Articolo metodologico

Valutazione degli interventi terapeutici nel modello murino carente di SHIP di ileite e fibrosi simile alla malattia di Crohn

DOI:

10.3791/68928

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14 ottobre 2025

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1Department of Pediatrics, Division of Gastroenterology, University of British Columbia and BC Children's Hospital Research Institute

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo dimostra come il modello murino di infiammazione ileale e fibrosi simile alla malattia di Crohn (CD) contenente il dominio Src 2 contenente 5'-inositolo fosfatasi (SHIP) possa essere utilizzato per testare nuove terapie per la MC.

Abstract

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La malattia di Crohn (CD) è una condizione infiammatoria cronica e recidivante, caratterizzata da un'infiammazione segmentale transmurale che può interessare qualsiasi parte del tratto gastrointestinale. Un segno distintivo della MC è la compromissione della funzione della barriera intestinale e la fibrosi intestinale è una complicanza comune. I topi carenti di SHIP (SHIP-/-) sviluppano spontaneamente disfunzione della barriera intestinale, infiammazione ileale e patologia fibrotica, ricapitolando le caratteristiche chiave dell'ileite simile alla CD. I topi SHIP-/- fungono da modello prezioso per testare terapie antinfiammatorie e antifibrotiche nella MC.

Qui, descriviamo i metodi per valutare gli interventi terapeutici in questo modello, utilizzando il desametasone come esempio di terapia efficace. Forniamo un protocollo passo-passo per la caratterizzazione della malattia e la risposta al trattamento, compresa la valutazione in vivo della permeabilità intestinale misurata mediante FITC-destrano, nonché l'esame patologico macroscopico e le analisi istologiche dettagliate. Le valutazioni istologiche includono la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) per l'infiammazione, la colorazione tricromica di Masson per la fibrosi e la colorazione con blu di Alcian/Periodico acido-Schiff (PAS) per l'iperplasia e l'ipertrofia delle cellule caliciformi. Inoltre, le citochine e i marcatori infiammatori nel tessuto ileale vengono quantificati per valutare lo stato infiammatorio. Insieme, questi metodi forniscono un quadro completo per valutare l'efficacia del trattamento nel modello murino SHIP-/- di ileite simile alla CD. Questo protocollo è ampiamente applicabile ai ricercatori che studiano l'infiammazione intestinale, la guarigione delle mucose e la fibrosi intestinale.

Introduzione

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I due principali tipi di malattia infiammatoria intestinale (IBD) sono la malattia di Crohn (CD) e la colite ulcerosa (UC), entrambe caratterizzate da infiammazione gastrointestinale cronica (GI) che può seguire un decorso recidivante-remittente o progressivo1. Sebbene l'IBD sia stata storicamente considerata una malattia delle nazioni occidentalizzate, la sua incidenza sta aumentando rapidamente nei paesi in via di sviluppo in Sud America, Asiae Africa. Allo stesso tempo, la prevalenza continua ad aumentare in Nord America, Europa e Australia, con un aumento di quasi il 50% sia dell'incidenza che della prevalenza segnalato tra il 1990 e il 2019, sottolineando il crescente carico sanitario globale dell'IBD 2,3. Nonostante i significativi sforzi di ricerca, la causa alla base dell'IBD rimane sconosciuta. Le prove attuali suggeriscono una complessa interazione tra suscettibilità genetica, disfunzione del sistema immunitario e fattori scatenanti ambientali, comprese le alterazioni del microbioma 4,5.

Ci sono differenze fondamentali tra CD e UC. Nella CU, l'infiammazione è confinata al colon ed è caratterizzata da un coinvolgimento continuo che è limitato allo strato mucoso 6,7. Al contrario, la MC è caratterizzata da un'infiammazione discontinua e transmurale che può interessare qualsiasi parte del tratto gastrointestinale, più comunemente nell'ileo terminale 6,7. Una complicanza distintiva della MC è la fibrosi intestinale, che contribuisce alla formazione di stenosi e ostruzione intestinale8. La fibrosi è definita da un'eccessiva deposizione di componenti della matrice extracellulare, come il collagene, e dall'ispessimento degli strati muscolari intestinali 9,10. Circa il 30% delle persone affette da MC sviluppa una malattia restringente entro 10 anni dalladiagnosi11. Attualmente, nessuna terapia ha come bersaglio diretto la fibrosi, un'esigenza clinica insoddisfatta che può essere affrontata utilizzando modelli preclinici adeguati per studiare questa complicanza 9,12.

Per comprendere meglio la patogenesi dell'IBD e facilitare lo sviluppo di nuove terapie, sono stati stabiliti numerosi modelli murini12. Sebbene esista un gran numero di modelli di colite, solo pochi ricapitolano l'infiammazione ileale e la fibrosi associata alla MC12. Tra questi ci sono il dominio di omologia Src 2 contenente 5'-inositolo fosfatasi deficiente (SHIP-/-) qui descritto, così come i topi SAMP1/YitFc e i topi TnfΔARE. Questi modelli riflettono collettivamente la complessità della CD umana poiché ciascuno è guidato da meccanismi cellulari e molecolari distinti. La malattia nei topi SAMP1/YitFc deriva da una predisposizione poligenica che influenza la funzione della barriera epiteliale e la regolazione immunitaria13,14, mentre i topi TnfΔARE portano una delezione di elementi ricchi di AU nell'mRNA del TNF, portando ad un aumento della stabilità dell'mRNA e alla sovrapproduzione di TNF15,16. Sebbene preziosi, questi modelli hanno dei limiti. Il modello SAMP1/YitFc soffre di una bassa efficienza riproduttiva, che pone sfide nel generare coorti di dimensioni sufficienti per gli studi17. Inoltre, il modello TnfΔARE richiede fino a 24 settimane per sviluppare una notevole patologia fibrotica, il che rende costoso e impegnativo condurre studi di intervento16.

