Articolo metodologico

Chip microfluidico per la costruzione di modelli di lesioni assonali e l'abilitazione dell'analisi multi-omica

DOI:

10.3791/68915

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14 ottobre 2025

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1Beijing Advanced Innovation Center for Big Data-Based Precision Medicine, Beihang University, 2Interdisciplinary Innovation Institute of Medicine and Engineering, Beihang University, 3School of Biological Science and Medical Engineering, Beihang University, 4School of Software, Beihang University, 5School of Beijing, Beihang University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive un sistema microfluidico che modella le dinamiche metaboliche neuronali post-danno assonale, consentendo l'imaging, l'analisi multi-omica e gli studi meccanicistici del rimodellamento metabolico intrinseco.

Abstract

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I neuroni si polarizzano per formare dendriti e assoni, consentendo la comunicazione intercellulare. La lesione assonale interrompe queste connessioni e trasmette segnali di danno al soma, portando spesso alla degenerazione neuronale. Pertanto, il mantenimento dell'omeostasi assonale è essenziale per promuovere la rigenerazione locale degli assoni e proteggere dalla neurodegenerazione. Questo processo si basa sul metabolismo cellulare per fornire energia e precursori biosintetici ed è sostenuto da meccanismi che regolano l'equilibrio metabolico ed eliminano i sottoprodotti. Tuttavia, il metabolismo neuronale è compartimentalizzato tra il soma e l'assone ed è ulteriormente influenzato in vivo dal microambiente circostante, come l'attività metabolica derivata dagli astrociti (ad esempio, la navetta lattato astrocita-neurone). Questi fattori complicano lo studio dei meccanismi metabolici intrinseci dei neuroni. Per affrontare queste sfide, qui abbiamo sviluppato una piattaforma microfluidica per la coltura di neuroni corticali primari in vitro che preserva le caratteristiche metaboliche chiave osservate in vivo, tra cui il flusso glicolitico fisiologico e la respirazione mitocondriale. Questo sistema fornisce un modello semplificato per lo studio del rimodellamento metabolico intrinseco nei neuroni dopo una lesione assonale. I chip microfluidici convenzionali supportano modelli di lesioni assonali in vitro e sono compatibili con l'imaging di cellule vive, la colorazione in immunofluorescenza e il trattamento dell'ipossia. Per consentire analisi trascrittomiche e metabolomiche su larga scala che coinvolgono milioni di cellule, abbiamo ulteriormente progettato e fabbricato chip microfluidici ad alto rendimento con protocolli operativi ottimizzati. Il dispositivo è dotato di camere soma e assoniche disposte alternativamente collegate da microcanali e la lesione assonale è indotta dall'aspirazione a vuoto del fluido dal compartimento assonale. Questa piattaforma consente una rapida valutazione della dinamica dei metaboliti e degli enzimi, migliorando l'accuratezza e la riproducibilità delle indagini multi-omiche.

Introduzione

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I neuroni stabiliscono due tipi distinti di protrusioni con funzioni specializzate, assoni e dendriti, attraverso la polarizzazione durante lo sviluppo 1,2. La rigenerazione nervosa si riferisce al processo di ricrescita assonale dopo una lesione neurale3, con un focus di ricerca sulla riparazione del sistema nervoso centrale (SNC). A differenza del sistema nervoso periferico, il SNC ha una capacità rigenerativa limitata 4,5,6, che spesso si traduce in menomazioni funzionali persistenti o disabilità permanenti nei pazienti con lesioni del midollo spinale o lesioni cerebrali traumatiche 7,8. Pertanto, lo sviluppo di strategie per migliorare la riparazione del SNC e chiarire i meccanismi alla base della rigenerazione assonale sono fondamentali.

I dispositivi microfluidici, che funzionano come sistemi di coltura in vitro integrati, economici e ad alto rendimento, hanno mostrato notevoli vantaggi nella ricerca cellulare e neuronale negli ultimi anni 9,10. Rispetto ai metodi tradizionali, la tecnologia microfluidica consente una regolazione precisa dello stress di taglio dei fluidi, dei gradienti di concentrazione e delle strutture spaziali, simulando così da vicino i microambienti fisiologici e patologici autentici per promuovere la crescita, la migrazione, la differenziazione e le interazioni cellulari 11,12,13,14. I modelli di lesione assonale in vitro basati sulla microfluidica consentono la coltura compartimentalizzata di corpi e processi cellulari neuronali attraverso la polarizzazione spaziale, fornendo uno strumento indispensabile per esplorare la capacità rigenerativa intrinseca dei neuroni e i loro adattamenti metabolici a seguito di lesione15,1 6,17,18. Fornisce una finestra critica su come i neuroni rispondono alle lesioni, regolano i processi metabolici19 e promuovono la rigenerazione assonale20. Tuttavia, le piattaforme microfluidiche esistenti per il danno assonale e la ricerca metabolica devono ancora affrontare sfide, tra cui la bassa resa delle cellule neuronali, la ridotta accuratezza nelle misurazioni metaboliche e la mancanza di procedure operative standardizzate.

