Articolo metodologico

Modello murino per embolia microvascolare per microscopia a due fotoni in vivo utilizzando microsfere fluorescenti di polistirene

DOI:

10.3791/68939

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21 novembre 2025

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1Biomedical Engineering and Physics, Amsterdam University Medical Center, University of Amsterdam, 2Amsterdam Neuroscience, neurovascular disorders, 3Amsterdam Cardiovascular Sciences

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo contiene una descrizione dettagliata di un approccio passo dopo passo per un modello murino a finestra cranica cronica e embolia microvascolare, ottimizzato per la microscopia a due fotoni in vivo utilizzando microsfere fluorescenti al polistirene.

Abstract

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Le occlusioni microvascolari nel cervello sono relativamente comuni ma rimangono in gran parte poco studiate. Il tasso degli eventi, le conseguenze a lungo termine e i possibili meccanismi di compensazione sono in gran parte sconosciuti. I modelli attuali utilizzati per studiare questi eventi, come la fototrombosi e l'iniezione di microemboli, presentano ciascuno i propri vantaggi e limitazioni. Questo studio ha sviluppato un protocollo dettagliato che combina la preparazione di una finestra cranica cronica con l'induzione di embolie microvascolari cerebrali tramite iniezione intra-arteriosa di microsfere nei topi. Questa configurazione consente l'imaging in vivo a lungo termine della microvascolarizzazione e delle micro-occlusioni utilizzando la microscopia a due fotoni. Le microsfere vengono somministrate tramite un catetere posizionato nell'arteria carotide esterna (ECA), che è permanentemente legata. È importante sottolineare che l'arteria carotide comune (CCA) e l'arteria carotide interna (ICA) rimangono intatte durante e dopo la procedura, minimizzando così il disturbo del flusso sanguigno cerebrale. Per facilitare l'immediata imaging in vivo e prevenire il clustering o l'adesione delle microsfere alle punte delle pipette e al catetere, le microsfere vengono sospese in una miscela di FITC-Dextrano e 0,1% Tween 20. La tecnica di iniezione è stata validata utilizzando immagini 3D post mortem in situ per determinare la distribuzione delle microsfere. Questo studio ne dimostra ulteriormente l'utilità con un esempio in vivo di microscopia a due fotoni. Questo approccio fornisce un metodo coerente e robusto per indurre e studiare embolie microvascolari, consentendo di indagare la loro dinamica di impatto e di eliminazione utilizzando immagini ad alta risoluzione in vivo .

Introduzione

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Un ictus ischemico dovuto a embolia di una grande arteria cerebrale è un evento acuto e spessodevastante 1. Gli emboli possono anche manifestarsi in vasi più distali. Di conseguenza, possono svilupparsi infarti cerebrali silenziosi (SBI); Come suggerisce il nome, questi rimangono asintomatici e vengono tipicamente scoperti incidentalmente durante l'imaging per ragioni noncorrelate 2,3. Le SBI sono comuni e si collocano tra le condizioni cerebrovascolari più frequentemente osservate nelle autopsie di anziani 4,5. Studi epidemiologici hanno mostrato una prevalenza del 20% in individui senza storia di ictus. Gli SBI contribuiscono a disfunzioni cognitive e demenza, aumentano la mortalità complessiva e rappresentano un fattore di rischio per futuri ictus 6,7,8. Gli infarti hanno tipicamente un diametro di pochi millimetri e sono associati all'occlusione di arterie penetranti con diametri di circa 100 μm. Questi penetratori danno origine a un ampio letto arteriolare e capillare. Un piccolo microtrombo che attraversa le arterie penetranti e si incastra nella microcircolazione a valle probabilmente rimarrà non rilevabile all'angiografia9. Tuttavia, molti microtrombomi possono essere rilasciati nella fibrillazione atriale, nelle placche aterosclerotiche e da altrefonti 10,11,12,13,14. Oltre ai microtrombomi, altre microparticelle (MP), incluse particelle di grasso, aggregati cellulari e persino microplastiche, possono causare embolie microvascolari. Diversi studi mostrano la presenza di plastica MP nel sangue e nel cervello che è superiore al diametro capillare di 5μm 15,16.

Le occlusioni microvascolari rimangono relativamente poco studiate rispetto all'ictus acuto e alle SBI. Si sa poco sul tasso degli eventi, sulle conseguenze a lungo termine e sui possibili meccanismi di compensazione. Tuttavia, l'interesse sta crescendo rapidamente dopo la riuscita introduzione clinica della trombomia meccanica nell'ictus, dove le embolie microvascolari possono causare una compromessa della reperfusione microvascolare dopo una apparente ricanalizzazione riuscita della grande arteriacolpevole 17. Inoltre, c'è un aumento della ricerca sulle microplastiche, che potrebbe avere un effetto in parte attraverso emboliemicrovascolari 18,19,20.

Le occlusioni microvascolari nella corteccia del muro possono essere studiate, tra le altre cose, tramite microscopia multifotonica, utilizzando una finestra cranica. I modelli più comunemente utilizzati per studiare le occlusioni microvascolari cerebrali sono il modello fototrombotico e quello della microsfera. Il modello fototrombotico impiega coloranti fotosensibili per indurre embolie in vasi selezionati (tipicamente vasi non capillari) tramite fotoattivazione. Tuttavia, questo modello non consente lo studio delle embolie per un periodo più lungo a causa dell'attivazione del sistema fibrinolitico, che dissolvel'embolia 21,22. Inoltre, l'attivazione del colorante fotosensibile produce specie singole di ossigeno, causando danni endoteliali e alla barriera emato-encefalica (BBB) 23. Per studi sulla funzione endoteliale e BBB durante embolie cerebrali, e sugli effetti a lungo termine sulla circolazione cerebrale e sulla funzione cerebrale, si preferisce quindi il modello della microsfera. Il modello di iniezione di microsfere utilizza microsfere iniettate nella circolazione cerebrale per occludere la microvascolarizzazionecerebrale 9,24,25,26,27,28,29,30. Il possibile svantaggio di questo modello risiede nel fatto che non è possibile predeterminare la localizzazione delle embolie, a differenza del metodofototrombotico 31,32. Il vantaggio è che microsfere di diametri ben definiti possono essere iniettate, mirando così a vasi (micro-) di diametrispecifici 33,34,35.

Nel corso degli anni sono stati sviluppati molteplici approcci per l'iniezione di microsfere nella circolazione cerebrale dei roditori. Questi protocolli trovano consenso nell'accedere al triangolo carotidee, costituito dall'arteria carotide comune (CCA), dall'arteria carotide interna (ICA) e dall'arteria carotide esterna (ECA) per l'iniezione della microsfera intra-arteriosa. Il metodo per l'iniezione intra-arteriosa della microsfera varia tra i protocolli in diversi modi. Innanzitutto, gli studi hanno utilizzato una siringa 9,26,27,29,33,34 o un catetere 25,28,30,36. In secondo luogo, c'è una notevole variazione nel numero e nella dimensione delle microsfere iniettate. I diametri delle microsfere variano tipicamente tra 10 e 50 μm, con la scelta che dipende dalla dimensione del recipiente bersaglio. Come regola generale, più grandi sono le microsfere, più basso è il numero che si dovrebbe iniettare, poiché ci sono meno arteriole rispetto aicapillari 25, 26, 30.

Ottenere un'iniezione costante di microsfera intra-arteriosa rimane una sfida. In pratica, vengono iniettate grandi quantità di microsfere, ma solo una frazione raggiunge la circolazione cerebrale. Questo è particolarmente problematico per studiare gli effetti delle microsfere alloggiate tramite microscopia a due fotoni in vivo , poiché il successo di questa tecnica dipende dalla presenza di microsfere negli strati esterni della corteccia del topo all'interno della visuale attraverso la finestra cranica preparata. Scegliere coloranti fluorescenti appropriati per le microsfere è fondamentale, poiché combinarli con modelli topini transgenici e colorazione intravascolare può essere difficile a causa dell'intensa fluorescenza delle microsfere e degli spettri di emissione sovrapposti.

Le occlusioni microvascolari sono studiate nei modelli di roditori, e effetti sinergici di più microsfere sono stati precedentemente dimostrati in cervelli ex vivo di roditori 9, così come un'apparente estravasazione di tali particelle, un processo chiamatoangiofagia 33,35,37,38. Per consentire la loro indagine in vivo, furono sviluppati metodi per la microscopia multifotonica in topi con finestre craniche. Lo scopo dell'attuale studio è sviluppare e riportare un protocollo dettagliato per l'iniezione intra-arteriosa di microsfere nei topi che ottimizzi lo studio dei loro effetti sul tessuto cerebrale e sul loro destino. Il principale vantaggio di questo protocollo è la migliorata efficienza della somministrazione, la riduzione della perdita di microsfera e l'aumento della probabilità della loro presenza nel territorio dell'arteria cerebrale media (MCA) all'interno dell'area di imaging cranico. Il protocollo ottimizzato di iniezione microsfera viene valutato utilizzando microscopia a due fotoni in vivo e imaging 3D post mortem in situ con un criomicrotomodedicato a imaging 39.