SHIP è un regolatore negativo della via di segnalazione della fosfatidilinositolo-3-chinasi (PI3K) ed è espresso prevalentemente nelle cellule ematopoietiche. Funziona rimuovendo il gruppo fosfato 5' dal fosfatidilinositolo 3,4,5-trisfosfato, attenuando così la segnalazione PI3K a valle18. I topi SHIP-/- offrono diversi vantaggi per gli studi preclinici. Questi topi sono relativamente facili da allevare e mostrano segni di fibrosi già a 8 settimane di età19. Il rimodellamento fibrotico accelerato in questo modello è probabilmente guidato da risposte infiammatorie aumentate dovute a un percorso PI3K disregolato, che porta all'iperattivazione delle cellule immunitarie e al successivo rapido rimodellamento dei tessuti. Ancora più importante, noi e il gruppo di Kerr abbiamo dimostrato in modo indipendente che i topi SHIP-/- sviluppano l'ileite con caratteristiche che assomigliano molto alla CD19,20 umana. A sostegno della rilevanza di questo modello, un sottogruppo di individui con MC ha una ridotta attività SHIP sia nelle biopsie ileali che nelle PBMC21. Inoltre, quelli con bassa attività SHIP tendono a sperimentare un decorso più grave della malattia, che spesso richiede più interventi chirurgici22.

I topi SHIP-/- iniziano a sviluppare un'infiammazione intestinale spontanea e discontinua localizzata nell'ileo distale già a 4 settimane di età, con infiammazione presente in tutti i topi entro le 6 settimane di età20. Entro le 8 settimane di età, i topi hanno stabilito una patologia fibrotica, caratterizzata da ispessimento della muscularis externa e da un esteso accumulo di collagene nella sottomucosa e tra gli strati muscolari19. L'infiammazione in questo modello è guidata dall'interleuchina-1β (IL-1β)21 derivata dai macrofagi. Sia la deplezione dei macrofagi con liposomi contenenti clodronato che il blocco farmacologico della segnalazione di IL-1 con un antagonista del recettore IL-1 (anakinra) hanno migliorato l'infiammazione intestinale nei topi SHIP-/-21. Oltre all'ileite, i topi SHIP-/- presentano infiammazione polmonare, che abbiamo utilizzato per valutare gli effetti off-target delle terapie progettate per il parto intestinale localizzato23. Altri hanno riportato che l'inibizione della caspasi-8 con Z-IETD-FMK riduce significativamente l'infiammazione ileale e polmonare nei topi SHIP-/-24, supportando ulteriormente la patologia polmonare come caratteristica aggiuntiva per valutare il controllo infiammatorio sistemico.

Questo articolo metodologico rivisita il nostro lavoro pubblicato di recente sul trattamento di successo con desametasone23 e fornisce una descrizione dettagliata delle procedure tecniche chiave, con ulteriori considerazioni per l'utilizzo di modelli murini nei test farmacologici. In particolare, evidenziamo i parametri standard per la valutazione dell'efficacia dei farmaci nei modelli di IBD, tra cui la valutazione della permeabilità intestinale, della patologia macroscopica, dell'istopatologia e dei mediatori ed effettori pro-infiammatori, e discutiamo su come integrare questi dati per trarre conclusioni sull'efficacia terapeutica complessiva.

Protocollo

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Gli studi che coinvolgono gli animali devono essere condotti in conformità con i protocolli etici approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali e in conformità con le Linee Guida sulla Cura degli Animali del Consiglio Nazionale delle Ricerche. Tutte le procedure per gli animali in questo protocollo hanno seguito le linee guida etiche del Canadian Council on Animal Care e sono state approvate dal Comitato per la cura degli animali dell'Università della British Columbia (protocollo A21-0212).

NOTA: Per valutare l'impatto terapeutico del farmaco sulla patologia intestinale dei topi SHIP-/-, includere SHIP+/+ come controlli sani per il confronto. Per l'intervento terapeutico, iniziare il trattamento a 6 settimane di età, quando la malattia è completamente stabilita nel modello. Qui, sia i topi SHIP+/+ che SHIP-/- hanno ricevuto una sonda orale giornaliera di desametasone a 3 mg/kg in β-ciclodestrina allo 0,5% (veicolo) o il veicolo da solo per 2 settimane, in un volume di 10 μL/g.

1. Dosaggio FITC-destrano per misurare la permeabilità della barriera epiteliale

  1. Topi veloci per 4 ore prima del test.
  2. Sciogliere 4 kDa di FITC-destrano in 1x PBS sterile a una concentrazione finale di 80 mg/mL.
  3. Preparare una quantità sufficiente per 150 μl per topo, più 50 μl in più per la curva standard.
    NOTA: Ridurre al minimo l'esposizione alla luce della soluzione di FITC-destrano e dei campioni di plasma durante la procedura.
  4. Trattenere delicatamente (collottola) ciascun topo e somministrare 150 μL della soluzione di FITC-destrano tramite sonda gastrica orale.
    NOTA: Avviare un timer subito dopo aver somministrato il primo gavage. Attendere 10-15 minuti tra un topo e l'altro per consentire un tempo sufficiente per l'eutanasia e le procedure a valle da eseguire in modo scaglionato, riducendo al minimo la variabilità dovuta alle differenze di tempo.
  5. Mantenere i topi senza cibo per 4 ore.
  6. Eutanasia dei topi utilizzando isoflurano al 5% (anestetico inalante somministrato con 1,5 L di ossigeno/min) seguito da anidride carbonica secondo la procedura istituzionale standard. Raccogliere il sangue tramite puntura cardiaca con aghi da 25 G e siringhe da 1 mL.
  7. Aggiungere immediatamente 10 μL di soluzione acido-citrato-destrosio a ogni 100 μL di sangue raccolto come anticoagulante. Mescolare accuratamente per inversione.
  8. Centrifugare a 1500 x g per 10 minuti a 4 °C e trasferire con cura il plasma (surnatante) in provette per microcentrifuga da 1,7 mL etichettate. Conservare i campioni su ghiaccio e al riparo dalla luce fino all'analisi.
  9. Diluire ogni campione di plasma 1:2 e 1:10 con 1x PBS.
  10. Aggiungere 100 μl di ciascuna diluizione a una piastra opaca a 96 pozzetti in duplicati.
  11. Eseguire diluizioni seriali 1:2 del fondo originale di 80 mg/mL di FITC-destrano utilizzando 1x PBS per ottenere le seguenti concentrazioni: 3000, 1500, 750, 375, 187,5, 93,8, 46,9, 23,4 e 0 ng/mL. Aggiungere 100 μl di ciascuna concentrazione alla piastra a 96 pozzetti in duplicato.
  12. Misura la fluorescenza a 485 nm di eccitazione e 535 nm di emissione utilizzando un lettore di micropiastre.