In risposta a queste limitazioni, questo studio ha sviluppato una nuova piattaforma microfluidica su larga scala che consente l'induzione standardizzata e ad alto rendimento del danno assonale e fornisce materiale cellulare sufficiente per analisi multi-omiche compartimentalizzate. Questo design integrato affronta direttamente le esigenze critiche insoddisfatte nella ricerca sulle lesioni neurali. In particolare, il chip microfluidico che abbiamo progettato presenta una disposizione alternata di camere somiali e assonali collegate da microscanalature, con transezione assonale ottenuta attraverso l'aspirazione controllata del vuoto. Questo approccio è ideale per gli studi che richiedono modelli di lesioni assonali riproducibili e ad alto rendimento e una profilazione metabolica precisa, come lo studio dei meccanismi metabolici alla base della rigenerazione assonale. Rispetto ai metodi tradizionali, questa tecnica offre una maggiore produttività, una maggiore precisione metabolica e la capacità di stabilire modelli di lesione standardizzati. Ad esempio, studi precedenti hanno dimostrato l'importanza del trasporto mitocondriale nella rigenerazione assonale 20,21,22,23, mentre la nostra piattaforma rivela ulteriormente il ruolo del metabolismo del glucosio nella rigenerazione assonale a seguito di lesioni. Questo protocollo stabilisce un sistema tecnico per l'assotomia su larga scala e l'analisi metabolica che è sia visivamente verificabile che standardizzato operativamente.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida del Comitato Etico dell'Università di Beihang e sono stati approvati dal comitato (codice di approvazione: BM20210060). La Figura 1 delinea la sequenza temporale sperimentale.

1. Progettazione del dispositivo microfluidico convenzionale e su larga scala

  1. Progetta il dispositivo microfluidico utilizzando AutoCAD per creare schemi bidimensionali (2D) e modelli strutturali tridimensionali (3D).
  2. Usa questi disegni per fabbricare uno stampo master su un wafer di silicio con fotolitografia negativa SU-8.
  3. Replicare lo stampo master mediante colata di polidimetilsilossano (PDMS), ottenendo un chip microfluidico funzionale ad alta precisione.
  4. Progetta ogni microcanale in modo che sia alto 5 μm, consentendo il passaggio solo degli assoni mentre blocca i soma.
  5. Rendere i microcanali larghi 10 μm per aumentare la capacità assonale.
  6. Progetta le camere in modo che siano di 120 μm di altezza e 220 μm di larghezza, fornendo spazio sufficiente per il soma neuronale.
  7. Utilizza questa piattaforma microfluidica per simulare una lesione assonale in vivo controllando il flusso del fluido e il posizionamento dei neuroni.
  8. Prepara campioni metabolomici e trascrittomici utilizzando il dispositivo per la manipolazione cellulare ad alta precisione e abilita l'elaborazione ad alto rendimento per migliorare l'accuratezza del campione e la validità biologica.

2. Fabbricazione di dispositivi microfluidici convenzionali e su larga scala

  1. Pesare la base PDMS e l'agente indurente con un rapporto di 10:1 (p/p) e metterli in una provetta da centrifuga.
  2. Posizionare la provetta da centrifuga contenente la miscela PDMS in un miscelatore con agitatore centrifugo. Centrifugare a 2000 × g per 4 minuti per mescolare, quindi centrifugare nuovamente a 2000 × g per 4 minuti per degassare.
  3. Versare 13-15 g di PDMS degasato nello stampo microfluidico, assicurandosi che il fondo dello stampo sia completamente coperto.
  4. Mettere lo stampo in un essiccatore sottovuoto. Utilizzare una pompa a vuoto per evacuare l'aria per 5-10 minuti per rimuovere completamente le bolle dal PDMS.
  5. Utilizzare un bulbo di gomma per picchiettare delicatamente la superficie del PDMS per rompere eventuali bolle superficiali rimanenti.
  6. Mettere lo stampo in forno ventilato e cuocere a 80 °C per 100 min per polimerizzare il PDMS.
  7. Una volta che il PDMS è completamente indurito, far scorrere delicatamente la punta di un bisturi sotto il bordo del PDMS per sollevarlo e separarlo con cautela dallo stampo.
  8. Utilizzare un punzone per biopsia con un diametro di 2,0-2,5 mm per creare fori nel PDMS per l'infusione del terreno di coltura e il caricamento delle cellule.
  9. Rimuovere eventuali impurità superficiali dal PDMS utilizzando del nastro adesivo, quindi posizionarlo in un piatto di vetro pulito e avvolgerlo con un foglio di alluminio per la conservazione.
  10. (Facoltativo) Trattare la superficie PDMS con plasma di ossigeno (30 W, 20 s) e quindi premerla contro un'altra superficie per un incollaggio irreversibile.
  11. Prima dell'esperimento, sterilizzare in autoclave il dispositivo microfluidico a 121 °C e 101 kPa per 5 minuti per garantire la sterilità.

