Imaging cardiaco funzionale in embrioni di zebrafish utilizzando microscopia standard e analisi video: applicazioni nella ricerca ambientale e biomedica

Summary

Questo protocollo descrive un metodo di microscopia ottica a basso costo per valutare la morfologia e la funzione cardiaca negli embrioni di zebrafish, consentendo una valutazione riproducibile della cardiotossicità dello sviluppo senza la necessità di sistemi di imaging avanzati.

Abstract

Il pesce zebra (Danio rerio) è ampiamente utilizzato come modello di vertebrato nella ricerca cardiovascolare grazie alla sua somiglianza genetica con l'uomo, alla trasparenza ottica durante lo sviluppo iniziale e all'adattabilità all'imaging in vivo . Questo manoscritto presenta un protocollo standardizzato e accessibile per valutare la morfologia e la funzione cardiaca negli embrioni di zebrafish a 96 ore dopo la fecondazione (hpf) utilizzando la microscopia ottica in campo chiaro. Il metodo include la raccolta degli embrioni, lo screening morfologico, l'immobilizzazione in agarosio, la registrazione video del cuore pulsante e l'analisi basata su immagini di parametri cardiaci come le dimensioni ventricolari, la gittata sistolica, la frequenza cardiaca, la frazione di eiezione e la gittata cardiaca. I calcoli si basano su approssimazioni geometriche del ventricolo utilizzando software open source (ad esempio, ImageJ, Zembryo Analyzer). Il protocollo consente la valutazione quantitativa delle prestazioni cardiache utilizzando apparecchiature ampiamente disponibili, rendendolo adatto a laboratori con risorse limitate e screening ad alto rendimento. In questo studio, sono state analizzate 96 larve di pesce zebra hpf registrando il battito cardiaco al microscopio ottico. I principali parametri cardiaci misurati includevano le dimensioni ventricolari, che sono state utilizzate per calcolare la gittata sistolica e la frequenza cardiaca, determinate dai battiti al minuto. Da questi, sono state derivate la frazione di eiezione e la gittata cardiaca per valutare le prestazioni cardiache complessive. I risultati rappresentativi degli embrioni sani hanno dimostrato una contrazione ventricolare costante e indici funzionali robusti, mentre gli embrioni esposti al cadmio hanno mostrato una morfologia cardiaca compromessa e una gittata cardiaca significativamente ridotta. Nel complesso, il metodo è importante per rilevare la cardiotossicità dello sviluppo e fornisce un approccio riproducibile e non invasivo per valutare la funzione cardiaca in vivo durante lo sviluppo precoce del pesce zebra.

Introduction

Il pesce zebra (Danio rerio) è emerso come un importante organismo modello di vertebrato nella ricerca cardiovascolare grazie alla sua omologia genetica con l'uomo, alla fecondazione esterna, alla trasparenza ottica degli embrioni e al rapido sviluppo ^1,2. Queste caratteristiche, combinate con l'economicità e la scalabilità, rendono il pesce zebra particolarmente adatto per lo studio della morfogenesi cardiaca precoce, dei difetti cardiaci congeniti e della cardiotossicità dello sviluppo³. La loro rilevanza è ulteriormente rafforzata dall'elevata conservazione dei geni e delle vie di segnalazione che regolano lo sviluppo cardiaco nelle specie di vertebrati⁴. In particolare, i modelli di zebrafish hanno contribuito in modo sostanziale alla comprensione delle basi genetiche e fisiologiche della formazione, del rimodellamento e della funzione del cuore sia in condizioni normali che patologiche ^5,6.

Strutturalmente, il cuore del pesce zebra è composto da un unico atrio e da un unico ventricolo, collegati in modo lineare, privi della setto tipica del cuore a quattro camere dei mammiferi. Nonostante ciò, il cuore di zebrafish ricapitola aspetti chiave della fisiologia cardiaca umana, tra cui la presenza di strati endocardici e miocardici, un sistema di conduzione cardiaca, l'attività contrattile ritmica e la regolazione da parte di fattori neuroormonali ^7,8. È importante sottolineare che il cuore del pesce zebra mostra eventi morfogenetici chiave, tra cui l'avvolgimento verso destra del tubo cardiaco e la successiva espansione e delineazione delle camere cardiache, simili a quelle dello sviluppo embrionale umano⁹. Inoltre, il cuore del pesce zebra mantiene molte delle proprietà elettrofisiologiche ed emodinamiche osservate nei vertebrati superiori, tra cui la propagazione del potenziale d'azione, la modulazione della contrattilità e la dinamica del ciclo del calcio⁷.