2. Valutazione macropatologica

  1. Dopo il prelievo di sangue per il test FITC-destrano, asportare accuratamente l'intero intestino tenue.
  2. Rimuovere delicatamente il grasso attaccato e il tessuto connettivo.
    NOTA: Prestare attenzione quando si maneggia il tessuto, poiché le regioni malate possono essere fragili e soggette a lacerazioni.
  3. Appoggiare l'intestino su un foglio di carta bianca bianca per un contrasto ottimale. Ispezionare visivamente il tessuto per segni macroscopici di malattia. L'infiammazione è tipicamente localizzata nei 10 cm distali dell'intestino tenue nel topo SHIP-/-.
    NOTA: Le caratteristiche macroscopiche chiave da valutare includono cambiamenti di colore, con regioni che mostrano arrossamento visibile o iperemia rispetto al tessuto adiacente di aspetto normale. Inoltre, esaminare l'ispessimento dei tessuti, poiché le aree interessate possono apparire gonfie, edematose o rigide dopo una delicata palpazione. Cerca la presenza di sangue, che può apparire come macchie emorragiche visibili, scolorimento rosso scuro o sangue aderente.
  4. Allinea l'intestino accanto a un righello per la scala e scatta una foto per documentare i grossolani risultati patologici.

3. Valutazione istologica

  1. Rimuovere il contenuto intestinale lavando delicatamente il lume con 1x PBS utilizzando una siringa. Non applicare troppa forza al tessuto, poiché ciò potrebbe distorcere l'architettura dei villi e della cripta.
  2. Identificare e prelevare circa 1 cm dell'ileo distale che è più rappresentativo della patologia macroscopica. Includi le regioni interessate visibili, se presenti. Per i confronti (SHIP+/+ vs. SHIP-/-), assicurarsi che i tessuti vengano raccolti da posizioni anatomiche corrispondenti.
    NOTA: Per una valutazione iniziale dell'efficacia del trattamento, si raccomanda di preparare l'ileo come un rotolo svizzero. Questo metodo fornisce una visualizzazione globale della malattia e riduce la distorsione del campionamento.
  3. Stendere il tessuto in una cassetta istologica, posizionandolo tra le spugne per evitare che si pieghi.
  4. Per l'ematossilina e l'eosina (H&E) e la colorazione tricromica di Masson, fissare il tessuto in formalina tamponata neutra al 10% durante la notte a 4 °C, utilizzando almeno 10-20 volte il volume del tessuto (circa 5 ml per cassetta) e assicurandosi che tutte le cassette siano completamente sommerse. Trasferire le cassette al 70% di etanolo per la conservazione, mantenendole completamente immerse fino alla lavorazione.
    NOTA: La formalina al 10%, un fissativo contenente il 3,7% di formaldeide, è un potente irritante respiratorio, un sensibilizzante cutaneo ed è classificato come cancerogeno per l'uomo. L'inalazione, l'ingestione o il contatto con la pelle possono provocare tossicità acuta, mentre l'esposizione cronica può aumentare il rischio di cancro. Tutte le procedure che coinvolgono la formalina devono essere eseguite in una cappa chimica certificata, indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI), tra cui camice da laboratorio, guanti resistenti agli agenti chimici e protezione per gli occhi. Raccogliere i rifiuti in contenitori chiaramente etichettati come "Rifiuti di formalina" per un corretto smaltimento secondo i protocolli istituzionali sui rifiuti pericolosi. Tutti i materiali contaminati da formalina (ad es. puntali per pipette, fazzoletti, guanti) devono essere trattati come rifiuti chimicamente pericolosi e smaltiti seguendo le procedure locali per la salute e la sicurezza ambientale (EHS).
  5. Per la colorazione con blu di Alcian/PAS, fissare il tessuto nella soluzione di Carnoy (60% etanolo, 30% cloroformio e 10% acido acetico glaciale) a 4 °C durante la notte, utilizzando circa 5 ml per cassetta o 10-20 volte il volume del tessuto. Trasferire le cassette in etanolo al 100% per la conservazione fino alla lavorazione.
    NOTA: La soluzione di Carnoy è composta per il 60% da etanolo, per il 30% da cloroformio e per il 10% da acido acetico glaciale. Questa miscela è altamente volatile, infiammabile e tossica. Maneggiare la soluzione di Carnoy esclusivamente in una cappa aspirante e conservarla in contenitori ermeticamente sigillati, lontano da fonti di calore o di accensione. I rifiuti di Carnoy devono essere raccolti in contenitori designati per solventi organici misti e smaltiti in conformità con le linee guida istituzionali sui rifiuti pericolosi. Tutti i materiali contaminati con la soluzione di Carnoy devono essere trattati come rifiuti chimicamente pericolosi.
  6. Incorporare i tessuti in paraffina e tagliare sezioni da 5 μm per la colorazione.
  7. Valutare le sezioni ileali colorate con H&E su una scala a 16 punti secondo i criteri della Tabella 1. Il punteggio finale del danno istologico è determinato facendo la media dei punteggi di 2 revisori, che sono all'oscuro della condizione sperimentale.
  8. Valutare le sezioni trasversali macchiate di tricromo di Masson utilizzando una scala a 6 punti basata sui criteri della Tabella 2. Il punteggio finale della fibrosi è calcolato come la mediana dei punteggi assegnati da due revisori indipendenti all'oscuro delle condizioni sperimentali.