3. Preparazione dei neuroni corticali

  1. Anestetizzare 3 ratti Sprague-Dawley (SD) postnatali (entro 12 ore dalla nascita) mettendoli in ghiaccio per 5 minuti, quindi decapitarli rapidamente.
  2. Sezionare l'area motoria della corteccia cerebrale e posizionare il tessuto in un tampone di dissezione pre-raffreddato (ad esempio, 2 ml di HBSS senza calcio e magnesio).
    NOTA: Eseguire tutte le procedure di dissezione dei tessuti su ghiaccio utilizzando soluzioni pre-refrigerate.
  3. Tritare il fazzoletto in circa 1 mm, 3 pezzi utilizzando le forbici sterili e trasferirlo in una provetta da centrifuga da 15 ml.
  4. Lasciare riposare per 5 minuti e poi aspirare con cura il surnatante per rimuovere il sangue residuo e il tampone.
  5. Aggiungere una soluzione di papaina preriscaldata (1 mg/mL) in 5 mL di HBSS con calcio e magnesio riscaldati a 37 °C.
  6. Incubare in un'incubatrice a 37 °C, 5% CO2 per 40 minuti, capovolgendo delicatamente la provetta 3 volte ogni 10 minuti.
  7. Dopo la digestione, triturare delicatamente la sospensione 100 volte utilizzando una pipetta da 200 μl.
    NOTA: Evitare di introdurre bolle d'aria per evitare lo stress cellulare.
  8. Centrifugare a 300 × g per 3 minuti ed eliminare il surnatante.
  9. Aggiungere una soluzione di terminazione contenente 1 mg/mL di inibitore della proteasi (ad es. 600 μL di fiala di inibitore del kit di dissociazione della papaina in 5 mL di HBSS con calcio e magnesio) per risospendere le cellule.
  10. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 μm e raccogliere il filtrato in una nuova provetta da centrifuga.
  11. Centrifugare il filtrato a 200 × g per 10 minuti ed eliminare il surnatante.
  12. Risospendere il pellet in 500 μl di terreno di coltura neuronale completo contenente il 2% di B27 e l'1% di GlutaMAX.
  13. Contare le cellule (circa 3 milioni/ratto) e regolare la densità a 1 × 106 cellule/mL per l'uso successivo.

4. Rivestimento

NOTA: Trattare i vetrini coprioggetti o le piastre di coltura con una soluzione di poli-D-lisina (PDL) per migliorare l'adesione dei neuroni e creare un ambiente ottimale per la crescita neuronale.

  1. Rivestimento di vetrini coprioggetti
    1. Posizionare un vetrino coprioggetti destinato ai dispositivi microfluidici convenzionali (Φ25 mm, spessore 0,17 mm) in una piastra di coltura da 35 mm e aggiungere 2 mL di soluzione PDL 0,1 mg/mL.
    2. Incubare a 37 °C per 6 ore o tutta la notte.
    3. Dopo l'incubazione, recuperare con cura la soluzione PDL per il riutilizzo o il corretto smaltimento.
    4. Aggiungere 2 ml di acqua ultrapura sterile alla piastra e ruotarla 50 volte in senso orario, quindi 50 volte in senso antiorario (per più piatti, ruotarli contemporaneamente in un piatto più grande).
    5. Aspirare l'acqua utilizzando una pompa a vuoto collegata a un puntale per pipetta sterile, raccogliendo i rifiuti in un contenitore per rifiuti liquidi.
    6. Ripetere la procedura di lavaggio (passaggi 4.1.4-4.1.5) tre volte in totale.
    7. Lasciare asciugare naturalmente i vetrini coprioggetti all'aria in una cabina di biosicurezza prima dell'uso.
  2. Rivestimento del piatto di coltura
    1. Aggiungere una quantità appropriata di soluzione PDL da 0,1 mg/mL alla piastra di coltura o alla piastra a pozzetti (ad esempio, aggiungere 2 mL a una piastra da 35 mm per la microfluidica convenzionale e 5 mL a una piastra da 10 cm per la microfluidica su larga scala).
      NOTA: Assicurarsi che la cabina di biosicurezza funzioni correttamente con un flusso d'aria sterile per evitare contaminazioni.
    2. Assicurarsi che la soluzione copra completamente il fondo e incubarla a 37 °C per 6 ore o durante la notte.
    3. Dopo aver recuperato la soluzione PDL, lavare la piastra di coltura tre volte con una quantità appropriata di acqua ultrapura sterile, come descritto al punto 4.1.4.
    4. Rimuovere eventuali residui di acqua ultrapura e asciugare all'aria la piastra di coltura in una cappa a flusso laminare per un uso successivo.

5. Preparazione del mezzo neuronale

  1. Preparare il terreno completo per la coltura neuronale di routine.
    1. Rimuovere lo stantuffo da una siringa monouso da 50 ml. Posizionare la siringa con la testina di gomma rivolta verso l'alto su un banco pulito all'interno di una cabina di biosicurezza.
    2. Aggiungere 500 μL di penicillina streptomicina (PS), 1 mL di B27, 125 μL di GlutaMAX e 500 μL di siero fetale bovino (FBS) nella siringa in sequenza. Sostituire il puntale della pipetta per ogni componente per evitare la contaminazione incrociata.
      NOTA: Aggiungere ciascun componente nell'ordine specificato per mantenere la coerenza.
    3. Prendi una nuova provetta da centrifuga sterile da 50 ml. Etichettalo come "Neurobasal-A (NBA) + 2% B27 + 0,25% GlutaMAX + 1% FBS + 1% PS".
      NOTA: Utilizzare NBA se non neuroni embrionali; utilizzare neurobasale (NB) per i neuroni embrionali.
    4. Collegare un filtro per siringa da 0,22 μm all'estremità della siringa.
      NOTA: Assicurarsi che il filtro sia saldamente collegato alla siringa per evitare perdite.
    5. Utilizzare NBA per riempire la siringa con liquido fino a 50 ml, compreso il volume degli additivi. Reinstallare lo stantuffo.
    6. Spingere lentamente lo stantuffo a circa 2 ml/s per filtrare il liquido nella provetta da centrifuga etichettata.
    7. Serrare il tappo della provetta da centrifuga. Capovolgere il tubo 3-5 volte per mescolare il mezzo.
  2. Terreno completo contenente [U-13C6]-glucosio (per l'analisi del flusso metabolico): per l'analisi del flusso metabolico del metabolismo del glucosio nei neuroni danneggiati, utilizzare NBA senza zucchero per preparare un terreno completo contenente [U-13C 6]-glucosio.
    1. Utilizzare NBA privo di glucosio come soluzione base e aggiungere [U-13C6]-glucosio a una concentrazione finale di 25 mM prima della filtrazione (se [U-13C6]-glucosio è solido, calcolarlo e pesarlo in anticipo). Seguire la stessa sequenza per l'aggiunta di altri componenti, nonché per le fasi di filtrazione e miscelazione, come descritto nella sezione 5.1.