Date queste somiglianze, il pesce zebra è emerso come un modello cardine in tossicologia, in particolare per valutare come le esposizioni chimiche influenzano lo sviluppo e la funzione del cuore¹⁰. Tuttavia, uno dei principali limiti in questo campo rimane la dipendenza da tecniche di imaging tecnicamente impegnative. I metodi convenzionali ad alta risoluzione, come la microscopia confocale o a foglio di luce, o le linee transgeniche che esprimono marcatori cardiaci fluorescenti, sebbene potenti, sono costosi e richiedono un'infrastruttura tecnica significativa¹¹. Questi vincoli limitano l'implementazione più ampia della fenotipizzazione cardiaca basata sul pesce zebra, in particolare in contesti con risorse limitate o per applicazioni che richiedono uno screening ad alto rendimento¹².

Vi è, quindi, una crescente necessità di approcci metodologici che consentano una valutazione affidabile della funzione cardiaca utilizzando strumentazione ampiamente disponibile. La letteratura esistente contiene esempi di tali metodi semplificati, tra cui l'imaging in campo chiaro o basato sulla microscopia ottica combinato con misurazioni manuali o semi-automatizzate^13,14. Tuttavia, queste tecniche non sono sempre standardizzate e spesso variano tra i gruppi di ricerca in termini di protocollo, tempistica e parametri di analisi delle immagini. Questa variabilità ostacola la riproducibilità e limita il valore comparativo tra gli studi, in particolare in campi come l'embriotossicologia, la farmacologia o l'ecotossicologia, dove gli endpoint cardiovascolari quantitativi sono sempre più utilizzati come indicatori di sicurezza dello sviluppo¹⁵.

In questo contesto, il pesce zebra offre un valido modello per lo screening della cardiotossicità dello sviluppo in vivo. Le agenzie regolatorie e i consorzi scientifici hanno sempre più riconosciuto l'importanza del pesce zebra in questo settore, soprattutto data la loro capacità di rilevare sottili cambiamenti nella funzione cardiaca che possono precedere malformazioni strutturali o letalità¹⁴. L'embrione trasparente consente la visualizzazione diretta del cuore pulsante, consentendo una valutazione in tempo reale delle prestazioni cardiache senza la necessità di procedure invasive. Inoltre, la semplicità dell'anatomia cardiaca del pesce zebra facilita la quantificazione delle dinamiche atriali e ventricolari, comprese le dimensioni della camera e i parametri dell'ictus, utilizzando tecniche di imaging di base¹⁵.

L'obiettivo generale del metodo descritto in questo articolo è quello di fornire un approccio accessibile e riproducibile per la valutazione morfofunzionale delle prestazioni cardiache embrionali di zebrafish utilizzando la microscopia ottica standard. Concentrandosi sulla semplice acquisizione di video e sull'analisi post hoc delle immagini, la tecnica mira a colmare il divario metodologico tra l'imaging ad alta risoluzione e il punteggio osservativo qualitativo. Questo protocollo è adattabile a diversi contesti di laboratorio e livelli di risorse ed è particolarmente applicabile a studi tossicologici, farmacologici o genetici incentrati sulla valutazione della funzione cardiaca.

Oltre ai suoi vantaggi pratici, il protocollo contribuisce al campo offrendo un flusso di lavoro consolidato e passo-passo che combina tecniche di uso comune in un'unica pipeline riproducibile. Sebbene esistano approcci simili in letteratura, pochi forniscono questo livello di integrazione con la documentazione visiva, che può supportare una più ampia adozione e standardizzazione.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono embrioni di zebrafish sono state condotte in conformità con le linee guida istituzionali per la cura e l'uso degli animali approvate dal comitato etico locale. L'allevamento del pesce zebra e la manipolazione degli embrioni sono stati eseguiti in conformità con la Direttiva Europea 2010/63/UE sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici. I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Mantenimento del pesce zebra e raccolta di embrioni