4. Valutazione delle citochine

  1. Dopo la dissezione e la rimozione del campione istologico, raccogliere la porzione rimanente dei 10 cm distali dell'ileo.
  2. Asciugare il tessuto e registrare il peso. Congelare in azoto liquido e conservare a -80 °C per una futura lavorazione.
  3. Quando è pronto per la lavorazione, recuperare il fazzoletto e tenerlo sempre in ghiaccio.
  4. Pesare i campioni di tessuto. Preparare un tampone di omogeneizzazione sufficiente per tutti i campioni aggiungendo inibitori della proteasi a 1x PBS (aprotinina e leupeptina, ciascuna a 10 μg/mL). Utilizzare 10 μL di tampone per mg di tessuto (ad esempio, 100 mg di tessuto richiedono 1 mL di tampone).
    NOTA: Il tampone di omogeneizzazione deve essere preparato fresco il giorno dell'omogeneizzazione per garantire che gli inibitori della proteasi siano efficaci.
  5. Omogeneizzare il tessuto ileale a tutto spessore in un tampone di omogeneizzazione ghiacciato utilizzando un omogeneizzatore da banco. Assicurarsi che l'omogeneizzato sia uniforme e privo di frammenti di tessuto visibili. Sciacquare accuratamente la punta dell'omogeneizzatore con PBS tra i campioni per evitare la contaminazione incrociata.
  6. Centrifugare l'omogeneizzato di tessuto a 10.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
  7. Aliquotare i surnatanti chiarificati per evitare cicli di gelo-scongelamento e conservarli a -80 °C per analisi future.
  8. Eseguire saggi di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) su surnatanti chiarificati per quantificare le citochine di interesse, secondo le istruzioni dei produttori.
    NOTA: La densità ottica a 450 nm è stata misurata utilizzando il lettore di micropiastre Varioskan LUX con software Skanlt RE 7.0.2, con una lunghezza d'onda di riferimento di 570 nm per la correzione. Per l'analisi dei dati è stato utilizzato Microsoft Excel e i valori di assorbanza all'interno dell'intervallo lineare della curva standard sono stati interpolati per determinare le concentrazioni di citochine.

Risultati

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Topi SHIP+/+ e SHIP-/- di 6 settimane sono stati sottoposti a sonda gastrica orale con β-ciclodestrina allo 0,5% (controllo del veicolo; n = 6/genotipo) o 3 mg/kg di desametasone (n = 6/genotipo) al giorno per 2 settimane. I tempi e la durata del trattamento dipendono dal modello e devono considerare l'insorgenza e il tasso di progressione della malattia, nonché se l'intervento è destinato a essere profilattico o terapeutico. Un numero uguale di topi maschi e femmine dovrebbe essere utilizzato negli esperimenti. Sebbene non abbiamo identificato differenze basate sul sesso nella storia naturale della malattia nei topi SHIP-/-, diversi protocolli di trattamento possono mostrare risposte specifiche per sesso. In questo modello, il trattamento profilattico a partire dalle 4-6 settimane di età può essere utilizzato per prevenire l'insorgenza di infiammazione e fibrosi, mentre i regimi terapeutici eseguiti a partire dalle 6-8, 8-10 o 6-10 settimane di età possono essere utilizzati per valutare l'efficacia del trattamento per la malattia accertata. Il dosaggio e la tempistica ottimali devono essere guidati dalla letteratura e dagli studi di titolazione. Abbiamo precedentemente dimostrato che questo regime posologico per il desametasone è efficace se somministrato dopo che si è sviluppata l'infiammazione ileale.

Una tempistica consigliata per il giorno del raccolto è delineata nella Figura 1A. Il desametasone non ha indotto alcuna patologia intestinale nei topi SHIP+/+ sulla base dell'esame macroscopico. I topi SHIP-/- mostravano aree visibili di arrossamento e ispessimento, indicative di infiammazione. Queste caratteristiche patologiche macroscopiche erano assenti nei topi SHIP-/- trattati con desametasone (Figura 1B). Per valutare la funzione della barriera intestinale, sono state misurate le concentrazioni plasmatiche di FITC-destrano dopo il gavagage orale. Sebbene non statisticamente significativi, i topi SHIP-/- avevano elevate concentrazioni plasmatiche di FITC-destrano rispetto ai controlli SHIP+/+, suggerendo un aumento della permeabilità intestinale. Il trattamento con desametasone ha ridotto le concentrazioni di FITC-destrano nei topi SHIP-/- a concentrazioni simili a quelle osservate nei topi SHIP+/+ (Figura 1C).

L'esame istologico delle sezioni trasversali intestinali di topi SHIP-/- ha rivelato caratteristiche patologiche distintive, tra cui l'infiltrazione di cellule immunitarie, l'interruzione dell'architettura della cripta dei viilli, l'iperplasia/ipertrofia delle cellule caliciformi e l'ispessimento dello strato muscolare (Figura 2A). Queste caratteristiche si sono riflesse in punteggi di danno istologico significativamente più elevati rispetto ai topi SHIP+/+ (p = 0,0005, Figura 2B). Non è stato osservato danno istologico nei topi SHIP+/+ trattati con desametasone. Coerentemente con i miglioramenti osservati nella patologia macroscopica e nella funzione di barriera, il desametasone ha ridotto l'istopatologia nei topi SHIP-/-, sebbene l'effetto non fosse statisticamente significativo (p = 0,0981, Figura 2A e Figura 2B). La colorazione tricromica di Masson ha rivelato una sostanziale deposizione di collagene nei tessuti intestinali SHIP-/-, accompagnata da punteggi di fibrosi significativamente più elevati rispetto ai controlli SHIP+/+ (Figura 2C). Il desametasone ha attenuato efficacemente le caratteristiche fibrotiche nei topi SHIP-/-, abbassando i punteggi della fibrosi a valori paragonabili a quelli dei controlli SHIP+/+ (Figura 2C). Inoltre, la colorazione con blu di Alcian/PAS ha confermato l'iperplasia/ipertrofia delle cellule caliciformi nei topi SHIP-/-, che è stata ridotta dopo il trattamento con desametasone (Figura 2D).