6. Conteggio delle cellule

  1. Pulire accuratamente l'emocitometro con etanolo al 75%. Assicurarsi che tutte le superfici siano completamente asciutte prima di procedere.
  2. Aggiungere 90 μl di tampone salino tamponato con fosfato sterile (PBS) a una provetta da centrifuga sterile da 1,5 mL.
  3. Risospendere delicatamente la sospensione di cellule neuronali raccolta pipettandola su e giù 3-5 volte per garantire una miscelazione accurata.
  4. Utilizzando una pipetta da 10 μl, trasferire 10 μl della sospensione di cellule miscelate nella provetta da centrifuga contenente 90 μl di PBS (diluizione 1:10).
  5. Utilizzare una pipetta da 200 μl per mescolare delicatamente la soluzione 10 volte, assicurandosi che non si formino bolle.
  6. Sostituire il puntale della pipetta con un nuovo puntale da 10 μl. Aspirare 10 μl della miscela e aggiungerla alla camera del campione dell'emocitometro.
  7. Posizionare l'emocitometro sul tavolino del microscopio e mettere a fuoco utilizzando l'obiettivo 20x. Individua la griglia centrale 4 × 4 e conta le celle in tutti i 16 quadrati seguendo le regole standard dell'emocitometro.
  8. Registra il conteggio totale delle celle da tutti i 16 quadrati. Calcolare la concentrazione cellulare utilizzando la formula: (Conteggio totale × 10) × 104 cellule/mL.
    NOTA: Lavorare sempre in una cabina di biosicurezza con adeguati dispositivi di protezione individuale.

7. Coltura in vitro di neuroni corticali in dispositivi microfluidici convenzionali o su larga scala

  1. Protocollo A (Dispositivi microfluidici convenzionali).
    1. Verificare che la superficie di vetro della piastra di coltura da 35 mm sia completamente asciutta.
    2. Utilizzando una pinza sterile a punta fine, posizionare il chip microfluidico autoclavato al centro della superficie del vetro con i microcanali rivolti verso il basso.
    3. Premere delicatamente il chip sulla superficie del vetro utilizzando un puntale per pipetta da 200 μl per garantire un'adesione completa.
    4. Contrassegnare la camera sinistra con un punto (·) utilizzando un pennarello indelebile per designare il compartimento del soma.
    5. Aspirare 10 μl di sospensione neuronale (10 milioni di cellule/mL) utilizzando una pipetta da 10 μl.
    6. Erogare lentamente la sospensione nella porta di carico sopra lo scomparto soma contrassegnato.
    7. Verificare il corretto flusso del fluido nel serbatoio inferiore della camera sinistra.
    8. Trasferire la piastra di coltura in un'incubatrice umidificata (37 °C, 5% CO2) per 20 minuti.
    9. Rimuovere il piatto di coltura dall'incubatrice.
    10. Utilizzando un microscopio a contrasto di fase da 20 ×, confermare la perfusione del terreno dal compartimento soma al compartimento assonale attraverso i microcanali.
    11. Aggiungere 150 μl di terreno basale neuronale alla porta superiore del compartimento assonale (camera destra), consentendo il flusso guidato dalla gravità al serbatoio inferiore.
    12. Allo stesso modo, aggiungere 15 μl di terreno neuronale completo alla porta superiore del compartimento soma (camera sinistra).
      NOTA: In questa fase, i neuroni dovrebbero aderire visibilmente, con la maggior parte dei detriti cellulari scaricati nel pozzetto inferiore. Non sostituire il terreno durante la coltura; Utilizzare una singola aggiunta di mezzo neuronale completo come descritto al punto 5.1.3.
    13. Versare 20 ml di acqua ultrapura in un piatto di coltura da 150 mm per creare una camera di umidità. Posizionare il piatto di coltura da 35 mm all'interno del piatto grande.
    14. Trasferire l'intero sistema di coltura nell'incubatrice e mantenerlo per la durata richiesta (ad es. 7 giorni).
      NOTA: Eseguire tutte le procedure di coltura cellulare in condizioni sterili in una cappa di biosicurezza. Indossare adeguati dispositivi di protezione individuale (camice e guanti). Decontaminare le superfici di lavoro prima e dopo le procedure.
  2. Protocollo B (Chip microfluidici su larga scala).
    NOTA: Il protocollo standard delle specifiche convenzionali è stato seguito con due modifiche.
    1. Utilizzare una piastra di Petri da 10 cm per il posizionamento del dispositivo.
    2. Scegli la semina a canale completo o a canale a intervalli in base alle esigenze sperimentali, poiché ogni metodo richiede protocolli di lesione assonale diversi.
    3. Al termine della semina, aggiungere 5 ml di terreno di coltura neuronale completo alla piastra di Petri da 10 cm per mantenere la crescita dei neuroni.
    4. Aggiungere 20 ml di acqua ultrapura in un piatto grande 150 mm per creare una camera di umidità. Quindi, posizionare il piatto da 10 cm all'interno del piatto grande.
    5. Uguale al passaggio 7.1.14.