Protocollo

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Tutte le procedure che coinvolgevano gli animali seguivano la Guida per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio. Il Comitato Centrale per gli Esperimenti con Animali dei Paesi Bassi ha concesso l'approvazione completa (AVD11400202316817).

NOTA: Sono stati utilizzati topi maschi e femmine di età compresa tra 2 mesi e 1 anno. All'arrivo, gli animali venivano acclimatati per 7 giorni prima di qualsiasi procedura sperimentale. Gli animali venivano ospitati con un massimo di 4 per gabbia, forniti di cibo e acqua ad libitum, e mantenuti in un ciclo di 12 ore chiaro-buio. I topi NG2-DsRed e TIE2-GFP sono stati acquisiti (vedi Tabella dei Materiali per dettagli) e selezionati internamente.

1. Impianto cranico a finestra

  1. Anestesia e cure pre-chirurgiche
    1. Aggiungi 0,06 mg/mL di Carprofene all'acqua potabile un giorno prima dell'inizio dell'intervento alla finestra cranica.
    2. Pesa il topo e somministra 5 mg/kg di Carprofene e 2 mg/kg di desametasone sottocutaneamente 30 minuti prima dell'intervento.
    3. Prepara l'area chirurgica posizionando un cuscinetto riscaldante con un sistema di feedback sul telaio stereotattico e coprendolo con un panno sterile.
    4. Disponi tutti gli strumenti chirurgici sterili su un secondo panno sterile.
    5. Anestesiare il topo in una camera di induzione con una miscela d'aria di 1 L/min (30% ossigeno e 70% aria medica) e 3-4% di isoflurano, seguita da mantenere l'anestesia con 1,5-2% di isoflurano utilizzando una mascherina facciale.
    6. Fissa il mouse in un telaio stereotattico e inserisci la sonda termometrica del cuscinetto riscaldante in modo rettale usando lubrificante. Applica la pomata per gli occhi per evitare l'asciugatura e imposta la borsa termica a 37 °C.
    7. Somministrare sottocutaneamente 1,5 mg/kg di ropivacaina sulla linea dell'incisione chirurgica 5 minuti prima dell'intervento.
    8. Pulisci la pelle sopra il cranio dal collo fino a poco oltre gli occhi con betadine usando una punta di cotone.
  2. Preparazione chirurgica per la fissazione di testi e finestre
    1. Utilizzando pinze sterili e forbici chirurgiche, effettuare un'incisione iniziale nella pelle sopra la parte posteriore del cranio. Estendere l'incisione dalla sutura lambda in avanti lungo la linea mediana fino alle suture frontali appena anteriori al bregma (Figura 1A). Ritrai e rimuovi con attenzione la pelle per esporre completamente i muscoli temporali su entrambi i lati.
    2. Applicare circa 0,1 mL di lidocaina all'1% sul cranio per minimizzare il sanguinamento.
    3. Rimuovere il periosteo e graffiare tutte le zone del cranio dove la barra della testa sarà fissata con una lama chirurgica. Fai i graffi perpendicolari lungo il cranio per garantire una solida adesione della barra della testa.
    4. Pulisci il sangue residuo con una punta di cotone e asciuga il cranio con aria compressa.
  3. Fissazione della barra della testa
    1. Prepara una miscela di colla dentale in un contenitore ceramico freddo (4 °C) aggiungendo 100 μL di monomero a 0,1 g di polimero e mescolando. Aggiungi 1 goccia di catalizzatore alla miscela per iniziare una rapida solidificazione della colla.
    2. Applica la colla sul fondo della barra della testa. Inclina leggermente la barra della testa verso il lato laterale sinistro dal seno sagittale e premi sul cranio. Applica colla aggiuntiva sui bordi della barra per sigillare tutte le aperture. Questo garantisce un'adesione salda.
    3. Prepara una miscela di cemento dentale mescolando 100 μL di liquido per cemento dentale con 0,1 g di polvere. Applica il cemento su tutti i lati della barra della testa impedendo al cemento di scorrere sul cranio nell'area di perforazione. Aggiungere uno strato aggiuntivo di cemento dentale sopra la barra della testa per formare un pozzo, permettendo l'applicazione dei fluidi sulla finestra cranica (Figura 1B).
    4. Lascia asciugare la colla dentale e il cemento per almeno 10 minuti.
    5. Conferma l'aderenza salda della barra della testa applicando delicatamente pressione sul cranio dove verrà effettuata la craniotomia. La barra della testa è adeguatamente aderita quando il cranio non si muove e non appare liquido tra il cemento dentale e il cranio.
  4. Craniotomia
    1. Attacca il topo al portaoggetti usando la barra della testa o mantenilo nel telaio stereotassico per fissare saldamente la testa dell'animale durante la craniotomia.
    2. Segna il bersaglio di perforazione della craniotomia (diametro 4 mm) sul cranio usando un marcatore a punta fine. Individua l'MCA visibile attraverso il cranio per assicurarti che la finestra cranica sia posizionata in modo ottimale, coprendo il più possibile dell'MCA. Per confermare la dimensione e la posizione corrette del bersaglio di perforazione, tieni il vetro di copertura sopra l'area segnata e regola la dimensione del bersaglio di perforazione secondo necessità.
    3. Inizia a forare in cerchi ai segni senza esercitare pressione sul cranio, per evitare la generazione di calore (Figura 1C). Raffredda il cranio applicando soluzione salina ogni 30 secondi. Durante il raffreddamento, pulisci e raffredda la testa del trapano immergendola in acqua, poi asciugandola con un asciugamano di carta. Rimuovi regolarmente tutta la polvere ossea usando aria compressa. Conferma la dimensione della craniotomia posizionando il vetro di copertura sul cranio e regolando la perforazione se necessario.
    4. Continua a forare in cerchi finché l'osso non è adeguatamente assottigliato. Le crepe appariranno nell'area di perforazione una volta che il cranio è quasi perforato. Assicurati che l'osso sia sufficientemente assottigliato aggiungendo soluzione salina per ammorbidire il cranio assottigliato e premendo delicatamente il centro dell'osso cranico all'interno dell'area di perforazione. L'area di perforazione è abbastanza sottile quando il cranio si muove uniformemente su tutti i lati dell'area sotto una pressione delicata. Continua a forare fino a questo punto. Non perforare il cranio; Questo rischia di danneggiare la dura madre e il tessuto cerebrale. Tieni l'area di foratura immersa nell'aCSF se la dura madre è danneggiata o si verifica un sanguinamento.
      NOTA: Prima di rimuovere il cranio, assicurati che tutta la polvere ossea sia rimossa dall'area di perforazione. Le particelle ossee residue sulla duram possono potenzialmente innescare la ricrescita ossea sotto la finestra.
    5. Elimina completamente tutta la polvere ossea usando aCSF e aria compressa. Applica un CSF nell'area perforata finché il cranio non è completamente sommerso. Utilizzando un ago calibro 27 (0,4 mm x 16 mm) o 30 gauge (0,3 mm x 13 mm), perfora con cura il cranio assottigliato orizzontalmente (~180°), evitando danni alla dura madre e al cervello. Spingi delicatamente l'osso verso l'alto finché non si stacca, applicando la minima forza. Se l'osso non si stacca facilmente, continua a forare. Rimuovere il cranio staccato con una pinza, mantenendo il cervello immerso nell'aCSF (Figura 1D).
    6. Risciacqua il cervello con un CSF, poi applica una spugna emostatica sterile e assorbente in gelatina suina imbevuta di aCSF sul cervello per controllare il sanguinamento locale per 2 minuti. Rimuovi con attenzione la spugna, mantenendo il cervello immerso nell'aCSF. Continua a lavare con aCSF per assicurarti che non rimanga polvere ossea o sangue sul cervello. Se il sanguinamento persiste, posiziona una nuova spugna emostatica sterile e assorbente, imbevuta di aCSF, sul cervello.
      NOTA: Un lieve sanguinamento è comune durante la rimozione ossea. Assicurati che il sanguinamento sia stato fermato prima di posizionare il vetro, poiché il sanguinamento residuo può ridurre la chiarezza del vetro.
  5. Posizionamento del vetro di copertura
    1. Assorbire l'aCSF che ricopre il cervello con una punta di cotone, lasciando solo uno strato sottile. Posiziona il vetro di copertura sul cervello e premilo delicatamente contro l'apertura del cranio usando micro-pinze piegate. Assicurati che il vetro di copertura sia posizionato leggermente sotto il livello del cranio e parallelo alla barra della testa.
      NOTA: Il vetro deve essere premuto saldamente contro il cervello per prevenire la formazione di carie e preservare la qualità delle finestre. Mantenere il vetro di copertura parallelo alla barra della testa garantisce che sia perpendicolare all'obiettivo del microscopio, migliorando la qualità dell'immagine.
    2. Fissa il vetro di copertura al teschio e alla barra della testa con colla epossidica, applicandola ai lati mentre tieni il vetro saldamente in posizione e parallelo alla barra della testa.
    3. Sigilla tutti i bordi del vetro di copertura con colla per evitare l'esposizione al cervello. Tieni una goccia di aCSF sul cervello durante l'applicazione per evitare che la colla penetri sotto la finestra o entri in contatto con la dura mater (Figura 1E).
    4. Lascia solidificare la colla per 5 minuti.