Per valutare le concentrazioni di citochine infiammatorie, gli ELISA sono stati eseguiti su omogeneizzati di tessuto ileale a tutto spessore (Figura 3A). Le concentrazioni di IL-1β erano significativamente più alte nei topi SHIP-/- rispetto ai controlli SHIP+/+ (p = 0,0468), il che si allinea con i risultati precedenti che correlano l'espressione di IL-1β alla gravità della malattia in questo modello. Il trattamento con desametasone ha ridotto significativamente le concentrazioni di IL-1β nei topi SHIP-/- (p = 0,0023). Coerentemente con i rapporti precedenti, le concentrazioni di IL-6 o TNF non differivano tra i quattro gruppi sperimentali. Abbiamo anche misurato le concentrazioni delle proteine associate ai neutrofili mieloperossidasi (MPO) e lipocalina-2 (LCN-2) negli omogenati ileali a tutto spessore come ulteriori marcatori biochimici dell'infiammazione (Figura 3B). Sia le concentrazioni di MPO che di LCN-2 erano significativamente più alte (p = 0,0031 e p = 0,0002 rispettivamente) nei topi SHIP-/- rispetto ai controlli SHIP+/+, sebbene l'aumento di LCN-2 sia stato in gran parte guidato da alte concentrazioni misurate in 2 topi su 6. Il trattamento con desametasone ha ridotto l'MPO e ridotto modestamente l'LCN-2, le differenze non sono state significative. Questi dati suggeriscono che l'MPO è un utile marcatore di infiammazione nei topi SHIP-/-, mentre le concentrazioni di LCN-2 non sono così coerenti o affidabili.

Per studiare la relazione tra caratteristiche infiammatorie e fibrotiche nel modello murino SHIP-/-, abbiamo eseguito analisi di correlazione di Spearman utilizzando punteggi di danno istologico, punteggi di fibrosi e concentrazioni di IL-1β da tessuto ileale a tutto spessore (Figura 4). Le concentrazioni di IL-1β erano correlate positivamente con i punteggi di danno istologico (r = 0,6813), indicando che l'aumento dell'infiammazione era associato a un aumento del danno tissutale (Figura 4A). È stata osservata anche una moderata correlazione tra le concentrazioni di IL-1β e i punteggi di fibrosi (r = 0,4117), suggerendo un legame tra la produzione di citochine infiammatorie e il rimodellamento fibrotico (Figura 4B). Inoltre, i punteggi del danno istologico erano correlati in modo significativo con i punteggi della fibrosi (r = 0,6241), suggerendo che il danno strutturale e la fibrosi progrediscono in parallelo nei topi SHIP-/- (Figura 4C).