8. Definizione di un modello di lesione assonale in vitro in dispositivi microfluidici convenzionali

  1. Contrassegnare il lato sinistro del dispositivo microfluidico come compartimento somale (come indicato dal segno "·") e il lato destro come compartimento terminale assonale.
  2. Semina i neuroni corticali nel compartimento somale.
  3. Coltivare i neuroni in vitro fino al giorno 7 (DIV7), consentendo agli assoni di estendersi attraverso i microcanali fino al compartimento terminale assonale.
  4. Al DIV7, eseguire procedure di lesione assonale nel compartimento terminale assonale per stabilire un modello di lesione assonale in vitro .
  5. Prelevare una quantità appropriata di terreno NBA e trasferirla in una nuova provetta da centrifuga da 15 ml per un uso successivo.
  6. Coltura di neuroni corticali nel dispositivo microfluidico per il periodo specificato. Quindi trasferire il dispositivo su un banco pulito.
  7. Utilizzare carta priva di lanugine per asciugare il fondo della piastra di coltura da 35 mm. Utilizzare una pipetta da 200 μl per aspirare il fluido dai due fori sul lato destro del dispositivo microfluidico.
  8. Collegare il tubo della pompa del vuoto a un puntale per pipetta sterile da 200 μL senza filtro, accendere la pompa del vuoto (velocità di aspirazione 60 L/min) e puntare il puntale verso il punto di connessione tra il foro inferiore della camera terminale dell'assone e la camera per aspirare il vecchio mezzo (a questo punto, gli assoni si rompono a causa della pressione negativa).
  9. Riposizionare il puntale della pipetta da 200 μl e aspirare 150 μl di NBA, aggiungendolo lentamente attraverso il foro inferiore della camera destra.
    NOTA: Se il flusso del liquido è troppo lento e si formano bolle, espellere rapidamente il liquido dalla punta per riempire rapidamente la camera.
  10. Alternare utilizzando i due fori sul lato destro per l'aggiunta di liquido: dopo ogni aggiunta di NBA, utilizzare immediatamente la pompa del vuoto per aspirare il liquido dall'altro foro per recidere gli assoni. Ripetere questa operazione 4 volte e, dopo l'ultima aspirazione, sostituire con un mezzo neuronale completo fresco.
  11. Aspirare il vecchio terreno dal foro laterale del corpo cellulare e aggiungere un nuovo mezzo neuronale completo contenente farmaci (se necessario).
  12. Posizionare il dispositivo microfluidico insieme alla piastra di coltura in una piastra di coltura da 150 mm e continuare la coltura per il tempo specificato (ad es. 24 ore).
    NOTA: L'operazione di danno all'assone richiede un mezzo NBA, poiché il mezzo completo neuronale produrrà bolle che influenzano l'effetto di recisione.

9. Lesione assonale del dispositivo microfluidico su larga scala

  1. Metodo 1: lesione assonale manuale.
    1. Seminare i neuroni in tutte le camere del dispositivo microfluidico.
    2. Incubare il dispositivo a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO2 per tre giorni, quindi rimuovere l'intero dispositivo microfluidico.
      NOTA: Per evitare sollecitazioni meccaniche o lacerazioni degli assoni cresciuti nei microcanali, rimuovere il dispositivo microfluidico in corrispondenza di DIV3 anziché DIV7. Ciò è particolarmente importante se il disegno sperimentale include un gruppo di controllo non danneggiato.
    3. Al DIV7, rimuovere il piatto di coltura contenente il dispositivo microfluidico dall'incubatore e posizionarlo su un tavolino sterile.
    4. Preparare un microscopio con ingrandimento 20x e sterilizzare l'area di lavoro con etanolo al 75%.
    5. Tenere in mano un puntale per pipetta filtrato sterile da 10 μl e identificare i fasci di assoni nei microcanali originali sotto la guida del microscopio.
    6. Eseguire graffi longitudinali lungo ciascun fascio di assoni utilizzando la punta della pipetta.
    7. Osservare la rottura dell'assone al microscopio in tempo reale dopo il graffio.
      NOTA: Quando si maneggiano neuroni vivi, indossare guanti in nitrile e lavorare in un ambiente di laboratorio sterilizzato con raggi UV
  2. Metodo 2: lesione assonale assistita da vuoto.
    1. Seminare i neuroni corticali alternativamente nel dispositivo microfluidico di grande formato.
    2. Accendere la pompa del vuoto e impostarla a 60 L/min.
    3. Collegare l'estremità del tubo della pompa del vuoto alla porta della camera dell'assone utilizzando un puntale per pipetta sterile.
    4. Separare completamente gli assoni applicando la pressione del vuoto attraverso protocolli microfluidici convenzionali.
    5. (Facoltativo) Per raccogliere in modo specifico gli assoni danneggiati, in un momento definito dopo l'assotomia, aspirare rapidamente il contenuto del compartimento del corpo cellulare utilizzando una pompa a vuoto (con una velocità di aspirazione di 60 L/min) per rimuovere i corpi cellulari, lasciando così solo gli assoni all'interno dei microcanali.