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Figura 1: Panoramica del protocollo di craniotomia. Esempi dettagliati di immagini e disegni schematici dei passaggi cruciali durante la craniotomia e la chirurgia di posizionamento della barra della testa. (A) Rimozione della pelle (passo 2.2). (B) Attacco del bilanciere frontale (passo 2.3). (C) Perforazione della craniotomia da 4 mm (passo 2.4.3). (D) Rimozione del cranio (passo 1.4.5). (E) Posizionamento del vetro di copertura (passo 1.4.7). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Cura post-chirurgica
    1. Somministrare 5 mg/kg di Carprofen per via sottocutanea.
    2. Trasferisci l'animale in una gabbia di recupero a 37 °C per 30 minuti. Poi riportalo nella gabbia di casa con 0,06 mg/mL di Carprofene nell'acqua potabile per un massimo di 2 giorni dopo l'intervento.
    3. Fornire cibo immerso in 0,06 mg/mL di Carprofene fino al ritorno del peso pre-operatorio.
    4. Lascia all'animale recuperare per almeno 7 giorni prima di eseguire il modello di embolia microvascolare.

2. Modello murino con embolia microvascolare

  1. Assemblaggio del catetere
    1. Inserire la punta di un microcatetere lungo 20 cm (ID 0,23114 OD 0,27432 mm) in un catetere trasparente (ID 0,31 OD 0,64 mm) e sigillare la connessione con colla epossidica e nastro adesivo. Conferma che la lunghezza totale del catetere sia sufficiente a contenere almeno 160 μL.
    2. Inserire un ago luer-lock calibro 27 (0,1 mm x 16 mm) all'estremità opposta del catetere trasparente. Sigilla l'estremità con colla epossidica e nastro adesivo.
    3. Riempi una siringa da 1 mL con soluzione salina e collegala al blocco luer dell'ago del catetere. Risciacquo con 0,7 mL di soluzione salina, assicurandosi che non rimangano perdite o bolle d'aria.
    4. Riempi il catetere con 80 μL di soluzione salina e segna il livello raggiunto nel catetere.
  2. Anestesia e cure pre-chirurgiche
    1. Fornire al topo acqua potabile contenente 0,06 mg/mL di Carprofen un giorno prima dell'intervento di embolia microvascolare.
    2. Posiziona una borsa termica con un sistema di feedback sotto un panno sterile e impostala a 37 °C.
    3. Posiziona tutti gli strumenti chirurgici sterili su un secondo panno sterile.
    4. Pesa il topo e somministra 5 mg/kg di Carprofen sottocutaneamente 30 minuti prima dell'intervento.
    5. Anestetizzare il topo utilizzando isoflurano al 3-4% in una camera di induzione con un flusso di gas di 1 L/min composto dal 30% di ossigeno e 70% da aria chirurgica.
    6. Trasferire il topo sul tavolo operatorio e mantenere l'anestesia tramite una maschera facciale che somministra 1,5-2% di isoflurano a 1 L/min con il 30% di ossigeno e 70% d'aria.
    7. Inserisci una sonda per la temperatura rettale lubrificata e applica una pomata per gli occhi per evitare l'asciugatura.
    8. Posizionare una siringa da 2 mL sotto il collo del topo supino per facilitare l'accesso all'area chirurgica.
    9. Fissa delicatamente le zampe anteriori al tavolo operatorio con del nastro adesivo.
    10. Rasi l'area chirurgica e applica betadine seguita dalla lidocaina.
  3. Incisione
    1. Verifica la profondità dell'anestesia usando una pizzica per il dito del piede.
    2. Eseguire un'incisione mediana di circa 0,5 cm sopra la trachea sotto la mandibola utilizzando forbici chirurgiche e pinze dissezionali.
    3. Dissezionare il tessuto conlettivo superficiale alla fascia cervicale utilizzando pinze micro-suture per esporre i muscoli sternohioidi sottostanti.
    4. Separare i muscoli sternohioidei sinistro e destro strappando delicatamente il tessuto connettivo tra di essi. Ritrae il muscolo omohioideo destro caudalmente lateralmente con un uncino di tessuto. Assicurati che il triangolo carotide destro, inclusi CCA, ICA ed ECA, sia chiaramente visibile.
  4. Preparazione chirurgica della CCA, ICA, ECA e dell'Arteria parietale posteriore (PPA)
    NOTA: Evita di afferrare o pizzicare il nervo vago; Muovilo con delicatezza solo per evitare effetti negativi sulla salute dell'animale. Non toccare la trachea, poiché questo può causare problemi respiratori. Identificare l'arteria occipitale (OA), che si dirama dall'ICA a metà strada tra la biforcazione a forma di Y dell'ICA e l'origine dell'ECA, e l'arteria tiroidea superiore (TA), che si dirama dal lato mediale dell'ECA. Queste arterie sono fragili e devono essere trattate con estrema attenzione.
    1. Rimuovere eventuali fascie e tessuto adiposo rimasti intorno alla CCA.
    2. Separare con attenzione il CCA dal nervo vago.
    3. Metti due filetti 4/0 1.5 intorno al CCA e annodali in modo morbido. Assicurati che i nodi non ostacolino il flusso sanguigno della CCA.
    4. Rimuovere fascia e tessuto adiposo dall'ICA e dalla PPA. Lega temporaneamente il PPA e tutti i rami laterali ICA, incluso l'OA, legando un nodo con un filo 4/0 1.5.
    5. Rimuovere fascia e tessuto adiposo dall'ECA e dall'AT. Posiziona due nodi allentati attorno all'ECA e al TA usando filettature 4/0 1.5. Posiziona il filo più distale il più lontano possibile dalla biforcazione a forma di Y e usalo per legare permanentemente l'ECA e la TA. Lascia il nodo prossimale non legato.
  5. Preparazione della soluzione microsfera e carico del catetere
    NOTA: Prepara la soluzione di FITC-Dextran/microsfera poco prima dell'iniezione per minimizzare l'adesione della microsfera al catetere.
    1. Omogeneizzare e sonicare le microsfere da 10 μm (7,2 x 106 microsfere/mL) per ottenere una sospensione uniforme delle singole particelle.
    2. Preparare 140 μL di 25 mg/mL da 70 kDa FITC-Dextran contenente 0,1% di Tween20, poi aggiungere 20 μL di microsfere omogeneizzate per ottenere 160 μL di miscela FITC-Dextran/Tween20/microsfera contenente 1,44 × 105 microsfere.
    3. Ritrae brevemente la siringa collegata al catetere per creare un airlock.
    4. Immergi la punta del catetere nella miscela preparata di FITC-Dextran/Tween20/microsfera e tira lentamente la siringa finché la miscela non è nel catetere.
    5. Assicurati che non ci siano bolle d'aria nel catetere. Se presente, svuota la miscela in un contenitore da 0,5 mL e ripeti i passaggi 2.5.3 e 2.5.4.
    6. Posiziona la siringa con il catetere carico nella pompa della siringa. Imposta la pompa a 10 μL/min e fai funzionare finché non appare una piccola goccia di miscela microsferica alla punta del catetere.
  6. Inserimento catetere e iniezione di microsfere
    NOTA: Evitare di iniettare bolle d'aria nel sistema vascolare, poiché ciò può causare gravi effetti avversi o la morte. Le bolle d'aria possono derivare da un carico errato del catetere o da perdite nel tubo.
    1. Posiziona una clip per il recipiente sull'ICA e stringi uno dei nodi prossimali precedentemente preparati attorno al CCA (vedi passo 2.4.3).
    2. Utilizzando microforbici, realizzare una piccola incisione diagonale nell'ECA circa 0,5 mm distale rispetto al filo di legatura. Assicurati che la dimensione dell'incisione sia leggermente inferiore al diametro del catetere.
    3. Assorbi il sangue con un panno o tessuto sterile, assicurandoti che nessun sangue continui a fuoriuscire oltre le ligature e la clip del vaso.
      NOTA: Il triangolo vascolare deve rimanere libero dal sangue dopo l'incisione ECA. Il sangue residuo può portare alla formazione di coaguli, che possono causare grandi eventi ischemici cerebrali nel ripristinare il flusso carotide o bloccare l'ECA, impedendo l'iniezione nella microsfera.
    4. Avvia brevemente la pompa della siringa per formare una goccia di miscela microsferica alla punta del catetere, confermando che non rimanga aria nella punta.
    5. Apri l'incisione ECA e inserisci il catetere usando micro-pinze sottili. Evitare di toccare altre superfici durante l'inserimento per evitare la perdita della miscela di microsfere o l'ingresso d'aria nel catetere. Se l'inserimento fallisce o la punta del catetere tocca una superficie, ripetere il passo 2.6.4 prima di riprovare.
    6. Fissare il catetere nell'ECA stringendo la sutura prossimale (vedi passo 2.4.5) attorno all'ECA.
    7. Assicurati che non ci siano perdite o bolle d'aria all'interno della vascolatura avviando la pompa della siringa a 10 μL/min. Se è presente uno dei due, stacca il catetere e torna al passo 2.6.4.
    8. Se non si rilevano perdite o bolle d'aria, si continua a pompare a 10 μL/min per aumentare gradualmente la pressione nel catetere e nella vascolatura fino a osservare un visibile ingrossamento dell'arteria. Per corrispondere alla pressione arteriosa dell'animale, stabilire una pressione adeguata nel catetere e nella vascolarizzazione prima di riaprire l'ICA e la CCA. Quando il flusso sanguigno viene ristabilito nel CCA e nell'ICA, un po' di sangue può entrare nel catetere, ma successivamente verrà reiniettato nell'ICA. Confermare visivamente l'iniezione della miscela microsferica nell'ECA e che l'accumulo di pressione è efficace osservando il colorante FITC verde riempire le arterie. Se ciò non viene osservato, fermare la pompa della siringa, rimuovere il catetere e ripetere i passaggi 2.6.4 a 2.6.8.
    9. Rimuovi la clip del recipiente dall'ICA, poi aumenta la portata della pompa della siringa a 20 μL/min. Confermare il successo dell'iniezione della microsfera verificando che l'ICA distale alla biforcazione PPA sia riempita con colorante FITC. Se confermato, procedere al passo 2.6.11; Se no, procedi al passo 2.6.10.
    10. Ferma la pompa della siringa e allenta la legatura PPA. Riposizionare la legatura PPA più distalmente rispetto alla biforcazione ICA-PPA, quindi stringere la legatura. Torna al passo 2.6.9.
    11. Rimuovere il filo che legava il CCA per permettere al mix della microsfera di fluire nell'ICA.
    12. Risoluzione dei problemi in caso di flusso retrogrado durante l'iniezione della miscela microsferica:
      1. Se si verifica un flusso retrogrado della miscela microsferica nella CCA, si riduce il flusso della pompa della siringa a 10 μL/min.
      2. Se il flusso retrogrado continua, si comprime delicatamente l'ECA, l'ICA e il CCA usando micro-forcie per assicurarsi che non ci siano ostruzioni del flusso a causa di un trombo.
      3. Conferma visivamente che non è presente embolo d'aria all'interno della vascolatura. Un embolo d'aria può essere riconosciuto come una sezione trasparente all'interno della vascolatura.
      4. Se è presente un embolo d'aria, fermare la pompa della siringa e spostare l'embolo d'aria all'ECA comprimendo delicatamente l'arteria con micro-pinze. Lega il CCA e posiziona una clip per il recipiente sull'ECA. Rimuovere il catetere e l'embolo d'aria e tornare al passo 2.6.4.
      5. Se non è presente ostruzione, ma il flusso retrogrado continua, chiudi il CCA usando una clip per il recipiente e torna al passo 2.6.10.
        NOTA: Il flusso retrogrado della miscela microsferica nella CCA non dovrebbe verificarsi, poiché potrebbe indicare una riapertura inadeguata dell'ICA, embolia atmosferica o formazione di trombo con effetti potenzialmente dannosi sull'esito dell'esperimento.
    13. Interrompere l'iniezione della microsfera spegnendo la pompa della siringa una volta che la miscela nel catetere raggiunge la soglia degli 80 μL (vedi passo 3.1.4). Viene iniettato un totale di 80 μL di FITC-Dextran/Tween20 con 7,2 x 104 microsfere.
  7. Completamento della procedura
    1. Legare il CCA usando il nodo preparato rimanente (vedi passo 2.4.3) e chiudere l'ICA con la clip del recipiente.
    2. Rimuovere il catetere dall'ECA mantenendo la filettatura che fissa il catetere nell'ECA nella stessa posizione.
    3. Lega permanentemente l'ECA stringendo il filettatore che aveva fissato il catetere.
    4. Rimuovi la clip del vaso e i filetti intorno al CCA, ICA e PPA per ripristinare il flusso sanguigno. Inumidisce l'area chirurgica con qualche gocce di soluzione salina.
    5. Sutura la pelle con un ago curvo a taglio inverso 3/8 di 12 mm e una sutura di seta 3-0 non assorbibile (USP).
  8. Assistenza post-chirurgica
    1. Somministrare sottocutaneamente 5 mg/kg di Carprofene.
    2. Trasferisci l'animale nella gabbia di recupero (~33 °C) per 30-60 minuti. Riporta l'animale nella gabbia di casa una volta completamente guarito.
    3. Per i primi 2 giorni, lascia in ammollo per 10 minuti con 0,06 mg/mL di Carprofene e somministralo all'animale, integrando l'acqua potabile con 0,06 mg/mL di Carprofene. Dopo questo periodo, continuare a somministrare cibo bagnato senza Carprofen finché l'animale non torna al suo peso pre-operatorio.
    4. Monitora l'animale più volte al giorno per i primi 2 giorni, poi 3 volte a settimana. Eutanasia l'animale se si raggiunge un obiettivo umano.
      NOTA: Gli obiettivi umani sono definiti secondo la Direttiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo. Inoltre, eutanasiare qualsiasi animale se mostra segni di ischemia, come comportamento di rotazione o paralisi, poiché il modello di embolia microvascolare non dovrebbe causare un evento ischemico importante.