1. Mantenere il pesce zebra adulto (Danio rerio) in un acquario a ricircolo a 28 °C± 1 °C con un ciclo di 14 ore luce/10 ore di buio.
2. Nutrire i pesci tre volte al giorno con un mangime in scaglie o granulare ad alto contenuto proteico adatto al pesce zebra.
3. Nel tardo pomeriggio, trasferire il pesce zebra adulto in vasche di riproduzione dotate di una rete trasparente per separare i pesci dal fondo della vasca. Utilizzare un rapporto maschio-femmina di 2:3, separato durante la notte da un divisorio rimovibile.
4. La mattina seguente, rimuovere il divisore e aggiungere 50-100 ml di acqua fredda dell'acquario per innescare la deposizione delle uova.
5. Dopo la fecondazione (entro 30-60 minuti), rimuovere i pesci adulti dalla vasca di riproduzione per prevenire la predazione degli embrioni.
6. Raccogli gli embrioni utilizzando una pipetta di plastica Pasteur e trasferiscili in piastre di Petri sterili riempite con terreno embrionale E3.
   NOTA: Il terreno embrionale E3 è una soluzione salina tamponata che imita la composizione ionica del liquido extracellulare del pesce zebra. Preparare il terreno E3 sciogliendo 580 mg di NaCl, 27 mg di KCl, 97 mg di CaCl_{2.2H 2}O e 163 mg di MgCl_{2.6H 2}O in circa 800 mL di acqua distillata ultrapura. Regolare il pH a 7,2 utilizzando 1 N NaOH o HCl. Una volta che il pH è regolato e stabile, portare il volume totale a 1.000 ml con acqua distillata. Sterilizzare la soluzione filtrandola attraverso un filtro a membrana da 0,22 μm. Aggiungere 100 μl di blu di metilene all'1% per litro per prevenire la crescita di funghi. Conservare il terreno E3 preparato a 4 °C e scaldarlo a temperatura ambiente prima dell'uso.
7. Incubare gli embrioni a 28,5 °C in un'incubatrice con un ciclo luce/buio controllato (14 h/10 h).
   NOTA: Limitare il numero di embrioni per piastra di Petri (ad esempio, 50 per piastra da 100 mm) per evitare il sovraffollamento, che può causare ipossia e difetti di sviluppo.
8. Sostituire quotidianamente il terreno E3 per mantenere condizioni di sviluppo ottimali.

2. Selezione di embrioni morfologicamente normali

1. A circa 6 ore dalla fecondazione (hpf; tempo trascorso dalla fecondazione), trasferire gli embrioni fecondati in una capsula di Petri pulita contenente terreno E3 fresco.
2. Esamina gli embrioni con uno stereomicroscopio a un ingrandimento di 40x.
3. Scartare tutti gli embrioni che mostrano segni di anomalie dello sviluppo, tra cui:
   1. Embrioni coagulati: si identificano per il loro aspetto opaco o bianco, la consistenza granulare e l'assenza di strutture interne distinguibili. La coagulazione è un segno di non vitalità e si verifica in genere entro le prime ore dopo la fecondazione.
   2. Sviluppo ritardato: escludere gli embrioni che non sono progrediti allo stadio morfologico previsto (ad esempio, mancanza di epibolia o disposizione cellulare irregolare), suggerendo una ridotta vitalità.
   3. Anomalie del sacco vitellino: cerca i sacchi vitellino rotti, irregolari o asimmetrici che possono indicare uno sviluppo difettoso o uno squilibrio osmotico.
   4. Malformazioni esterne: escludere gli embrioni con assi del corpo attorcigliati, distribuzione irregolare della massa cellulare o forme anomale del corion.
   5. Scarsa integrità del corion: astenersi dall'utilizzare gli embrioni con corioni collassati, raggrinziti o rotti, poiché potrebbero essere soggetti a stress meccanico o osmotico.
4. Conservare solo embrioni che soddisfano tutti i seguenti criteri: (1) Forma del corpo trasparente e simmetrica, (2) Progressione epibolica uniforme con stratificazione cellulare liscia, (3) Blastoderma chiaramente visibile e corion sferica intatta.
   NOTA: A 6 hpf, un embrione di pesce zebra morfologicamente normale è a forma di cupola con un blastoderma chiaramente definito che avvolge la parte superiore del tuorlo. Il citoplasma deve essere distribuito uniformemente, senza macchie granulari e senza segni di frammentazione o aggregazione.

