza la densità di semina per garantire la piena confluenza il giorno 4. - Sciogliere la sostanza chimica in esame nel terreno di prova in base ai risultati della prova preliminare (fase 2.1).
- Preparare una diluizione seriale doppia a nove punti della sostanza chimica in esame nel terreno di prova utilizzando la soluzione di cui al punto 2.2.5.
- Aggiungere 11 μL/pozzetto delle soluzioni chimiche del passaggio 2.2.6. Per il controllo del veicolo, aggiungere 11 μL/pozzetto di terreno di prova contenente la stessa concentrazione di DMSO.
- Dopo 48 h, incubare le piastre a 25 °C per 30 minuti.
- Aggiungere 111 μL/pozzetto di reagente per il saggio di vitalità cellulare luminescente pre-bilanciato a base di ATP a 25 °C. Per il bianco, preparare un pozzetto contenente 111 μL di terreno di prova e 111 μL di reagente.
- Agitare la piastra a 300 giri/min per 2 minuti utilizzando uno shaker per micropiastre.
- Trasferire 200 μl della miscela su una piastra nera per la misurazione della luminescenza. Incubare le piastre a 25 °C per 10 minuti.
- Misurare l'intensità della luminescenza per stimare la conta cellulare.
- Calcola la vitalità cellulare utilizzando la seguente formula:
Vitalità cellulare (%) = (RLU_sample − RLU_blank) / (RLU_vehicle − RLU_blank) × 100 - Generare una curva dose-risposta utilizzando i dati di nove concentrazioni e calcolare l'IC50 dalla curva.
3. Saggio reporter in tempo reale (Figura 1B)
- Seminare singole cellule a 2,0 × 104 cellule/pozzetto in una piastra a 96 pozzetti rivestita ECM con 200 μL di terreno di mantenimento fresco integrato con 10 μM di inibitore ROCK. Sigillare la piastra con una pellicola permeabile ai gas.
- A 24 ore, sostituire il terreno con 200 μL/pozzetto di terreno di manutenzione fresco e richiudere la piastra con una pellicola permeabile ai gas.
- A 72 ore, sostituire il terreno con 100 μL/pozzetto di terreno di prova e richiudere la piastra con una pellicola permeabile ai gas.
- A 96 ore, sostituire il terreno con 100 μL/pozzetto di terreno di prova contenente l'1% di substrato luminescente.
NOTA: Se non si raggiunge il 100% di confluenza, interrompere il test. Poiché il tasso di crescita può variare in base alla linea cellulare, ottimizzare la densità di semina per garantire la piena confluenza il giorno 4. - Sciogliere la sostanza chimica in esame nel terreno di prova alla concentrazione determinata nella sezione 2.
- Preparare una diluizione seriale doppia a otto punti della sostanza chimica in esame nel mezzo di analisi, partendo dalla soluzione preparata al punto 3.5.
- Due ore dopo lo scambio del mezzo nella fase 3.4, aggiungere 11 μl/pozzetto delle soluzioni chimiche della fase 3.6. Per il controllo del veicolo, aggiungere 11 μL/pozzetto di terreno di prova contenente la stessa concentrazione di DMSO.
- Un'ora dopo l'inizio dell'esposizione chimica (Fase 3.7), aggiungere 12 μL/pozzetto di terreno di prova contenente bFGF a una concentrazione finale di 2 ng/mL.
- Misura la luminescenza in modo continuo per 48 ore utilizzando un sistema di misurazione della luminescenza in tempo reale in atmosfera umidificata, 5% CO2 a 37 °C.
NOTA: Impostare il tempo 0 nel punto di aggiunta dell'FGF (vedere la Figura 1B).
4. Analisi dei dati (Figura 1C)
- Calcolare la variazione log2 volte (LogFC) dell'intensità della luminescenza normalizzando il gruppo di prova al controllo del veicolo:
LogFC = log2(Luc_sample / Luc_vehicle) - Integra LogFC nelle serie temporali di 48 ore per stimare l'area tra le curve (ABC) per i gruppi di test e di controllo del veicolo.