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Figura 2: Chirurgia per embolia microvascolare. Esempi dettagliati di immagini e disegni schematici dei passaggi cruciali durante l'intervento di embolia microvascolare. (A) Preparazione delle legature CCA (2x), ECA (2x), TA, OA e PPA (passo 2.4). (B) Legatura (temporale) della CCA (1st) ed ECA, seguita dalla chiusura dell'OA e della PPA e temporaneamente della chiusura dell'ICA con una clip vasica, permettendo un'incisione nell'ECA senza sanguinamento (passo 2.6.2). (C) Posizionamento del catetere nell'ECA dissezionata, che vengono legati insieme con la seconda sutura (passo 2.6.7). (D) Apertura della sutura prossimale attorno al CCA e rimozione della clip del vaso dall'ICA per ripristinare il flusso sanguigno, seguita dall'iniezione della miscela microsferica nell'ICA (passo 2.6.10). CCA = Arteria Carotidea Comune; ECA = Arteria carotide esterna; TA = Arteria tiroidea; OA = Arteria occipitale; PPA = Arteria Pterigopalata; ICA = Arteria Carotidea Interna. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Imaging in vivo

  1. Microscopia a due fotoni
    1. Inserire l'animale nel porta-immagini a due fotoni del microscopio per l'imaging post-operatorio in vivo . Mantieni un'anestesia leggera con isoflurano all'1,2% in una miscela da 1 L/min di 30% ossigeno e 70% aria, e monitora la frequenza e la profondità della respirazione. Vedi la Tabella Supplementare 1 per i dettagli dell'installazione del microscopio.
    2. Individua le microsfere incastrate attraverso la finestra cranica usando un obiettivo 10x (10x/0,30 DRY) e illuminazione a lampada al mercurio. Successivamente, passa all'imaging a due fotoni con un obiettivo di immersione in acqua 25x (25x/0,95 ACQUA). Vedi la Tabella Supplementare 2 per le impostazioni di immagini.
    3. Registra le pile Z intorno alla microsfera di interesse.

4. Analisi post mortem

  1. Endpoint sperimentale per l'imaging in situ
    1. Quando si raggiunge il punto di arrivo sperimentale, si sopporta l'eutanasia dell'animale tramite lussazione cervicale sotto > 4% di isoflurano in una miscela di 1 L/min di 30% di ossigeno e 70% di aria medica.
  2. Imaging cerebrale in situ
    1. Estrai il cervello, lo immergi in un solvente di sodio al 3,0% di carbosilmetilcellulosa (Sigma) miscelato con inchiostro nero allo 0,1% (VWR), e congelalo a −20 °C per almeno 24 ore.
    2. Immagini il cervello utilizzando un piccolo sistema di criomicrotomo a immagini fluorescenti 3D personalizzato (small-3D-FICS) precedentemente descritto da Juch R.N.S. et al.40. Imposta il sistema per tagliare verticalmente il cervello in sezioni da 16 μm e immagini a una risoluzione di 13,66 × 13,66 μm. Consulta la Tabella Supplementare 3 e la Tabella Supplementare 4 per le impostazioni di imaging e le specifiche del sistema. Analizza le immagini usando il softwareArticulus 41.
  3. Imaging in situ del topo intero
    1. Rimuovi la pelle, i denti e la coda dell'animale.
      NOTA: La rimozione della coda è opzionale ma aumenta la velocità di immagine.
    2. Immergere l'animale in solvente di sodio al 3,0% di carbosilmetilcellulosa (Sigma) miscelato con inchiostro nero allo 0,1% (VWR), e congelare a −20 °C per almeno 24 ore.
    3. Immagini l'animale usando un grande sistema di criomicrotomo per immagini fluorescenti 3D personalizzato (large-3D-FICS) come descritto in precedenza 42. Imposta il sistema per tagliare sezioni a 25,9 μm con una risoluzione in piano di 26,09 μm. Consulta la Tabella Supplementare 5 e la Tabella Supplementare 6 per le impostazioni di imaging e le specifiche del sistema. Analizza le immagini usando il softwareArticulus 41.