3. Imaging cardiaco mediante microscopia ottica

1. A 96 hpf, montare gli embrioni singolarmente in piastre di Petri con fondo di vetro da 35 mm riempite con terreno E3.
2. Preparare l'agarosio a basso punto di fusione all'1,2% in terreno E3 e preriscaldare a 37-38 °C. Mantenere la temperatura utilizzando un blocco termico o un bagnomaria.
3. Incorporare ogni embrione nell'agarosio e orientarlo delicatamente lateralmente utilizzando una pinza sottile prima che l'agarosio si solidifichi.
   NOTA: Assicurarsi che il cuore sia chiaramente visibile e rivolto lateralmente, con l'atrio e il ventricolo sullo stesso piano focale.
4. Utilizza un microscopio a luce invertita dotato di fotocamera digitale per registrare video ad alta risoluzione di 30 secondi incentrati specificamente sulla regione cardiaca degli embrioni di zebrafish. Cattura video con un ingrandimento del 40× o del 100× per garantire una chiara visualizzazione delle strutture cardiache e dei battiti cardiaci.
   1. Registra i video a una frequenza di fotogrammi di 30 fotogrammi al secondo (fps) in formati non compressi o minimamente compressi (ad esempio, AVI o MOV) per preservare la qualità dell'immagine e consentire un'analisi accurata delle dinamiche del movimento cardiaco. Questa configurazione consente una valutazione dettagliata di parametri funzionali come la frequenza cardiaca, il ritmo di contrazione e la morfologia della camera.

4. Analisi delle immagini e misurazione della funzione cardiaca

1. Misurazioni manuali in ImageJ
   1. Importa video. Aprite i video in ImageJ utilizzando File > Importa > AVI. Se necessario, converti il video in una pila di immagini tramite Pile di immagini > > Converti immagini in pila.
   2. Calibrare la scala di misurazione. Utilizzare Analizza > Imposta scala, inserire il diametro del campo noto (ad esempio, 4 mm per un obiettivo da 10×) e abilitare l'opzione Globale per applicare la scala a tutte le misurazioni.
   3. Definisci le regioni di interesse (ROI). Utilizzare gli strumenti ROI (linea, poligono, rettangolo) per contrassegnare gli assi ventricolari lunghi e corti durante la fine della sistole e la fine diastole (Figura 1). Gestisci il ROI tramite gli strumenti di analisi > > ROI Manager.
2. Misura dei diametri e delle aree per il calcolo dei parametri funzionali (File supplementare 1)
   1. Determinare l'area della superficie ventricolare (utilizzando l'approssimazione dell'ellisse) utilizzando l'equazione 1:
      VA = ((D_L - D_S)/2) × π (1)
      Dove DL = diametro lungo, DS = diametro corto.
   2. Stimare il volume ventricolare in PS ed ES utilizzando la formula del volume ellissoidale (Equazione 2)
      VV = (1/6) × π × D_L × D_S² (2)
   3. Calcola la variazione frazionaria dell'area (FAC) e l'accorciamento frazionario (FS) utilizzando l'equazione 3 e l'equazione 4:
      FAC (%) = ((VAD - VAS) / VAD) × 100 (3)
      FS (%) = ((D_L - D_S) / D_L) × 100 (4)
      Dove VAD = area ventricolare al pronto soccorso; VAS = area ventricolare a ES; DDL = asse lungo a ED; DSS = asse corto a ES.
   4. Determinare la gittata sistolica (SV) utilizzando l'equazione 5:
      SV = VVD - VVS (5)
   5. Calcola la frazione di eiezione (EF) utilizzando l'equazione 6:
      EF (%) = (SV / VVD) × 100 (6)
3. Analisi automatizzata in ZembryoAnalyzer
   1. Avvia e carica il video acquisito. Apri ZembryoAnalyzer (disponibile all'indirizzo: https://github.com/darkopuflovic/ZembryoAnalyser) e usa File > Apri video per importare il video desiderato.
   2. Eseguire il rilevamento automatico della regione cardiaca. Fare clic sul pulsante Rileva cuore per consentire al software di individuare automaticamente la regione di interesse (ROI) in base alle fluttuazioni di luminosità tra i fotogrammi video. Se necessario, regola manualmente il ROI utilizzando strumenti rettangolo, ellisse o poligono.
   3. Eseguire la stima automatica della frequenza cardiaca. Lascia che il software analizzi le variazioni di luminosità all'interno del ROI rilevato. La frequenza cardiaca viene calcolata identificando i picchi periodici di intensità. L'algoritmo applica il filtro di soglia per rimuovere il rumore e i falsi positivi, garantendo un rilevamento accurato del battito.
   4. Esportare i risultati. Esporta i dati della frequenza cardiaca e i grafici dell'intensità corrispondenti utilizzando Esporta > PDF o Esporta > Excel. Facoltativamente, salvare i dati non elaborati in formato CSV o JSON per l'elaborazione statistica downstream.
4. Calcolare la gittata cardiaca (CO) utilizzando l'equazione 7:
   CO = SV × HR (7)