- Somma dei valori ABC di tutte le concentrazioni per quantificare l'entità complessiva dell'interruzione del segnale causata dalla sostanza chimica in esame.
- Eseguire l'analisi della curva delle caratteristiche operative del ricevitore (ROC) per determinare la soglia per la classificazione Devtox.
Risultati
Nella nostra esperienza, la morfologia cellulare è utile per determinare se un test è stato eseguito correttamente. La Figura 2A mostra le tipiche immagini al microscopio confocale delle cellule immediatamente prima e dopo l'esposizione chimica. Al termine del saggio, quasi l'intera superficie dei pozzetti è coperta da cellule. La Figura 2B mostra le immagini della colorazione di cellule vive/morte. Il numero di cellule morte colorate con ioduro di propidio (PI) aumenta dopo l'esposizione chimica; tuttavia, la vitalità cellulare è almeno del 50% e quasi tutte le cellule sono colorate con calceina-AM.
La tabella 1 elenca le sostanze chimiche in esame utilizzate nei nostri studi precedenti 7,8. Questi studi dimostrano che le sostanze chimiche Devtox possono essere distinte con maggiore precisione in base all'interruzione del segnale FGF nelle cellule iPS umane. Un risultato chiave è che il monitoraggio continuo dell'attività di segnalazione è fondamentale perché cambia dinamicamente nel tempo. L'uso di un sistema di misurazione della luminescenza in tempo reale fornisce una risoluzione temporale notevolmente più elevata con meno lavoro di misurazione. Qui descriviamo un protocollo che utilizza un sistema di monitoraggio in tempo reale.
La figura 3A mostra le variazioni dell'intensità della luminescenza nell'arco di 48 ore in sei pozzetti replicati nelle stesse condizioni senza la sostanza chimica in esame. Le sei curve sono quasi allineate, indicando una buona riproducibilità da pozzo a pozzetto. Sebbene non siano chiaramente identificati nelle misurazioni manuali a 24 ore nei nostri studi precedenti, due picchi distinti - un picco iniziale immediatamente dopo l'aggiunta del ligando FGF e un secondo picco a circa 24 ore - appaiono nelle misurazioni in tempo reale a 48 ore. La Figura 3B mostra le variazioni dell'intensità della luminescenza in seguito all'esposizione all'acido valproico (VPA), un noto tossico per lo sviluppo. Il VPA è un inibitore dell'istone deacetilasi che causa difetti nel tubo neurale, nel cuore e negli arti¹¹. Il VPA interrompe la segnalazione dell'FGF in modo dipendente dalla concentrazione. Il sistema di misurazione automatizzato in tempo reale ha acquisito la dinamica del segnale in modo più accurato rispetto alle misurazioni manuali.
Figura 1: Saggio di interruzione del segnale FGF/SRF. (A) Ingegneria genetica di cellule iPS umane per generare cellule reporter di segnale FGF/SRF. È stato costruito un plasmide contenente Nluc a valle dell'elemento di risposta sierica, bracci omologhi per knock-in mirato e il gene di resistenza alla puromicina sotto il controllo del promotore della fosfoglicerato chinasi umana. Dopo la selezione della puromicina, sono state stabilite le cellule reporter SRE-Nluc. (B) Calendario del saggio. Le cellule reporter sono state seminate in una piastra a 96 pozzetti e coltivate per 4 giorni fino a coprire l'intera superficie. Il substrato luminescente e la sostanza chimica in esame sono stati aggiunti rispettivamente 3 e 1 ora prima di iniziare la misurazione. Il tempo di aggiunta del ligando FGF è stato impostato a 0 ore e l'intensità della luminescenza è stata misurata continuamente nelle successive 48 ore. (C) Analisi dei dati. La dinamica del