Risultati

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Imaging post mortem in situ

Il successo dell'intervento di embolia microvascolare è stato confermato dall'autopsia post mortem di tutto il corpo e del cervello completo 4 giorni dopo l'intervento di embolia microvascolare (Figura 3A). La sezione sagittale di un topo mostra la presenza di microsfere nel cervello. La Figura 3B,C mostra un esempio di cervello di topo estratto, 1 giorno dopo l'intervento di embolia microvascolare. Le microsfere erano prevalentemente alloggiate nell'emisfero ipsilaterale, nel territorio di flusso delle arterie cerebrali medie e anteriori. Il conteggio delle microsfere nelle fette di cervello è aumentato significativamente quando è stato aggiunto Tween20 alla miscela (Figura 3E). Il monitoraggio del peso durante il recupero dopo l'intervento di microembolia mostra che i topi hanno perso meno peso e si sono ripresi più rapidamente dopo l'intervento quando sono stati iniettati con una miscela di microsfera che conteneva Tween20 (Figura 3F).

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Figura 3: Distribuzione delle microsfere nel topo dopo un intervento di embolia microvascolare. Localizzazione in situ di microsfere a 10 μm nel mouse visualizzata utilizzando il softwareArticulus 41. (A) Esempio del piano sagittale di un topo intero fotografato con il grande 3D-FICS dopo un intervento di embolia microvascolare. (B-D) Immagini rappresentative assiale, coronale e sagittale di un cervello di topo, riprese utilizzando il piccolo 3D-FICS. (E) Numero medio di microsfere rilevate per sezioni cerebrali coronali di 50 μm approssimativamente ± 0,5 mm per le condizioni di Controllo e Tween20. Le barre rappresentano la deviazione media ± standard. Le misurazioni individuali sono mostrate come puntini. Il confronto statistico è stato effettuato utilizzando un test t non accoppiato; Il valore p è indicato nel grafico. Gli outlier sono stati identificati e rimossi usando il metodo dell'intervallo interquartile (IQR) (n = 1 per entrambi i gruppi), risultando in una dimensione finale del gruppo di n = 3 per i controlli e n = 14 per il Tween20. (F) Cambiamenti di peso normalizzati nel tempo dopo l'intervento di embolia microvascolare al momento 0. I pesi sono stati normalizzati alla base di ciascun animale durante l'intervento. Le linee mostrano la media ± SD per gruppo (Controllo, n = 4; Tween20, n = 5) con Control in blu e Tween20 in arancione scuro. La significatività statistica tra i gruppi in ogni momento è stata valutata utilizzando test t a due code non abbinati. (* = p < 0,05, ** = p < 0,01) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Iniezione di microsfera e microscopia a due fotoni in vivo

Durante l'iniezione della microsfera, i cateteri rivestiti con il 5% di BSA hanno mostrato molte microsfere aderite alla superficie del catetere, e le microsfere in movimento erano spesso raggruppate, il che può potenzialmente causare occlusioni più grandi (vedi Video Supplementare 1). Inoltre, aggiungere il 5% di BSA nella miscela microsfera per prevenire aderenze e clustering non è auspicabile a causa di una potenziale risposta immunitaria all'iniezione43,44. Per aggirare questo problema, è stata utilizzata una soluzione Tween20 allo 0,1% nella miscela di microsfere, risultando in un numero visibilmente maggiore di microsfere che scorrono attraverso il catetere e nel numero desiderato (> 20) di microsfere nella finestra di imaging (Figura 4 e Video Supplementare 2). La Figura 4A,B mostra un'immagine panoramica della corteccia cerebrale in microscopia a fluorescenza 0,5 ore dopo l'intervento di embolia microvascolare. Ogni punto bianco rappresenta una microsfera che occlusa un capillare nella microvascolarizzazione cerebrale. La Figura 4C,D mostra ad esempio la proiezione 2D delle immagini z-stack a due fotoni. Le microsfere stanno causando embolie microvascolari cerebrali con perfusione compromessa, indicata dall'assenza di colorante intraluminale a valle della microsfera (Figura 4E e Video Supplementare 3). Inoltre, queste embolie causano una disgregazione della BBB con l'estravasazione del colorante FITC-Dextrano (Figura 4F,G).

Questi risultati sono in linea con il basso numero di microsfere aderite al catetere e il minimo clustering delle microsfere, osservato nel catetere durante l'iniezione della miscela microsfera-Tween. Tuttavia, un gran numero di microsfere si è aggregato negli ultimi 20 μL della miscela microsferica nel catetere, che non dovrebbe essere iniettato per prevenire il possibile infarto (vedi Video Supplementare 4).

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Figura 4: Microscopia a due fotoni in vivo delle microsfere alloggiate. Esempi di immagini fluorescenti in vivo e a due fotoni di microsfere alloggiate nella corteccia del topo. (A) Panoramica fluorescente attraverso la finestra cranica delle microsfere del lodge. (B) Immagine fluorescente del ROI selezionato. (C,D) Immagini microscopiche a due fotoni di microsfere intrappolate nella microcircolazione cerebrale con ROI selezionato per immagini dettagliate. Le immagini Z-stack sono rappresentate in 2D calcolando la deviazione standard delle intensità dei pixel lungo la Z-stack. (E-G) Immagini rappresentative in vivo in microscopia a due fotoni che mostrano tre embolie microvascolari cerebrali. Le frecce rosse evidenziano aree di extravasazione FITC-Dextran, indicando la rottura della BBB e la perdita di colorante. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella supplementare 1: Specifiche del sistema di microscopio a due fotoni. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare 2: Impostazioni del microscopio a due fotoni per FITC-dextrano e imaging microsferico. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare 3: Impostazioni del sistema Criomicrotome per immagini fluorescenti 3D per l'imaging cerebrale del topo con microsfere blu. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare 4: Specifiche del sistema Cryomicrotome per immagini fluorescenti 3D Small per l'imaging cerebrale del topo con microsfere blu. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare 5: Impostazioni del sistema Cryomicrotome per immagini fluorescenti 3D di grandi dimensioni per imaging intero del topo con microsfere rosse. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare 6: Specifiche del sistema Cryomicrotome per immagini fluorescenti 3D di grandi dimensioni per imaging intero del topo con microsfere rosse. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Video supplementare 1: catetere rivestito di BSA al 5% con adesione della microsfera alla parete del catetere e clustering della microsfera nei 25 mg/mL della miscela microsfera FITC-Dextrano durante l'iniezione. Clicca qui per scaricare questo video.

Video supplementare 2: catetere rivestito Tween20 allo 0,1% con una certa adesione microsfera alla parete del catetere ma senza clustering microsfero nel 25 mg/mL di FITC-Dextran con miscela Tween20 allo 0,1% con microsfere durante l'iniezione. Clicca qui per scaricare questo video.

Video supplementare 3: Segmentazione 3D delle occlusioni microvascolari tramite microsfere. Clicca qui per scaricare questo video.

Video supplementare 4: Volume finale dell'iniezione della microsfera con alta concentrazione microsfera in 25 mg/ml di FITC-Dextrano con miscela Tween20 allo 0,1%. Clicca qui per scaricare questo video.

File supplementare 1: Aderenza della microsfera alla validazione delle punte della pipetta. Clicca qui per scaricare questo file.

Fascicolo supplementare 2: Valutazione immunoistochimica della copertura CD45 a 1, 7 e 28 giorni dopo la microembolia confrontando gli emisferi ipsilaterali e controlaterali. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

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Per modellare le embolie microvascolari, è stato descritto un protocollo per iniettare microsfere nella circolazione cerebrale dei topi che consente lo studio della microembolia tramite microscopia a due fotoni in vivo . Questo metodo ha ottimizzato l'intrappolamento delle microsfere nel cervello, con più microsfere intrappolate nei primi 500 μm della corteccia ipsilaterale, consentendo un'efficace imaging a due fotoni.