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Figura 1: Il desametasone riduce la patologia intestinale macroscopica e la permeabilità nei topi SHIP-/-. I topi SHIP+/+ e SHIP-/- sono stati sottoposti a vaccinazione orale giornaliera con β-ciclodestrina allo 0,5% come veicolo di controllo (VC) o desametasone (Dex; 3 mg/kg) da 6 a 8 settimane di età. (A) Tempistica sperimentale raccomandata. (B) È stata valutata la morfologia macroscopica del cieco e dell'ileo distale e sono mostrate immagini rappresentative (n = 4-6 topi per gruppo). Gli asterischi denotano aree di arrossamento e ispessimento a chiazze osservate all'esame macroscopico. Le immagini sono destinate a servire come esempi rappresentativi della patologia generale e non sono destinate all'analisi quantitativa. (C) Per valutare la permeabilità intestinale, i topi sono stati digiunati per 4 ore e gassati con 80 mg/mL di FITC-destrano. Dopo altre 4 ore di digiuno, il sangue è stato raccolto tramite puntura cardiaca e sono state misurate le concentrazioni plasmatiche di FITC-destrano. I dati sono presentati come media ±SD. La barra grigia rappresenta l'intervallo di concentrazioni plasmatiche di FITC-destrano tipicamente osservate nei topi sani C57BL/6 quattro ore dopo il gavage25. La significatività statistica è stata determinata utilizzando il test di Kruskal-Wallis seguito dal test di confronto multiplo di Dunn. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Il desametasone riduce i punteggi di danno istologico, il collagene, lo spessore muscolare e l'iperplasia e ipertrofia delle cellule caliciformi nell'ileo distale dei topi SHIP-/-. I topi SHIP+/+ e SHIP-/- sono stati sottoposti a vaccinazione orale giornaliera con β-ciclodestrina allo 0,5% come veicolo di controllo (VC) o desametasone (Dex; 3 mg/kg) da 6 a 8 settimane di età. (A) le sezioni d'urto ileali di topi colorate con H&E sono state fotografate con un ingrandimento di 10x; barre della scala = 200 μm. (B) Punteggi di danno istologico per topi SHIP+/+ e SHIP-/- espressi come mediana ± IQR. (C) Le sezioni trasversali ileali fisse sono state colorate con la tricromica di Masson per la fibrosi; Il collagene è colorato di blu. Le immagini sono state scattate con un ingrandimento 10x; barre di scala = 200 μm. Punteggi di fibrosi per topi SHIP+/+ e SHIP-/- espressi come IQR mediano ±. (D) Le sezioni trasversali ileali fisse sono state colorate con blu Alciano/PAS. Le immagini sono state fotografate con un ingrandimento del 10×; barre di scala = 200 μm. Tutte le sezioni sono rappresentative di n = 6 topi per gruppo (tranne SHIP+/+ Dex e SHIP-/- Dex, n = 5). La significatività statistica per il punteggio del danno istologico è stata determinata utilizzando il test di Kruskal-Wallis seguito dal test di confronto multiplo di Dunn. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Il desametasone riduce le concentrazioni di IL-1β negli omogeneizzati ileali a tutto spessore di topi SHIP-/-. I topi SHIP+/+ e SHIP-/- sono stati sottoposti a vaccinazione orale giornaliera con β-ciclodestrina allo 0,5% come veicolo di controllo (VC) o desametasone (Dex; 3 mg/kg) da 6 a 8 settimane di età. (A) Le concentrazioni di IL-1β, TNF e IL-6 sono state misurate in omogeneizzati ileali a tutto spessore. (B) Le concentrazioni di mieloperossidasi (MPO) e lipocalina-2 (LCN-2) sono state misurate in omogeneizzati di tessuto ileale a tutto spessore. Le ±analisi statistiche sono state condotte utilizzando il test di Kruskal-Wallis seguito dal test di confronto multiplo di Dunn. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Le concentrazioni di IL-1β sono correlate positivamente con il danno istologico e la fibrosi e la fibrosi è correlata con il punteggio del danno istologico nei topi SHIP-/-. L'analisi di correlazione di Spearman è stata eseguita per valutare le relazioni tra il punteggio del danno istologico, il punteggio della fibrosi e le concentrazioni di IL-1β nel tessuto ileale a tutto spessore di topi SHIP-/-. Sono state osservate correlazioni positive significative tra (A) il punteggio di danno istologico e le concentrazioni di IL-1β (r = 0,6813), (B) il punteggio di fibrosi e le concentrazioni di IL-1β (r = 0,4117) e (C) il punteggio di danno istologico e il punteggio di fibrosi (r = 0,6241). Ogni punto dati rappresenta un singolo mouse. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Componente di dannoPunteggio
Perdita dell'architettura della cripta0 = nessuno
1 = <25% di perdita
2 = 25-50% di perdita
3 = 50-75% di perdita
4 = >75% di perdita
Infiltrazione di cellule immunitarie0 = nessuno
1 = cellula immunitaria occasionale nella lamina propria
2 = aumento delle cellule immunitarie nella lamina propria
3 = cellule immunitarie confluenti nella lamina propria e nella mucosa che viola
4 = infiltrazione di cellule immunitarie in tutta la sezione
Iperplasia e ipertrofia delle cellule caliciformi0 = nessuno
1 = aumento del <50% del numero e delle dimensioni delle celle caliciformi
2 = aumento del >50% del numero e delle dimensioni delle celle caliciformi
Ulcerazione0 = nessuno
1 = ulcerazione intermedia
2 = ulcerazione sostanziale
Edema0 = nessuno
1 = <50% della sezione
2 = >50% della sezione
Ispessimento muscolare0 = nessuno
1 = ispessimento intermedio
2 = ispessimento sostanziale

Tabella 1: Punteggi di danno istologico. Il danno istologico delle sezioni trasversali ileali di topi SHIP+/+ e SHIP-/- colorati con H&E è valutato in base alle caratteristiche chiave dell'ileite che caratterizzano il modello murino SHIP-/-, tra cui la perdita di architettura (0-4), l'infiltrazione di cellule immunitarie (0-4), l'iperplasia e l'ipertrofia delle cellule caliciformi (0-2), l'ulcerazione (0-2), l'edema (0-2) e l'ispessimento muscolare (0-2).

Componente della fibrosiPunteggio
Collagene eccessivo0 = Architettura normale; nessun eccesso di collagene
1 = lieve aumento del collagene; limitato alla sottomucosa o alla sottosierosa
2 = Moderata espansione del collagene nella sottomucosa e nella muscolosità propria parziale, con fasci disorganizzati
3 = Collagene esteso e denso che sostituisce la struttura normale, coinvolgendo la sottomucosa e la muscolare (transmurale)
Iperplasia fibromuscolare/muscolarizzazione/obliterazione muscolare della sottomucosa0 = Nessuno, contenuto normale di sottomucosa muscolare
1 = Lieve aumento del contenuto muscolare
2 = Grande quantità di muscolo nella sottomucosa, influisce sulla morfologia ma sulla struttura normale
3= Il muscolo ha cancellato l'intero spazio sottomucoso

Tabella 2: Punteggio della fibrosi. La fibrosi nelle sezioni trasversali ileali di topi SHIP+/+ e SHIP-/- colorati con tricromia di Masson è stata valutata in base alle caratteristiche chiave della fibrosi intestinale osservate nel modello SHIP-/-, tra cui l'eccessiva deposizione di collagene (0-3) e l'iperplasia fibromuscolare o l'obliterazione muscolare della sottomucosa (0-3). Il collagene viene valutato per l'estensione e la disgregazione architettonica, mentre i cambiamenti muscolari vengono valutati in base al grado di infiltrazione muscolare e distorsione della struttura sottomucosa.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo delinea le procedure per la valutazione dell'ileite e della fibrosi intestinale nei topi SHIP-/-, un modello murino di infiammazione intestinale simile alla CD con patologia fibrotica di accompagnamento. Il modello murino SHIP-/- ricapitola le caratteristiche della MC che non sono comunemente osservate in altri modelli murini di infiammazione intestinale, in particolare la localizzazione ileale, l'infiammazione a chiazze e transmurale e la patologia fibrotica19,26. In combinazione con la facilità di riproduzione e il breve tempo per la manifestazione della malattia, il modello SHIP-/- è ben posizionato come un potente strumento per la ricerca traslazionale nel CD19.