10. Trattamento ipossico di dispositivi microfluidici convenzionali o su larga scala

  1. Seminare i neuroni primari nel dispositivo microfluidico e coltivare fino a DIV7 in condizioni normossiche (37 °C, 5% CO2).
  2. Posizionare il dispositivo microfluidico in una camera di incubazione per ipossia e alimentarlo con una miscela di gas composta da 1% O2, 5% CO2 e N2 bilanciato.
  3. Utilizzare un rotametro per controllare la portata del gas e impostarla su 25 L/min.
  4. Sciacquare la camera per 5 minuti per spostare l'aria.
  5. Durante il serraggio dell'ingresso della camera ipossica, chiudere la valvola di riduzione della pressione in uscita.
  6. Clamp il tubo di uscita della camera ipossica e, infine, chiudere bene la valvola della bombola del gas.
  7. Incubare il dispositivo microfluidico nella camera ipossica a 3 °C per 1 ora.

11. Preparazione di campioni di neuroni coltivati in vitro utilizzando dispositivi microfluidici su larga scala per analisi omiche

  1. Campione per trascrittomica.
    1. Trasferire il dispositivo microfluidico con gli assoni danneggiati in una cappa a flusso laminare 6 ore dopo il completamento della lesione assonale.
    2. Dopo aver scartato il vecchio terreno, lavare le cellule neuronali 2-3 volte con PBS sterile.
    3. Utilizzare un kit standard per l'estrazione dell'RNA per isolare e purificare l'RNA secondo le istruzioni del produttore.
    4. Eseguire il sequenziamento dell'RNA. Condurre analisi bioinformatiche di follow-up sui dati di sequenziamento acquisiti.
  2. Campione per l'analisi del flusso metabolico.
    NOTA: Per monitorare i cambiamenti nel flusso metabolico del glucosio nei neuroni dopo una lesione utilizzando un dispositivo microfluidico su larga scala, abbiamo impiegato l'analisi del flusso metabolico di tracciamento del glucosio [U-13C6]24. Il protocollo per la preparazione dei campioni per l'analisi LC-MS è il seguente:
    1. Usa i cuccioli di ratto P0 SD per gli esperimenti. Sezionare i neuroni corticali e coltivarli in vitro a breve termine (DIV5-DIV7) o a lungo termine (DIV15-DIV30).
    2. Sia per i neuroni giovani (DIV5-DIV7) che per quelli maturi (DIV15-DIV30), stabilire gruppi di lesione e gruppi di controllo illesi.
    3. Sostituire il terreno con uno contenente 25 mM [U-13C6]-glucosio (Neurobasal-A senza glucosio, 1% FBS, 2% B27, 25 mM [U-13C6]-glucosio) e incubare per 4 ore a 37 °C.
      NOTA: Per evitare lo stress neuronale e l'apoptosi causati da variazioni osmotiche o di pH durante lo scambio del terreno, preparare ulteriori neuroni coltivati in terreno contenente 25 mM [U-13C6]-glucosio al momento della semina e utilizzare questo terreno per lo scambio.
    4. Dopo aver risciacquato delicatamente due volte con 5 mL di HBSS preriscaldato (contenente calcio e magnesio), congelare i campioni in azoto liquido e conservarli a -80 °C.
      NOTA: Indossare guanti in nitrile e un camice da laboratorio quando si maneggia l'azoto liquido.

12. Colorazione in immunofluorescenza neuronale basata su dispositivi microfluidici convenzionali e su larga scala

NOTA: Quando si coltivano neuroni in vitro utilizzando dispositivi microfluidici, è necessario considerare il potenziale danno agli assoni neuronali all'interno dei microcanali che può verificarsi durante lo smontaggio di questi dispositivi per la fissazione di cellule vive.