Un alto conteggio di microsfere nell'area corticale del cervello è cruciale per l'imaging a due fotoni in vivo. La perdita di microsfere è stata minimizzata durante la preparazione della miscela microsfera rivestindo le punte della pipetta con il 5% di BSA o 0,1% Tween20, riducendo l'adesione della microsfera (vedi File Supplementare 1). Sebbene il numero esatto di microsfere aderite non potesse essere quantificato, le misurazioni di intensità media mostrarono l'effetto dei rivestimenti. Inoltre, Tween20 sembrava prevenire il raggruppamento delle microsfere nel catetere, risultando in un numero visivamente maggiore di microsfere singole che scorrono attraverso il catetere, anche se ciò non è quantificato. Ciò riduce il rischio di occlusioni di grandi vasi e la potenziale formazione di grandi regioni ischemiche e ipossiche, cosa indesiderabile dato l'obiettivo di modellare le embolizzazioni microvascolari. Inoltre, i topi hanno mostrato una perdita di peso inferiore e si sono ripresi ai pesi pre-operatori più rapidamente quando sono stati iniettati con una miscela di microsfera contenente basse concentrazioni di Tween20. Tween20 è un dispersante comunementeusato 45,46,47, quindi le basse concentrazioni utilizzate in questo studio non sono destinate a causare tossicità o effetti avversi sull'integrità della BBB. Inoltre, i nostri dati mostrano che la perdita di BBB avviene solo vicino (o dopo il passaggio di) l'alloggiamento della microsfera e non in modo sistematico, senza causare un aumento significativo della copertura totale dei leucociti (vedi Supplementary File 2), supportando l'uso dello 0,1% Tween20. Nel complesso, l'aggiunta di Tween20 contribuisce a ridurre l'aggregazione delle microsfere e a un aumento della consegna delle microsfere alla circolazione cerebrale, confermato dal conteggio delle microsfere nelle fette cerebrali, e porta a un numero sufficiente di microsfere visibili per la microscopia a due fotoni. Sebbene l'uso di Tween20 aumenti il numero di microsfere alloggiate nel cervello, la variabilità nell'iniezione di microsfere rimane. Diversi fattori possono contribuire a questa variazione. Innanzitutto, la formazione di trombo all'interno del catetere o della vascolatura può far aderire le microsfere al coagulo. In secondo luogo, la presenza di bolle d'aria può interferire con un consegna regolare. Infine, un ripristino incompleto del flusso sanguigno nella CCA o ICA può alterare l'emodinamica, potenzialmente favorendo l'adesione della microsfera alla parete del vaso o la formazione di raggruppamenti all'interno del lume. Purtroppo, queste deviazioni non possono essere rilevate durante la procedura di iniezione.

Le microsfere di polistirene sono più dense dell'acqua, portando a una distribuzione disomogenea una volta che la miscela di microsfere viene caricata nel catetere. La maggior parte delle microsfere si deposita vicino alla parete del catetere, dove l'attrito del fluido ne rallenta il movimento rispetto al flusso centrale più veloce. Questo porta infine a un accumulo di microsfere negli ultimi 20 μL del catetere. Va evitata l'iniezione di questa porzione concentrata, poiché potrebbe causare grandi emboli ed eventi ischemici. Per prevenire ciò, il volume della miscela microsfera dovrebbe essere preparato al doppio del volume di iniezione previsto.

La chirurgia per embolia microvascolare richiede una formazione e una precisione sostanziali. Uno dei passaggi tecnicamente più impegnativi consiste nel posizionare una sutura attorno al PPA, all'OA e ai rami laterali dell'ICA per garantire una consegna accurata della miscela di microsfere nel cerchio di Willis e nel territorio MCA. Questo passaggio è complicato dalla vicinanza del nervo vago vicino al CCA, dal diametro ridotto dei vasi e dallo spazio chirurgico limitato, che rendono difficile posizionare le suture senza causare danni ai nervi o lesioni vascolari.

Sebbene una clip per vasi possa essere considerata come alternativa alla legatura temporanea della PPA tramite una sutura, essa introduce rischi aggiuntivi. Le clip possono staccarsi involontariamente, portando alla riapertura del recipiente. Inoltre, utilizzare una seconda clip al PPA insieme a quella esistente sull'ICA aumenta la probabilità di stacco della clip ICA a causa dello spazio limitato. Se ciò accade, causerà un'emorragia significativa e, senza un intervento immediato, può portare a una sospensione anticipata dell'esperimento. Pertanto, non si consiglia la chiusura del PPA con una clip per il recipiente.

L'attuale protocollo impiega un catetere, anziché unasiringa 33, per l'iniezione nella microsfera. Questo approccio offre un migliore controllo sulla velocità e sul volume di iniezione, e consente l'iniezione delle microsfere in modo più remoto (ad esempio, all'interno di una modalità di imaging come un microscopio o uno scanner di risonanza magnetica).

Scegliere l'ECA invece del CCA come punto d'ingresso permette al CCA di rimanere completamente aperto durante la procedura di iniezione, contribuendo a mantenere una perfusione cerebrale più fisiologica durante tutto l'intervento. Inoltre, iniettare le microsfere tramite l'ECA invece che il CCA presenta altrivantaggi 48: i) riduzione del tempo totale di funzionamento durante la riperfusione; ii) riduzione del rischio di sanguinamento durante l'iniezione e dopo il completamento dell'intervento; iii) con il metodo di ingresso della CCA, si forma una stenosi e una trombosi instabili nel CCA dopo la rimozione dell'ago49. Questo provoca disturbi del flusso sanguigno, oltre al rischio di formazione di microtrombomi, che possono finire nel cervello. Inoltre, entrare tramite la CCA comporterebbe un alto rischio di chiudere permanentemente la CCA, il che può portare a una reperfusione cerebrale subottimale durante il periodo di sopravvivenza dopo l'intervento, aggravata dall'elevata variazione del cerchio di Willis neitopi 50,51

Sebbene completamente ottimizzato, il protocollo presenta alcune limitazioni. Innanzitutto, l'osservazione che le microsfere viaggiano più lentamente lungo le pareti del catetere e non sono distribuite uniformemente durante l'iniezione suggerisce che meno microsfere vengano introdotte nell'ICA rispetto alle aspettative. Nonostante l'uso del Tween-20 per ridurre l'aderenza, alcune microsfere si attaccano ancora alle punte della pipetta, al tubo di Eppendorf e al catetere. Di conseguenza, il numero effettivo di microsfere iniettate è probabilmente inferiore al calcolato 7,2 x 104 particelle per topo. Tuttavia, abbastanza microsfere raggiungono la circolazione cerebrale da permettere l'imaging tramite microscopia a due fotoni. Il protocollo di iniezione e la composizione della miscela sono ottimizzati per microsfere di polistirene a 10 μm. Se i materiali utilizzati (punte, tubi, cateteri) o la dimensione delle microsfere vengono modificate, sia la soluzione che la procedura di iniezione dovrebbero essere rivalutate di conseguenza. In secondo luogo, studi che indagano il miglior metodo per l'occlusione di grandi vasi tramite l'occlusione intra-luminale dell'MCA hanno dimostrato che l'ingresso del sistema vascolare tramite legatura permanente dell'ECA provoca ischemia dei muscoli masticatori e della deglutizione52. Questo può portare a una diminuzione dell'apporto alimentare dei topi e, di conseguenza, a una perdita di peso eccessiva, a una funzione motoria compromessa e a un aumento del deficit neurologico. Tuttavia, questa affermazione è stata contraddetta da altri48. In questo studio, il monitoraggio del peso ha mostrato un calo previsto dopo l'intervento chirurgico ma un rapido recupero ai pesi pre-operatori entro alcuni giorni, indicando che i topi si riprendono e mangiano e bevono normalmente dopo la legatura permanente dell'ECA. Sebbene il peso degli animali fosse monitorato, ciò rappresenta solo un indicatore indiretto del benessere dell'animale e non esclude completamente le disabilità funzionali come deficit masticatori o motori locali. Non sono state effettuate valutazioni dirette sul recupero funzionale, il che rappresenta un limite di questo studio. Un altro studio ha confrontato l'ingresso del sistema vascolare tramite CCA o ECA e ha mostrato che l'ingresso tramite il CCA può causare una ritenuta reperfusione della circolazione cerebrale, concludendo che il metodo di ingresso ECA èpreferito 53. In terzo luogo, una corretta e sicura collocazione del catetere senza introdurre bolle d'aria, coaguli di sangue o perdite, e senza ostacolare il flusso nel CCA e ICA, richiede molta pratica. Infine, a differenza di altri metodi di micro-occlusione come la fototrombosi con iniezione di Rose-Bengal22, non si può prevedere dove le microsfere si alloggeranno infine nella circolazione.

Il presente studio deliberatamente non include gruppi di controllo negativi (finti) o positivi (fototrombosi), poiché questi non fornirebbero un valore aggiuntivo per l'obiettivo primario. Il successo di questo modello è definito dal numero di microsfere alloggiate nella microcircolazione cerebrale, in particolare nell'area della finestra cranica, per consentire una microscopia ad alta risoluzione in vivo . Una procedura simulata, per definizione, non producerebbe microsfere nell'area target e quindi non offrirebbe un confronto rilevante per l'endpoint dell'imaging in vivo . Analogamente, l'inclusione di un modello di fototrombosi affronterebbe un meccanismo fisiopatologico fondamentalmente diverso ed è quindi al di fuori dell'ambito di questo lavoro, che si concentra sulla caratterizzazione del modello di embolia microvascolare piuttosto che sul confronto delle metodologie. Non sono state intraprese analisi istologiche più ampie delle embolie e del loro potenziale effetto sulla BBB o sul tessuto neuronale locale, poiché lo studio era progettato per dare priorità alla visualizzazione 3D in vivo rispetto alla validazione a livello tessutale.