segnale è stata registrata in cellule esposte e non esposte alle sostanze chimiche in esame e normalizzata al controllo del veicolo per stimare l'area tra le curve come misura dell'interruzione del segnale causata da una sostanza chimica. I valori ABC sono stati ottenuti per ciascuna sostanza chimica a diverse concentrazioni ed è stata calcolata la loro somma. L'analisi della curva caratteristica operativa del ricevitore è stata eseguita utilizzando tutte le sostanze tossiche note per lo sviluppo testate per determinare la soglia. Abbreviazioni: iPS = cellule staminali pluripotenti indotte; RLU = Unità di Luce Relativa; AUC = Area sotto la curva; FGF = fattore di crescita dei fibroblasti; SRF = fattore di risposta sierica; SRE = elemento di risposta sierica; HA = braccio omologo; L = sinistra; R = destra; PuroR = gene di resistenza alla puromicina; hPGK = fosfoglicerato chinasi umano; Nluc = NanoLuc luciferasi; ROC = caratteristica di funzionamento del ricevitore; ABC = area tra le curve. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Morfologia cellulare e colorazione delle cellule vive/morte. A) Immagini microscopiche confocali di cellule prima (giorno 4) e dopo (giorno 6) l'esposizione a una sostanza chimica in esame. Le celle rimanenti che coprono quasi l'intera superficie dei pozzetti dopo il test sono un indicatore di un test di successo. Una copertura quasi completa del pozzetto alla fine del test indica un ciclo di successo. B) colorazione di cellule vive/morte prima e dopo l'esposizione a una sostanza chimica in esame. Le cellule vive sono state colorate di verde con Calceina-AM e le cellule morte sono state colorate di rosso con ioduro di propidio (PI). sono stati colorati con calceina-AM (verde) e cellule morte con ioduro di propidio (PI, rosso). La proporzione di cellule morte dovrebbe essere inferiore a quella che dovrebbe essere < il 50% delle cellule totali. Barre di scala = 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Esempi tipici di dinamica dell'intensità della luminescenza. (A) La luminescenza dell'andamento temporale cambia l'andamento temporale della luminescenza dopo la stimolazione del ligando FGF, misurata utilizzando un sistema di misurazione della luminescenza in tempo reale. L'intensità della luminescenza è stata monitorata ogni 22 minuti per 48 ore. Le sei linee colorate rappresentano i segnali provenienti da diversi pozzi. (B) Confronto tra misure di luminescenza manuali e in tempo reale con acido valproico. L'interruzione del segnale è stata osservata con entrambi i metodi di misurazione, mentre il monitoraggio in tempo reale ha catturato più chiaramente il segnale potenziato al secondo picco. Abbreviazioni: RLU = Unità di Luce Relativa; VPA = acido valproico; FGF = fattore di crescita dei fibroblasti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Clicca qui per scaricare questa tabella.
| Test chimico | Abbreviazione | Cas NO. | Studio degli animali (studio precedente) | Studio in vitro (questo studio) | Somma dei valori ABC | Concentrazione massima (μg/mL) |
| acido all-trans-retinoico | ATRA | 302-79-4 | P | P | 65.9 | 0.0100 |
| Idrossiurea | HU | 127-07-1 | P | P | 63.3 | 149 |
| Acido metossiacetico | MAA | 625-45-6 | P | P | 225 | 683 |
| Cloruro di metilmercurio | MeHg | 115-09-3 | P | P | 77.7 | 1.20 |
| Metotrexato idrato | MTX | 133073-73-1 | P | P | 80.5 | 5.00 |
| Salicilato di sodio | SA | 54-21-7 | P | P | 38.7 | 666 |
| acido valproico | AVP | 99-66-1 | P | P | 63.3 | 100 |
| 6-Aminonicotinamide | 6-AN | 329-89-5 | P | N | 24.9 | 1.00 |