  1. Utilizzare una pompa per vuoto per microrifiuti per rimuovere il terreno di coltura dai quattro pozzetti del dispositivo microfluidico.
    NOTA: Conservare il liquido in due camere durante il processo di colorazione in immunofluorescenza. I parametri di aspirazione non devono essere troppo alti (2,5 L/min è ottimale) per evitare di danneggiare o aspirare i corpi cellulari neuronali e gli assoni.
  2. Aggiungere 100 μl di 1x PBS a ciascuno dei due pozzetti superiori del dispositivo microfluidico (il PBS fluirà naturalmente verso i pozzetti inferiori).
  3. Sostituire l'ugello senza filtro all'estremità della pompa del vuoto, aspirare il PBS dai pozzetti inferiori e ripetere il processo tre volte. Nell'iterazione finale, aspirare tutto il PBS dai quattro pozzi.
  4. Aggiungere 150 μl di soluzione di paraformaldeide (PFA) al 4% in ciascuno dei due pozzetti superiori e fissare a temperatura ambiente per 10-15 minuti.
    NOTA: Evitare lo smontaggio del dispositivo durante la fissazione di cellule vive per mantenere l'integrità strutturale neuronale. Questo approccio aiuta a distinguere più chiaramente le posizioni dei somi neuronali e degli assoni.
  5. Lavare tre volte con 1x PBS, quindi incubare i neuroni con un tampone bloccante contenente il 5% di siero di capra, 0,3 M di glicina, il 2% di albumina sierica bovina (BSA), PBS e lo 0,1% (o 0,5%) di Triton X-100 per 1 ora.
  6. Diluire l'anticorpo primario (ad es. βIII-tubulina, topo, 1:2000) nel tampone bloccante, aggiungere 100 μL nel pozzetto in alto a sinistra e 50 μL nel pozzetto in alto a destra e incubare con i neuroni per una notte a 4 °C.
  7. Dopo aver aspirato l'anticorpo primario, lavare tre volte con 1x PBS come descritto nei passaggi 12.2-12.3. Quindi aggiungere l'anticorpo secondario preparato con tampone bloccante nei pozzetti superiori del dispositivo microfluidico come descritto al punto 12.6 e incubare al buio per 30 minuti (coprire con un foglio di alluminio se necessario).
  8. Dopo aver lavato tre volte con 1x PBS, risciacquare una volta con acqua ultrapura. Utilizzare con cautela una pinzetta curva per afferrare e rimuovere il dispositivo dalla parte superiore destra della configurazione microfluidica.
  9. Aggiungere 1 mL di PBS alla piastra di coltura per separare il vetrino coprioggetto grande dalla piastra.
  10. Utilizzare una pipetta per aspirare 15 μl di terreno di montaggio e lasciarlo cadere sul vetrino coprioggetti nella posizione designata per i vetrini.
  11. Abbassare delicatamente il lato della cella sul mezzo di montaggio, posizionare il vetrino coprioggetti e rimuovere il liquido in eccesso.
  12. Lasciare asciugare completamente il mezzo di montaggio a temperatura ambiente.
  13. Una volta che il mezzo di montaggio si è asciugato a temperatura ambiente, utilizzare un microscopio confocale a disco rotante per eseguire l'imaging.
  14. Selezionare un obiettivo pneumatico 20x, impostare il tempo di esposizione su 100-200 ms per fotogramma e impostare la potenza del laser su 5-10% del massimo con un'eccitazione di 488 nm per la proteina fluorescente verde (GFP) e/o 561 nm per la proteina fluorescente rossa (RFP).

13. Imaging di cellule vive in dispositivi microfluidici convenzionali

  1. Coltura di neuroni corticali nel dispositivo microfluidico fino a DIV7.
  2. Preparare il colorante per cellule vive (ad esempio, una sonda per il potenziale di membrana mitocondriale) secondo le istruzioni del produttore.
  3. Diluire il colorante in un mezzo di mantenimento neuronale preriscaldato (37 °C).
  4. Caricare la soluzione colorante nel compartimento somatico del dispositivo microfluidico.
  5. Incubare per 30 minuti in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 .
  6. Lavare delicatamente gli scomparti 3 volte con 3 ml di HBSS preriscaldato (37 °C) contenente calcio e magnesio.
  7. Aggiungere una soluzione di imaging di cellule vive priva di rosso fenolo al chip microfluidico.
  8. (Facoltativo) Includere GlutaMAX (0,25%) e B27 (2%) per l'imaging prolungato.
  9. Posizionare il chip microfluidico sul tavolino del microscopio con la camera somatica a sinistra e la camera terminale assonale a destra.
  10. Aggiungere una goccia di olio da immersione alla lente dell'obiettivo, assicurandosi che l'olio entri in contatto con il vetrino coprioggetti sotto il chip.
  11. Utilizza un obiettivo 40x con un'esposizione di 150 ms e una potenza laser massima del 10-15% per l'imaging.
    NOTA: Regolare questi parametri in base alla fotostabilità del colorante.

14. Analisi dei dati

  1. Utilizzare il software ImageJ per analizzare le immagini al microscopio. Valuta la qualità dell'RNA con un bioanalizzatore. Esecuzione e analisi dell'RNA-seq utilizzando una piattaforma appopriata.
  2. Per gli studi metabolomici, estrarre i dati grezzi della spettrometria di massa utilizzando il programma MRMPROBS (versione 2.60) e raccogliere informazioni sui metaboliti identificati, inclusi i dettagli isotopici e le aree di picco.
  3. Utilizza GraphPad Prism (versione 8.4.3) per tutte le analisi statistiche. Utilizzare i test t a due code non accoppiati o i test di Mann-Whitney per i confronti di gruppo e applicare l±'ANOVA a due vie per i confronti tra più punti temporali all'interno dei gruppi (Significatività: ns, non significativa; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001).

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Risultati

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Per stabilire una piattaforma di ricerca completa per lo studio dei meccanismi di regolazione metabolica nei neuroni corticali, abbiamo prima coltivato i neuroni corticali in un dispositivo microfluidico convenzionale, controllando con precisione la crescita degli assoni lungo i microcanali (Figura 2A). Con un design appropriato, i microcanali sono stati costruiti con un'altezza ridotta (5 μm) e una larghezza maggiore (10 μm), consentendo a ciascun canale di ...