Il protocollo chirurgico dettagliato sia per la preparazione della finestra cranica sia per il modello di embolia microvascolare supporta un'indagine affidabile e riproducibile delle alterazioni microvascolari associate all'embolia microvascolare e all'occorrenza di infarti cerebrali silenziosi in tutto l'emisfero ipsilaterale. La preparazione e l'iniezione ottimizzate della miscela microsferica aumentano ulteriormente la consistenza e la validità di questo approccio sperimentale.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non esserci conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Gli autori desiderano esprimere la loro sincera gratitudine al Dr. Iwan Dobbe per aver sviluppato il software Articulus , utilizzato per le ricostruzioni in situ delle immagini 3D. Ringraziamo anche il Prof. Dr. Nikolaus Plesnila per aver gentilmente fornito topi TIE2-GFP (Jackson Laboratory, Stock n. 003658) utilizzati per l'allevamento interno.

Questo studio è stato finanziato da Amsterdam Neuroscience (da 813294 a I.M.), Amsterdam Cardiovascular Sciences (chiamata di attrezzature 2021 e 2023 a I.M.) e dalla Dutch Heart Foundation (03-006-2021-T019 a I.M.).

Questa ricerca è finanziata anche dalla Dutch Heart Foundation e dalla Brain Foundation Paesi Bassi ed è condotta in collaborazione e supportata dalla Dutch CardioVascular Alliance, 01-002-2022-0126 CONTRAST 2.0. Inoltre, questo lavoro fu finanziato in parte da finanziamenti illimitati da Stryker, Medtronic e Penumbra. Le fonti di finanziamento non erano coinvolte nella progettazione degli studi, nel monitoraggio, nella raccolta dati, nelle analisi statistiche, nell'interpretazione dei risultati o nella stesura dei manoscritti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ago calibro 27 (0,1x16 mm)Terumo-Ago calibro 27 (Passo 2.1.2.)
Software Articulus--Software di analisi 3D (Step 4.2.2 & 4.3.3)
Betadina 30 ml (100 mg/ml)Mylan8712207037612Betadina/iodio (Passo 1.1.8. & 2.2.10.)
C& Monomero BSun Medical7111Componente della supercolla (Passo 1.3.1.)
Lame chirurgiche in acciaio al carbonio (n.15)Swann-Morton205Lama per graffiare il cranio (Passo 1.2.4.)
Carprofene (50 mg/ml)Zoetis-Farmaci antidolorifici (passaggi 1.1, 1.6, 2.2 e 2.8)
CatalizzatoreSun Medical7110Componente della supercolla (Passo 1.3.1.)
Catetere (ID 0,31 OD 0,64 mm)Freudenberg228-0661Catetere trasparente (Passo 2.1.1.)
Uncino di tessuto prodotto da Costom--Uncino per tessuti (Passo 2.3.4.)
Punte di cotone--Punta di cotone (Step 1.1.8, 1.2.4 & 1.5.1.)
Vetro di coperturaStrumenti Warner64-0724Vetra della copertura cranica della finestra (Passo 1.4.2.)
Barra di testa del mouse personalizzata--Headbar per il portaoggetti in immagine (Passo 1.3.2.) 
Supporto per immagini mouse personalizzato & nbsp;--Supporto per immagini del mouse (Passo 1.4.1. & 3.1.1.)
Telaio stereotattico su misura--Fotogramma stereotassico (Passo 1.1.7.)
Fluido per cemento dentaleKulzer64707937Componente del cemento dentale (Passo 1.3.3)
Polvere di cemento dentaleKulzer64707945Componente del cemento dentale (Passo 1.3.3)
Trapano dentale Saeshin  L-206Esercizio (Passo 1.4.3.)
Desametasone (4 mg/ml)Centrafarm-Farmaco preoperatorio (Step1.1.4.)
Pinze dissezionaliBraun-AesculapBD023RPinza (Passo 1.2.2. & 2.3.2.)
Punta a mava da perforazione PK/100,5 (0,5mm)Belle Scienze19007-05Punta da trapano (Passo 1.4.3.)
Duratears (3,5 g)Alcon-Pomata per gli occhi (Passo 1.1.8. & 2.2.7.)
Colla epossidica (1g)Pattex9H PSMG3XColla epossidica (Passo 1.5.2. & 2.1.1.)
Pinze micro fine StraightStrumenti scientifici di qualitàDumont #5Pinze micro fine (Passo 2.6.6.)
FITC-Dextrano (70 KDa)Sigma-AldrichFD70SSoluzione FITC-Dextran (Passo 2.5.2.)
Isoflurano (1000 mg/g)Laboratorios Karizoo S.A.118938Anestesia (Passo 1.1.6. & 2.2.5.)
grande criomicrotomo per immagini fluorescenti 3D  Personalizzati-FICS 3D grandi-(Passo 4.3.3)
Lidocaina (100 mg/ml)Aspen-Anestetico locale (Step 1.2.3. & 2.2.10)
Micro forbici Vannas 3-3/8 di polliceBraun-AesculapOC498RMicro forbici (Passo 2.6.2)
Pince per legare microsuture con manico rotondoBraun-AesculapFD280RMicroforecepti (Passo 2.3.3.)
Pinze per legare microsuture con manico rotondo piegatoBraun-AesculapFD281RMicroforecepti piegati (Passo 1.5.1. & 2.3.3.)
Micro clip vascolareBraun-AesculapFD562RClip del recipiente (Passo 2.6.1.)
Microcatetere (ID 0,23114 mm diametro diametrale 0,27432 mm)MicrolumenMicrocatetere (Passo 2.1.1.)
Tappetino riscaldante per mouse e sonda rettaleStoelting53800RBase termica (Passo 1.1.2. & 2.2.2.)
Topolini NG2-DsRedJackson Laboratory, Bar Harbor, USA, Stock n. 008241
Monolaurato di sorbitano di polietilenico glicoleSigma-Aldrich9005-64-5Tween20 (Passo 2.5.2.)
FluorSfere in polistirolo (365/415)InvitrogenF8829Microsfere blu (Passo 2.5.1.)
FluorSfere in polistirolo rosso (580/605)InvitrogenF8834Microsfera rossa (Passo 2.5.1.)
Gabbia di recupero--Gabbia di recupero (Passaggi 1.6.2. & 2.8.2.)
Taglio inverso di ago curvo 3/8 (12mm) con suturaBbraun0762067Sutura (Passo 2.7.5)
Ropivaca & iuml; Ne (2 mg/ml)--Farmaci   (Passo 1.1.5.)
piccolo criomicrotomo per immagini fluorescenti 3D e nbsp;  PersonalizzatiSmall-3D-FIC (Passo 4.2.2)
SpongostanEthiconMS0005Spongostan (Passo 1.4.6)
Microscopio chirurgicoEuromex Microscopen B.V.NZ.1903-BMicroscopio per l'intervento chirurgico (Passo 1.2. 2.1.1.)
Forbici chirurgicheBraun-AesculapBC303RForbici chirurgiche (Passo 1.2.2. & 2.3.2.)
Pompa per siringa (per siringhe da 1 ml)Apparecchiatura di Havard70-2208Pompa di siringa da 1 ml (Passo 2.5.6.)
Filo, 100m,   4/0 1.5   BbraunF11340354/0.15 thread (Passo 2.4.3.)
Mouse TIE2-GFPJackson Laboratory, Bar Harbor, USA, Stock n. 003658
Spolveratore ultra puroThorlabsCA6-EUAria compressa (Passo 1.2.5.)
Polimero Universale TrasparenteSun MedicalT058EComponente della supercolla (Passo 1.3.1.)