| Acido borico | BA | 10043-35-3 | P | N | 24.2 | 250 |
| 5-bromo-2'-deossiuridina | BrdU | 59-14-3 | P | P | 83.9 | 50.0 |
| 5,5-dimetil-2,4-ossazolidindione | DMO | 695-53-4 | P | P | 50.3 | 840 |
| Cloruro di litio | LiCl | 7447-41-8 | P | N | 29.8 | 250 |
| 5-fluorouracile | 5-FU | 51-21-8 | P | P | 92.4 | 2.65 |
| Ciclofosfamide monoidrato | CPA | 6055-19-2 | P | N | 19.1 | 400 |
| Imatinib mesilato | IMA | 220127-57-1 | P | P | 42.4 | 12.5 |
| Lenalidomide | LEN | 191732-72-6 | P | P | 94.7 | 35.0 |
| Pomalidomide | INGLESE | 19171-19-8 | P | P | 50.9 | 2.50 |
| Talidomide | THA | 50-35-1 | P | P | 53.3 | 12.0 |
| Acrilamide | AcA | 79-06-01 | N | N | 37.1 | 454 |
| D-Canfora | CAMMA | 464-49-3 | N | N | 27.5 | 50.0 |
| Difenidramina cloridrato | DHM | 147-24-0 | N | P | 68.2 | 262 |
| Dimetilftalato | DMP | 131-11-3 | N | N | 24.4 | 100 |
| Penicillina G sale sodico | Peng | 69-57-8 | N | N | 22.1 | 1000 |
| Saccarina sodica | SACCO | 82385-42-0 | N | N | 34.0 | 1000 |
| Acetaminofene | APAP | 103-90-2 | N | N | 22.3 | 20.0 |
| Amoxicillina triidrato | AMX | 61336-70-7 | N | N | 28.4 | 25.0 |
| Cimetidina | CENTIMETRO | 51481-61-9 | N | N | 25.3 | 30.0 |
| Eritromicina | ERY | 114-07-8 | N | N | 20.0 | 15.0 |
| Idroclorotiazide | HCTZ | 58-93-5 | N | N | 21.9 | 20.0 |
| Sulfasalazina | SSZ | 599-79-1 | N | N | 30.8 | 100 |
| Chimico | AUC | Soglia | Sensibilità | Specificità | Accuratezza | |
| 30 sostanze | 0.819 | 37.9 | 0.778 | 0.917 | 0.833 |
Tabella 1: Sostanze chimiche Devtox e non Devtox classificate all'interno di esperimenti su animali e risultati stimati con e senza interruzione del segnale FGF. Abbreviazioni: P = positivo (Devtox); N = negativo (non Devtox).
Discussione
Lo sviluppo embrionale-fetale è strettamente regolato dalle reti di segnalazione12. Mentre il feedback all'interno di queste reti fornisce robustezza contro il rumore interno ed esterno, abbiamo ipotizzato che le sostanze chimiche Devtox possano esercitare effetti oltre tale buffering. Qui, presentiamo un protocollo per la stima delle sostanze chimiche Devtox basato sull'eccessiva interruzione della segnalazione FGF/SRF. Questo approccio non fornisce alcuna informazione riguardo ai meccanismi molecolari responsabili di Devtox, come le proteine bersaglio di una sostanza chimica, e si concentra solo sulla segnalazione FGF/SRF. Ciononostante, è stato possibile classificare le sostanze chimiche Devtox in modo efficiente, con un'accuratezza dell'83% e un'AUC di 0,819 (Tabella 1). Ciò è probabilmente dovuto al fatto che ogni via di segnalazione è strettamente associata ad altre e forma reti di segnalazione dense, e l'interruzione all'interno di queste reti provoca l'interruzione del segnale FGF/SRF.
Diverse sfide tecniche devono essere affrontate quando si generano celle reporter. Nluc è circa 100 volte più luminoso delle luciferasi convenzionali derivate da lucciole o Renilla, consentendo un monitoraggio continuo a lungo termine dei cambiamenti di segnale13. Nluc contenente la sequenza PEST è stato utilizzato per catturare in modo più accurato la dinamica dell'attività di segnalazione. La sequenza PEST promuove la degradazione delle proteine. Mentre la proteina Nluc è stabile con un'emivita superiore a 6 ore, il tag PEST accelera la degradazione attraverso la via ubiquitina-proteasoma, riducendo la sua emivita a 10-30 minuti. Inoltre, il gene reporter è stato inserito nel locus AAVS1, un "porto sicuro" genomico, assicurando che l'espressione non venga silenziata e che i geni essenziali non vengano accidentalmente interrotti14.