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Discussione

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La creazione di modelli avanzati in vitro per lo studio del danno assonale e della rigenerazione è essenziale per scoprire i meccanismi molecolari e metabolici coinvolti nella riparazione neuronale16,19. In questo studio, presentiamo un flusso di lavoro standardizzato che integra dispositivi microfluidici, colture neuronali su larga scala e protocolli precisi di lesioni assonali, consentendo una robusta analisi multi-omi...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Beijing Natural Science Foundation (sovvenzioni n. L222080, F251031, Z240011, 7192103) e dalla National Natural Science Foundation of China (sovvenzioni n. 82271513)

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Neurobasal-A MediumGibco10888022Terreno di coltura
Alexa Fluor 488 capra anti-mouseInvitrogenA-21042Immunofluorescenza
Bilancia analiticaShanghai Shunyu Hengping Scientific Instrument Co., Ltd.FA1004Pesatura precisa di reagenti/campioni
B27 (50x)Gibco17504044Terreno di coltura
Dosaggio delle proteine BCABosterAR1189Concentrazioni proteiche
BioanalizzatoreAgilenthttps://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument
Albumina sierica bovinaGenviewFA016Immunofluorescenza
Agitatore centrifugoPENSAREARE-310Mix PDMS e degassificazione
Analizzatore CLARIOstarPlus-ACUBMG LABTECHCLARIOstar PlusConcentrazioni proteiche
Incubatore CO2Thermo Fisher Scientific (Asheville) LLC3111Incubazione di colture cellulari a 37 gradi C, 5% CO?
Pompa per vuoto a membrana resistente alla corrosioneShanghai Lichen Bangxi Instrument Technology Co., Ltd.LC-85DLCAspirare il liquido di scarto e fornire l'aspirazione per l'assotomia
D-GLUCOSIO (U-13C6, 99%)Laboratori isotopici di CambridgeCLM-1396Flusso metabolico
DNasi IRoche11284932001Coltura neuronale
Piattaforma Dr.TOM2BGI GenomicaEseguire e analizzare RNA-seq 
Forno elettrico di essiccazione ad aria caldaBIOM Huahong Bonn / Huaying BosiDHG-9070APDMS di polimerizzazione
Bilancia elettronicaShanghai Huachao Industrial Co., Ltd.HC313Pesatura ordinaria dei materiali
Mezzo di montaggio acquoso FluoromountSigma-AldrichF4680Immunofluorescenza
GlutaMAXGibco35050061Terreno di coltura
GlicinaDistretto di SolarbioG8200Immunofluorescenza
S.b.B.Gibco14025092Coltura neuronale
HBSS, senza calcio, senza magnesioGibco14175095Coltura neuronale
Sterilizzatore a vapore ad alta pressioneSTIK Instrument (Shanghai) Co., Ltd.HMJ-54ASterilizzazione di apparecchiature e terreni di laboratorio
Camera ipossicaTecnologie STEMCELL27310Trattamento ipossico
ImmagineJNIHUtilizzato per analizzare le immagini al microscopio
Microscopio LeicaLeica Microsystems CMS GmbHDMIL LED FluoOsservazione dal vivo e a fluorescenza
Soluzione per l'imaging di cellule viveInvitrogenA14291DJImaging di cellule vive
Scatola di stoccaggio medica a bassa temperatura (-80 ° C)Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd.DW-86L388JConservazione a lungo termine del campione a -80 ° C
Mini pompa per vuoto da tavoloHaimen Qilin-Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.GL-805Applicazioni del vuoto su piccola scala
MitoTracker Arancione CMTMRosInvitrogenMotore M7510Colorazione del potenziale di membrana mitocondriale
Programma MRMPROBSVersione 2.60Per estrarre i dati grezzi della spettrometria di massa 
Terreno neurobasaleGibco21103049Terreno di coltura
Neurobasal-A senza glucosioGibcoA2477501Terreno di coltura
PapainaWorthingtonLS003127Coltura neuronale
ParaformaldeideSigma-AldrichP6148Fissazione cellulare
Sensori di sicurezzaDow CorningDC184Fabbricazione di dispositivi
Kit PDS Fiala inibitoreWorthingtonLK003182Coltura neuronale
Penicillina StreptomicinaGibco15140122Terreno di coltura
Soluzione salina tamponata con fosfatoBiosharpBL302ADiluire le sostanze e pulire i contenitori delle celle
Pulitore al plasmaHarrick PlasmaODC-32G-2Attivazione
Poli-D-lisinaSigma-AldrichP6407Coltura neuronale
Prisma GraphPadVersione 8.4.3Analisi statistiche
Centrifuga refrigerataEppendorf AG (Germania)5430RSeparazione dei campioni a temperature controllate
RNArep Kit per l'estrazione di RNA totale batterico e cellulare puroTiangenDP430Trascrittomica
RotametroDwyerRMA-23-SSVControlla il basso flusso di ossigeno
StereomicroscopioSocietà OlimpoSZ2-ILSTOsservazione e dissezione del campione
Agitatore orbitale StuartKylin-CampanaTS-200Miscelazione di colture/soluzioni cellulari a velocità regolabili
Triton X-100Sigma-AldrichX100Immunofluorescenza
Pompa per vuoto rotativa a palette ULVACULVAC (Ningbo) Co., Ltd.GLD-N202Creazione del vuoto per la filtrazione/essiccazione
β III-tubulinaPromegaG7121Immunofluorescenza

Riferimenti

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