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hilkens, N. A., Casolla, B., Leung, T. W., de Leeuw, F. E. Stroke. Lancet. 403 (10446), 2820-2836 (2024).
  2. Bernick, C., et al. Silent MRI infarcts and the risk of future stroke: the cardiovascular health study. Neurology. 57 (7), 1222-1229 (2001).
  3. Saini, M., et al. Silent stroke: not listened to rather than silent. Stroke. 43 (11), 3102-3104 (2012).
  4. Smith, E. E., Schneider, J. A., Wardlaw, J. M., Greenberg, S. M. Cerebral microinfarcts: the invisible lesions. Lancet Neurol. 11 (3), 272-282 (2012).
  5. Adachi, T., Kobayashi, S., Yamaguchi, S. Frequency and pathogenesis of silent subcortical brain infarction in acute first-ever ischemic stroke. Intern Med. 41 (2), 103-108 (2002).
  6. Bokura, H., et al. Silent brain infarction and subcortical white matter lesions increase the risk of stroke and mortality: a prospective cohort study. J Stroke Cerebrovasc Dis. 15 (2), 57-63 (2006).
  7. Vermeer, S. E., et al. Silent brain infarcts and the risk of dementia and cognitive decline. N Engl J Med. 348 (13), 1215-1222 (2003).
  8. Gupta, A., et al. Silent brain infarction and risk of future stroke: a systematic review and meta-analysis. Stroke. 47 (3), 719-725 (2016).
  9. Georgakopoulou, T., van der Wijk, A. E., Bakker, E., van Bavel, E. Quantitative 3D analysis of tissue damage in a rat model of microembolization. J Biomech. 128, 110723(2021).
  10. Martinez Bravo, G., et al. Platelets in thrombosis and atherosclerosis: a double-edged sword. Am J Pathol. 194 (9), 1608-1621 (2024).
  11. Kell, D. B., Lip, G. Y. H., Pretorius, E. Fibrinaloid microclots and atrial fibrillation. Biomedicines. 12 (4), 494(2024).
  12. Hubbard, W. B., Dong, J. F., Cruz, M. A., Rumbaut, R. E. Links between thrombosis and inflammation in traumatic brain injury. Thromb Res. 198, 62-71 (2021).
  13. Dupré, N., Drieu, A., Joutel, A. Pathophysiology of cerebral small vessel disease: a journey through recent discoveries. J Clin Invest. 134 (10), e176987(2024).
  14. Idicula, T. T., Naess, H., Thomassen, L. Microemboli-monitoring during the acute phase of ischemic stroke: is it worth the time. BMC Neurol. 10, 79(2010).
  15. Bai, C. L., et al. A review on micro- and nanoplastics in humans: implication for their translocation of barriers and potential health effects. Chemosphere. 361, 142424(2024).
  16. Guan, Q., et al. The landscape of micron-scale particles including microplastics in human enclosed body fluids. J Hazard Mater. 442, 130138(2023).
  17. Alves, H. C., et al. Thrombus migration paradox in patients with acute ischemic stroke. Stroke. 50 (11), 3156-3163 (2019).
  18. Ragusa, A., et al. Plasticenta: first evidence of microplastics in human placenta. Environ Int. 146, 106274(2021).
  19. Rotchell, J. M., et al. Microplastics in human urine: characterisation using µFTIR and sampling challenges using healthy donors and endometriosis participants. Ecotoxicol Environ Saf. 274, 116208(2024).
  20. Marfella, R., et al. Microplastics and nanoplastics in atheromas and cardiovascular events. N Engl J Med. 390 (10), 900-910 (2024).
  21. Knezic, A., Broughton, B. R. S., Widdop, R. E., McCarthy, C. A. Optimising the photothrombotic model of stroke in the C57Bl/6 and FVB/N strains of mouse. Sci Rep. 12 (1), 7598(2022).
  22. Talley Watts, L., Zheng, W., Garling, R. J., Frohlich, V. C., Lechleiter, J. D. Rose bengal photothrombosis by confocal optical imaging in vivo: a model of single vessel stroke. J Vis Exp. (100), e52794(2015).
  23. Dietrich, W. D., Watson, B. D., Busto, R., Ginsberg, M. D., Bethea, J. R. Photochemically induced cerebral infarction. I. Early microvascular alterations. Acta Neuropathol. 72 (4), 315-325 (1987).
  24. Demura, N., Mizukawa, K., Ogawa, N., Yamashita, K., Kanazawa, I. A cerebral ischemia model produced by injection of microspheres via the external carotid artery in freely moving rats. Neurosci Res. 17 (1), 23-30 (1993).
  25. Takeo, S., et al. Sustained damage to energy metabolism of brain regions after microsphere embolism in rats. Stroke. 23 (1), 62-68 (1992).
  26. Georgakopoulou, T., van der Wijk, A. E., Bakker, E. N. T. P., van Bavel, E. Recovery of hypoxic regions in a rat model of microembolism. J Stroke Cerebrovasc Dis. 30 (6), 105739(2021).
  27. Georgakopoulou, T., van der Wijk, A. E., van Bavel, E., Bakker, E. Perivascular clearance of blood proteins after blood-brain barrier disruption in a rat model of microinfarcts. Microvasc Res. 148, 104515(2023).
  28. Mayzel-Oreg, O., et al. Microsphere-induced embolic stroke: an MRI study. Magn Reson Med. 51 (6), 1232-1238 (2004).
  29. Silasi, G., She, J., Boyd, J. D., Xue, S., Murphy, T. H. A mouse model of small-vessel disease that produces brain-wide-identified microocclusions and regionally selective neuronal injury. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (5), 734-738 (2015).
  30. Shen, Y., et al. Histochemistry of microinfarcts in the mouse brain after injection of fluorescent microspheres into the common carotid artery. Neural Regen Res. 17 (4), 832-837 (2022).
  31. Inoue, K., Asaka, M., Lee, S., Ishikawa, K., Yanagihara, D. Gait disorders induced by photothrombotic cerebellar stroke in mice. Sci Rep. 13 (1), 15805(2023).
  32. Nowak, B., et al. Animal models of focal ischemic stroke: brain size matters. Front Stroke. 2, 15(2023).
  33. van der Wijk, A. E., et al. Microembolus clearance through angiophagy is an auxiliary mechanism preserving tissue perfusion in the rat brain. Acta Neuropathol Commun. 8 (1), 195(2020).
  34. van der Wijk, A. E., et al. Extravasation of biodegradable microspheres in the rat brain. Drug Deliv. 30 (1), 2194579(2023).
  35. van der Wijk, A. E., et al. Extravasation of microspheres in a rat model of silent brain infarcts. Stroke. 50 (6), 1590-1594 (2019).
  36. Rapp, J. H., et al. Cerebral ischemia and infarction from atheroemboli <100 µm in size. Stroke. 34 (8), 1976-1980 (2003).
  37. Lam, C. K., Yoo, T., Hiner, B., Liu, Z., Grutzendler, J. Embolus extravasation is an alternative mechanism for cerebral microvascular recanalization. Nature. 465 (7297), 478-482 (2010).
  38. Grutzendler, J., et al. Angiophagy prevents early embolus washout but recanalizes microvessels through embolus extravasation. Sci Transl Med. 6 (226), 226ra31(2014).
  39. Spaan, J. A. E., et al. Visualisation of intramural coronary vasculature by an imaging cryomicrotome suggests compartmentalisation of myocardial perfusion areas. Med Biol Eng Comput. 43 (4), 431-435 (2005).
  40. Juch, R. N. S., et al. Home-use hyaluronic acid jet injectors: unreliable and unsafe. Dermatol Surg. 50 (1), 62-68 (2024).
  41. Dobbe, J. G. G., Roo, M. G. A. D., Visschers, J. C., Strackee, S. D., Streekstra, G. J. Evaluation of a quantitative method for carpal motion analysis using clinical 3-D and 4-D CT protocols. IEEE Trans Med Imaging. 38 (4), 1048-1057 (2019).
  42. Demkes, E., et al. Human cardiac microtissues display improved engraftment and survival in a porcine model of myocardial infarction. J Cardiovasc Transl Res. 18 (3), 512-528 (2025).
  43. Lei, H. Y., Lee, S. H., Leir, S. H. Antigen-induced anaphylactic death in mice. Int Arch Allergy Immunol. 109 (4), 407-412 (1996).
  44. Wiedmeier, S. E., Chung, H. T., Cho, B. H., Kim, U. H., Daynes, R. A. Murine responses to immunization with pertussis toxin and bovine serum albumin: I. Mortality observed after bovine albumin challenge is due to an anaphylactic reaction. Pediatr Res. 22 (3), 262-267 (1987).
  45. Weiszhár, Z., et al. Complement activation by polyethoxylated pharmaceutical surfactants: Cremophor-EL, Tween-80 and Tween-20. Eur J Pharm Sci. 45 (4), 492-498 (2012).
  46. Castro, C. A., Hogan, J. B., Benson, K. A., Shehata, C. W., Landauer, M. R. Behavioral effects of vehicles: DMSO, ethanol, Tween-20, Tween-80, and Emulphor-620. Pharmacol Biochem Behav. 50 (4), 521-526 (1995).
  47. Kelava, T., Ćavar, I., Čulo, F. Influence of small doses of various drug vehicles on acetaminophen-induced liver injury. Can J Physiol Pharmacol. 88 (10), 960-967 (2010).
  48. Hu, Y., et al. CCA repair or ECA ligation-which middle cerebral artery occlusion is better in the reperfusion mouse model. iBrain. 9 (3), 258-269 (2023).
  49. Dittmar, M. S., et al. The role of ECA transection in the development of masticatory lesions in the MCAO filament model. Exp Neurol. 195 (2), 372-378 (2005).
  50. Zhao, L., Mulligan, M. K., Nowak, T. S. Substrain- and sex-dependent differences in stroke vulnerability in C57BL/6 mice. J Cereb Blood Flow Metab. 39 (3), 426-438 (2019).
  51. Bonnin, P., Mazighi, M., Charriaut-Marlangue, C., Kubis, N. Early collateral recruitment after stroke in infants and adults. Stroke. 50 (9), 2604-2611 (2019).
  52. Dittmar, M., Spruss, T., Schuierer, G., Horn, M. External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2003).
  53. Smith, H. K., Russell, J. M., Granger, D. N., Gavins, F. N. Critical differences between two classical surgical approaches for middle cerebral artery occlusion-induced stroke in mice. J Neurosci Methods. 249, 99-105 (2015).

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