Nella valutazione dei metodi di prova, è fondamentale selezionare le sostanze chimiche di riferimento per Devtox e non Devtox. Abbiamo selezionato le sostanze chimiche di riferimento dagli elenchi dello studio di convalida internazionale ECVAM, dalle linee guida ICH S5 (inclusa la talidomide) e dagli studi sugli animali7. Abbiamo elencato 30 sostanze chimiche Devtox e non Devtox, ma è necessario aggiungere e testare altre sostanze chimiche provenienti da fonti affidabili. Pertanto, la soglia ROC (Sum ABC = 37,9) qui riportata dovrebbe essere considerata preliminare e richiederà la convalida con un insieme più ampio e indipendente di composti per garantire la robustezza statistica. La ciclofosfamide (CPA) è stata una delle tre sostanze chimiche con risultati falsi negativi. La CPA è idrossilata nel fegato in 4-idroperossiciclofosfamide e la CPA e i suoi prodotti di degradazione sono teratogeni15. I saggi in vitro, compreso il nostro approccio, in genere non considerano il metabolismo e non sono in grado di rilevare le sostanze chimiche che inducono Devtox attraverso il metabolismo. Si tratta di un limite dell'approccio proposto. Oltre ai falsi negativi dipendenti dal metabolismo (ad esempio, CPA), abbiamo anche osservato un falso positivo con difenidramina cloridrato (DHM). Le prove epidemiologiche non supportano fortemente un'associazione causale tra DHM e malformazioni congenite, ma diversi studi in vitro lo hanno classificato come tossico per lo sviluppo; Ciò probabilmente ha contribuito alla sua errata classificazione nel nostro saggio. Al contrario, la 6-aminonicotinamide (6-AN) non ha interrotto la segnalazione FGF/SRF ed è stata quindi classificata in modo errato, suggerendo che il suo meccanismo di tossicità per lo sviluppo possa procedere attraverso percorsi non catturati da questo reporter. Insieme, questi esempi supportano l'espansione del pannello di analisi per includere ulteriori vie di segnalazione dello sviluppo per ridurre sia i falsi positivi che i falsi negativi.
Diversi fattori hanno una grande influenza su questo test. Uno di questi fattori è la preparazione cellulare prima del test. Per ridurre al minimo questo problema, le cellule sono state mantenute con un programma di ripetizione di 7 giorni per garantire che le cellule utilizzate nel test fossero raccolte nelle stesse condizioni di crescita. Le cellule vengono seminate il lunedì, passate il giovedì e una parte viene utilizzata per il saggio e seminata per il passaggio successivo. Un altro fattore è la densità cellulare al momento dell'esposizione a una sostanza chimica in esame. Il test è stato eseguito solo quando le cellule hanno raggiunto il 100% di confluenza il giorno dell'esposizione chimica. Gli effetti dei bordi nelle piastre a 96 pozzetti sono ben noti. In questo test, sono stati utilizzati solo i 60 pozzetti interni della piastra da 96 pozzetti per evitare effetti di bordo. Oltre alle considerazioni generali, durante un test può verificarsi variabilità tecnica. Un problema comune era l'intensità della luminescenza incoerente tra i pozzetti nel gruppo di controllo del veicolo, che potrebbe essere il risultato di una semina cellulare irregolare o di una qualità cellulare non ottimale. Si consiglia di mantenere le cellule a circa l'80% di confluenza per ridurre al minimo questa variabilità e di verificare una crescita uniforme tra i pozzetti il giorno dopo la semina. La regolazione della densità di semina delle iPSC può anche migliorare la riproducibilità del saggio. Inoltre, un'eccessiva morte cellulare può portare a fluttuazioni di luminescenza non specifiche non correlate al segnale sperimentale. Pertanto, valutare la morfologia cellulare alla fine del test per assicurarsi che le cellule siano in condizioni adeguate durante la misurazione. Nei saggi manuali, la rimozione della piastra dall'incubatore in ogni momento espone le cellule a brevi variazioni di temperatura e livelli di CO2. Per limitare queste fluttuazioni ambientali, le misurazioni devono essere eseguite in modo rapido e coerente.