In questo studio, la significatività statistica per il test FITC-destrano e il punteggio istologico sono stati valutati utilizzando il test di Kruskal-Wallis, poiché questi set di dati non soddisfacevano le ipotesi di normalità richieste per un ANOVA unidirezionale e i punteggi istologici rappresentano variabili discontinue e non parametriche. Sebbene le nostre analisi non abbiano prodotto differenze statisticamente significative tra i gruppi trattati con desametasone e quelli trattati con veicolo, abbiamo osservato tendenze chiare. Il desametasone ha ridotto la permeabilità intestinale e l'istopatologia dei topi SHIP-/- e questi effetti possono aver raggiunto la significatività con campioni di dimensioni maggiori.

Durante l'esecuzione di questo protocollo possono sorgere diverse sfide tecniche. Per quanto riguarda la manipolazione dei tessuti, le SHIP-/- ilea richiedono una manipolazione delicata durante la dissezione, poiché sono soggette a lacerazioni. Ciò è particolarmente importante quando si preparano i tessuti per l'imaging macroscopico. La fissazione dei tessuti è un altro fattore critico per l'analisi istologica. Il tessuto fissato in formalina è adatto sia per la colorazione tricromica H&E che per quella di Masson, ma è incompatibile con la colorazione Alcian Blue/PAS. Al contrario, il tessuto fissato di Carnoy è appropriato per la colorazione H&E e Alcian Blue/PAS, ma non per il tricromo di Masson. La fissazione di Carnoy porta a un'intensa e diffusa colorazione blu scuro, che oscura la visualizzazione del collagene e dello strato muscolare. Per l'analisi delle citochine, è essenziale elaborare campioni su ghiaccio poiché le citochine sono altamente sensibili alla degradazione. È fondamentale aliquotare gli omogeneizzati di tessuto chiarificato subito dopo la lavorazione. Cicli ripetuti di congelamento-disgelo possono compromettere sostanzialmente l'integrità delle citochine e minare eventuali differenze potenziali tra genotipi e/o gruppi di trattamento. Infine, per garantire una quantificazione accurata, si consiglia di eseguire più diluizioni di ciascun campione per confermare che le letture rientrino nell'intervallo lineare della curva standard del test e per ridurre al minimo la potenziale interferenza dalla complessa matrice tissutale. Affrontare queste considerazioni tecniche è essenziale per generare risultati riproducibili e interpretabili, ma anche la variabilità biologica inerente ai topi SHIP-/- deve essere gestita con attenzione.

Ci sono diversi aspetti critici dei topi SHIP-/- che dovrebbero essere presi in considerazione e attentamente controllati per garantire la riproducibilità e ridurre al minimo le variabili confondenti. Il microbioma intestinale ha un profondo impatto sullo sviluppo della malattia e sulle risposte terapeutiche nei modelli murini di IBD27,28. Il nostro lavoro precedente ha dimostrato che l'infiammazione intestinale nei topi SHIP-/- è dipendente dal microbiota e può essere migliorata con antibiotici29. Pertanto, i controlli dei compagni di cucciolata dovrebbero essere utilizzati per ridurre la variabilità guidata dal microbioma e i gruppi di trattamento devono essere bilanciati per l'origine della gabbia30. Inoltre, è essenziale un'attenta corrispondenza tra i sessi. Sebbene non siano state osservate differenze basate sul sesso nella penetranza o nella gravità della malattia nei topi SHIP-/-, altri modelli di ileite come SAMP1/YitFc, mostrano un'insorgenza precoce e una maggiore gravità della malattia nelle femmine14,31. Poiché gli ormoni sessuali possono anche modulare la composizione microbica32, la corrispondenza per il sesso è fondamentale per ridurre al minimo i potenziali fattori confondenti negli studi di trattamento. Inoltre, i singoli trattamenti in fase di valutazione possono avere un'efficacia differenziale nei topi maschi e femmine. Sebbene i nostri risultati attuali non rivelino differenze legate al sesso nella malattia o nella risposta terapeutica al desametasone, la corrispondenza del sesso dovrebbe essere eseguita in tutti gli studi di trattamento.

Oltre alle considerazioni sul microbioma e sul sesso descritte sopra, è importante includere i topi SHIP+/+ negli studi di trattamento per valutare gli effetti del veicolo e degli agenti terapeutici in assenza di infiammazione intestinale. Ciò garantisce che né il farmaco né il suo metodo di somministrazione causino o contribuiscano alla patologia nell'intestino sano, migliorando così l'interpretazione dell'efficacia e della sicurezza terapeutica.

Anche la tempistica dell'intervento terapeutico è fondamentale e deve essere modificata in base agli obiettivi sperimentali, in quanto esistono differenze significative sia nell'infiammazione che nella fibrosi nei topi a 4, 8 e 12 settimane di età19,26. I topi SHIP-/- sviluppano l'infiammazione intestinale già a 4 settimane di età, con tutti i topi che presentano infiammazione entro le 6 settimane di età, e i marcatori di patologia fibrotica possono essere misurati già a 6 settimane di età e sono ben consolidati entro le 8 settimane di età19,26. Pertanto, i trattamenti mirati all'infiammazione ileale dovrebbero iniziare a 6 settimane di età. Gli interventi antifibrotici possono essere avviati a scopo profilattico a 6 settimane o terapeuticamente tra 8-10 settimane. Tuttavia, l'insorgenza e la gravità della malattia possono variare con l'ambiente microbico, che differisce tra le strutture. Gli investigatori devono prima determinare la cinetica della malattia nella loro colonia prima di implementare i protocolli di trattamento. Inoltre, i topi SHIP-/- possono presentare una riduzione del peso fino al 17% entro 4-5 settimane, con un ulteriore 5% entro 8-10 settimane33. Gli animali che mostrano una profonda perdita di peso dovrebbero essere esclusi dagli studi, poiché ciò riflette una grave manifestazione di malattia e può compromettere i risultati del trattamento correlati alla patologia intestinale.