Questo test può essere eseguito manualmente o utilizzando un sistema di misurazione in tempo reale. L'approccio manuale non richiede apparecchiature specializzate, ma un sistema di misurazione in tempo reale consente un rilevamento più preciso della dinamica del segnale. Sebbene non sia stato identificato nelle misurazioni manuali, il sistema di misurazione in tempo reale ha catturato chiaramente due picchi del segnale di luminescenza. Nelle misurazioni manuali, durante la notte si è verificato un intervallo di 12 ore nell'acquisizione dei dati, che potrebbe aver portato alla sottostima o alla perdita del secondo picco. Questi due picchi possono essere causati da un feedback negativo dalla segnalazione FGF e dalla presenza di un ligando FGF termicamente stabile. In particolare, l'interruzione del segnale FGF da parte di una sostanza chimica a volte sembrava essere maggiore nel secondo picco rispetto al primo picco (Figura 3B).
Questo protocollo rappresenta un approccio promettente per lo screening chimico Devtox utilizzando un saggio reporter basato su iPSC umane per valutare quantitativamente l'interruzione del segnale FGF. Negli ultimi decenni sono stati sviluppati diversi test in vitro alternativi per la tossicità dello sviluppo, tra cui il test delle cellule staminali embrionali di topo (mEST)16, il test delle cellule staminali embrionali basato su Hand1 (Hand1-EST)17 e ReProGlo18. Rispetto a questi saggi convenzionali, questo metodo ha dimostrato un'accuratezza predittiva superiore. Negli ultimi anni, nell'ambito degli sforzi internazionali volti a stabilire sistemi di sperimentazione non animale sono state introdotte strategie alternative, come quelle che impiegano cellule staminali umane o embrioni di pesce zebra. Questi approcci hanno anche riportato un'elevata accuratezza predittiva per le valutazioni della tossicità dello sviluppo. Per migliorare ulteriormente le prestazioni di questo test, può essere utile incorporare ulteriori vie di segnalazione coinvolte nello sviluppo embrionale. Ci sono molte altre importanti vie di segnalazione nella morfogenesi dello sviluppo, come la segnalazione Wnt/β-catenina, BMP/SMAD e la segnalazione Hedgehog/GLI19. Diverse combinazioni di cellule reporter utilizzate per valutare queste vie di segnalazione possono fornire una valutazione più completa di varie sostanze chimiche. L'effetto della fase di differenziazione delle cellule iPS, ad esempio, la fase più precoce in cui si formano i tre strati germinali, sulla sensibilità di rilevamento di questo test sarà il nostro futuro argomento di ricerca. Studi futuri potrebbero anche esplorare la convalida tra specie utilizzando sistemi di cellule staminali di roditori o conigli per consentire il confronto diretto con i set di dati in vivo in quelle specie, mentre il nostro obiettivo principale rimane sulle cellule iPS umane per massimizzare la rilevanza umana.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da JSPS, Giappone [numero di sovvenzione KAKENHI 23K25021 e 25K03278]; MHLW, Giappone [numero di sovvenzione del programma 23KD1003 e 24KD1003]; KISTEC, Giappone; e AMED, Giappone [numeri di sovvenzione JP23mk0101252 e 25mk0121314].
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tubo microcentrifuga da 1,5 mL | FastGene | FG-MCT015C | Preparazione chimica di prova |
| Tubo centrifuga da 15 mL | VIOLAMO | 1-3500-21 | Coltura cellulare |
| Tubo PCR a 8 strisce | Watson | 137-333C | Preparazione chimica di prova |
| Piastra inferiore bianca/trasparente a 96 pozzi, superficie TC | Thermo Fisher Scientific | 165306 | Coltura cellulare e misurazioni di luminescenza |
| Micropiastra nera con fondo piatto 96Well | ASONE | 3-3321-04 | Per la misurazione della luminescenza negli saggi di citotossicità |
| Respira - PIÙ FACILE | TOHO | BERM-2000 | Film sigillante permeabile al gas |
| Saggio di Viabilità delle Celle Luminescenti CellTiter-Glo | Promega | G7572 | Test di citotossicità |
| Centrifuga 5702 R | Eppendorf | Centrifugazione | |
| ClipTip 300, Filtrato, Sterile, Rack | Thermo Fisher Scientific | 94420513 | |
| ClipTip 50, Filtrato, Sterile, Rack | Thermo Fisher Scientific | 94420253 | |
| Contessa 3 FL Contatore Automatico delle Celle | Invitrogen | Conteggio delle celle | |
| Cancelli della camera di conteggio delle celle della Contessa | Invitrogen | C10312 | Conteggio delle celle |
| Cultura Certo: DMSO | FUJIFILM Wako | 031-24051 | Solvente per sostanze chimiche |
| CultureSure Y-27632 | FUJIFILM Wako | 036-24023 | Inibitore ROCK per la semina di iPSC |
| DMEM/F12 HEPES, senza fenolo rosso | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | Rivestimento per coltura cellulare iPS |
| F1-ClipTip Multichannel Pipettes, 30-300 & micro; L | Thermo Fisher Scientific | 4661180N | |
| F1-ClipTip Pipette multicanale, da 5 a 50 & micro; L | Thermo Fisher Scientific | 4661160N | |
| Chip filtro | Watson | ||
| Matrice della membrana basale senza fattore di crescita ridotto senza Geltrex | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | Rivestimento per coltura cellulare iPS |
| HIENAI Mat 01R | COSMO BIO | HMAT01R | Per mantenere la stabilità della temperatura della lastra durante la gestione della coltura cellulare |
| Scaldatubo HIENAI GX01 | COSMO BIO | TWGX013 | Per mantenere il mezzo caldo durante la maneggiamento sperimentale |
| Proteina ricombinante bFGF stabili al calore umano | Thermo Fisher Scientific | PHG0367 | Stimolazione FGF per il saggio del reporter |
| Cellule Staminali Pluripotenti Indotte Umane (iPS) | 201B7 (RCB Cat# HPS0063, RRID: CVCL_A324) | RIKEN BRC Cell Bank | |
| Shaker a micropiastra | TAITEC | 0089532-000 | Scuotimento della placca per il test della citotocicità |
| Lettore multiplo | PerkinElmer | ARVO X4 | Misurazione della luminescenza |
| Substrato a cellule vive di endurazina nano-glo | Promega | N2571 | Substrato di luminescenza |
| PBS (-) | FUJIFILM Wako | 166-23555 | Culutre cellulare |
| Parafilim | COME UNO | 65-1681-93 | Conservata per la piastra di rivestimento |
| Pipetto | eppendorf | ||
| WSL-1563 KronosHT | ATTO | 3510140 | Sistema di misurazione della luminescenza in tempo reale |
| Serbatoio | BMBio | BM-0850-1 | |
| STEMdif APEL2 Medium | Tecnologie STEMCELL | ST-05275 | Mezzo per il saggio |
| StemFlex Medium | Thermo Fisher Scientific | A3349401 | Mezzo di manutenzione |
| Acqua sterile, senza endotossine | FUJIFILM Wako | 196-15645 | Controllo dell'umidità per la coltura cellulare iPS |
| Placca di coltura tissutale VTC-P6 | VIOLAMO | 2-8588-01 | Cultura cellulare |
| TrypL Select Enzyme (1X), senza fenolo rosso | Thermo Fisher Scientific | 12563011 | Coltura cellulare |
| Acido valproico | FUJIFILM Wako | 227-01071 | Chimico di prova |
Riferimenti
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