Una considerazione importante quando si analizza la progressione della malattia nel modello SHIP-/- è la selezione di marcatori infiammatori appropriati. Sulla base della nostra vasta esperienza con il topo SHIP-/-, la profilazione delle citochine è tipicamente focalizzata su mediatori specifici, come IL-1β, che è noto per essere sovraregolato durante la progressione della malattia. Tuttavia, per la caratterizzazione iniziale delle risposte infiammatorie o per la valutazione di nuove strategie terapeutiche, è consigliabile un'analisi multiplex delle citochine. Questo approccio imparziale consente una più ampia profilazione dell'ambiente infiammatorio e può rivelare bersagli inaspettati rilevanti per la patogenesi della malattia o la risposta al trattamento.

Il modello SHIP-/-mouse offre vantaggi pratici che consentono la riproducibilità e l'efficienza. I topi SHIP-/- sviluppano infiammazione ileale e fibrosi spontanee e coerenti senza la necessità di trigger esogeni. Ciò elimina la variabilità associata alla preparazione dei reagenti e ai protocolli di dosaggio non standardizzati quando si induce l'infiammazione intestinale. L'insorgenza della malattia è rapida, con infiammazione evidente entro 4-6 settimane di età e fibrosi entro 8 settimane di età, rendendo il modello efficiente in termini di tempo e costi. Inoltre, i topi SHIP-/- sono facili da allevare e mantenere, la genotipizzazione è semplice e non sono necessarie strategie di riproduzione specializzate. Ciò semplifica la gestione delle colonie, riduce il carico di lavoro tecnico e riduce il rischio di introdurre variabilità genetica non intenzionale 19,21,26. La malattia può essere valutata in modo affidabile utilizzando tecniche ampiamente disponibili nella maggior parte dei contesti di ricerca, tra cui il test FITC-destrano, la colorazione tricromica di H&E e Masson e l'ELISA. Queste caratteristiche combinate supportano una progettazione efficiente dello studio, riducono le barriere finanziarie e tecniche e promuovono la generazione coerente di dati tra i laboratori.

Sebbene il modello SHIP-/- presenti vantaggi unici, il modello presenta anche dei limiti. Come con tutti i modelli preclinici, non può replicare completamente la natura complessa e multifattoriale dell'IBD umana, che è influenzata da fattori genetici, immunitari e ambientali34. I modelli DSS e TNBS rimangono molto popolari grazie alla loro semplicità ed economicità. Se combinati con le modificazioni genetiche, questi modelli chimici possono fungere da strumenti efficaci per comprendere i contributi specifici del gene alla funzione di barriera35. Tuttavia, la loro principale utilità risiede nella modellazione della lesione epiteliale acuta; non riescono a catturare la patologia cronica immuno-mediata che caratterizza la MC e il loro meccanismo di danno epiteliale indotto da agenti chimici privi di rilevanza clinica diretta36. L'affidamento esclusivo su un modello può comportare una valutazione incompleta e/o fuorviante del potenziale terapeutico e si raccomanda di utilizzare più modelli per essere certi dell'efficacia del trattamento.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è supportato dalla struttura per la cura degli animali presso il BC Children's Hospital Research Institute e finanziato dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada attraverso la Canadian Glycomics Network (GlycoNet, A Network of Centre of Excellence) e il Canadian Institutes of Health Research (da MOP-133607 a LS). K.S. e W.M. sono beneficiari delle borse di dottorato TRIANGLE (TRaIning a New generation of researchers in Gastroenterology and LivEr program).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Microtubo a cappuccio a scatto da 1,7 mL & nbsp;DiamedSPE155-N
1x DPBS (senza cloruro di calcio, senza cloruro di magnesio)GibcoREF 14190-144
25G x figure-materials-1” aghi BDREF 305122Per la puntura cardiaca
26G x figure-materials-2” aghiBDREF 305110Arrossamento intestinale
Acido aceticoSigma-AldrichA6283Istologia
Soluzione di destrosio di citrato acido (38 mM di acido citrico, 107 mM di citrato di sodio, 136 mM di destrosio)Millipore SigmaC3821
Ago per l'alimentazione animale, non sterile, riutilizzabile, tipo 304SSMillipore Sigma CAD7900 Per gavage
Straight
Taglia: 24G,
Lxdiam. 1 in. x sfera di 1,25 mm,
AprotininaCayman Chemical9087-70-1Buffer di omogeneizzazione
Siringa BD Luer-Lok sterile, monouso, 5 mLBDREF 309646Arrossamento intestinale
BD OptEIA Mouse IL-6 ELISA SetBD in Biologia555240
BD OptEIA Mouse TNF ELISA Set IIBD in Biologia558534
BD® Luer Slip Tip Siringa sterile, monouso, 1 mLBDREF 309659
Cuscinetti in schiuma per biopsia quadrati, 30,2 x 25,4 x 2 mm H.Simport ScientificREF M476-1Istologia
Formalde-Fresh tamponato (Basso odore, 10% di formalina)Fisher ChemicalSF93-4Istologia
Piastre immunitarie non sterili a fondo piatto trasparenti a 96 pozziThermo Scientific439454
Eppendorf 5415R Centrifuga Refrigerata  Marshall ScientificEP-5415R
Alcol etilico anidroGreenfield GlobalP016EAANIstologia
Cassetta Tissue Fisherbrand TRU-FLOWFisher Scientific15-200-403Istologia
FITC-dextran, 3-5kDa (1g)Millipore SigmaFD4-1G
Numero CAS: 60842-46-8
LeupeptinMillipore Sigma103476-89-7Buffer di omogeneizzazione
Mouse IL-1 beta/IL-1F2 DuoSet ELISA R& Sistemi DDY401
Piastra multischermo a 96 pozzi, fondo solidoMillipore SigmaMSSWNFX40Bianchi, non sterili, non trattati
Cloroformio OmniPurMillipore Sigma3150Istologia
Omogeneizzatore Polytron PT-MR2100Cinematica AG632081
Lettore Multimodale Micropiastra Varioskan LuxThermo ScientificVL0L00D0

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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