5. Valutazione dell'applicabilità del protocollo nei test di cardiotossicità con l'uso di sostanze tossiche

1. Pesare il cloruro di cadmio e preparare una soluzione di lavoro sciogliendola direttamente nel terreno E3 fino a una concentrazione finale di 3 mg/L.
2. Trasferire gli embrioni in piastre di Petri contenenti la soluzione di cadmio a 24 ore dopo la fecondazione (hpf).
3. Incubare gli embrioni nella soluzione di cadmio fino a 96 hpf a 28 °C± 1 °C con un ciclo di 14 ore luce/10 ore buio.
4. Sostituire la soluzione di cadmio ogni giorno per mantenere un'esposizione costante.
5. A 96 hpf, registrare video cardiaci ad alta risoluzione, come descritto in precedenza, degli embrioni per la successiva misurazione e analisi dei parametri della funzione cardiaca.
   NOTA: Utilizzare questo protocollo di esposizione al cadmio per simulare la tossicità cardiaca dello sviluppo negli embrioni di zebrafish, come descritto in uno studio precedente¹⁶.

6. Gestione dei dati e repliche

1. Registra tutte le misurazioni in fogli di calcolo strutturati. Includi l'ID dell'embrione, il gruppo di trattamento e tutti i parametri calcolati.
2. Assicurarsi che almeno 20-30 embrioni per gruppo siano analizzati per l'affidabilità statistica.
   NOTA: Le registrazioni video della regione cardiaca possono essere archiviate e analizzate in un secondo momento senza compromettere l'accuratezza delle misurazioni morfometriche o funzionali. Nei nostri confronti interni, i risultati delle analisi immediate e ritardate erano coerenti tra i principali parametri cardiaci, supportando la riproducibilità della valutazione ritardata basata su video.

Results

Questo protocollo consente l'analisi quantitativa dello sviluppo cardiaco del pesce zebra a 96 ore dopo la fecondazione (hpf), compresi i parametri strutturali e funzionali come le dimensioni del ventricolo, la contrattilità, la gittata sistolica e la frazione di eiezione.

La Figura 2 mostra immagini rappresentative in campo chiaro del ventricolo zebrafish alla fine della diastole (ED) e all'estremità della sistole (ES), insieme a...

Discussion

Uno dei passaggi importanti di questo protocollo è l'identificazione e la selezione accurate di embrioni morfologicamente normali a 6 ore dopo la fecondazione (hpf). Gli embrioni che mostrano segni di coagulazione, ritardo dello sviluppo o anomalie strutturali possono compromettere in modo significativo la coerenza e l'interpretabilità delle misurazioni cardiovascolari. La rimozione precoce di embrioni non vitali o malformati garantisce una base affidabile per valutare lo sviluppo e la f...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,22 & micro; m Filtro a membrana	Millipore	SLGP033RS	0,22 & micro; m Filtro a membrana
Soluzione 1 N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Soluzione di acido cloridrico per la regolazione del pH
Soluzione NaOH a 1 N	Sigma-Aldrich	72068	Soluzione di idrossido di sodio per la regolazione del pH
Pesce zebra adulto (Danio rerio)	Struttura locale di allevamento	N/A	Organismo modello
Vasche di riproduzione con rete	/	/	Separazione degli adulti per la deposizione delle uova
CaCl?· 2H? O	Sigma-Aldrich	C5670	Cloruro di calcio diidrato, grado reagente
Cloruro di cadmio	Sigma-Aldrich	202908	Tossico usato per l'esposizione a 3 mg/L
Alimentazione commerciale per pesci zebra	Mini Gran, Nutri Pet, Gornji Milanovac	/	Mangimi ad alto contenuto proteico o granulari adatti ai pesci zebra
Fotocamera digitale (microscopio)	Hamamatsu Fotonica	ORCA-Flash4.0 V3	Telecamera per la registrazione video a 30 fps
Blocco termico	Eppendorf	5382000010	Dispositivo di riscaldamento a temperatura controllata
ImageJ Software	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/	Software di elaborazione immagini open source
Microscopio a luce invertita	Nikon	Ti2-E	Microscopio con fotocamera digitale, 40 e piccanti volte; e 100 e più volte; Obiettivi
KCl	Sigma-Aldrich	P3911	Cloruro di potassio, grado reagente
Agarosio a basso punto di fusione (1,2%)	Thermo Fisher Scientific	16520050	Per l'incorporazione degli embrioni
Blu di metilene (1%)	Sigma-Aldrich	M9140	Agente antifungino aggiunto al mezzo E3
MgCl?· 6H? O	Sigma-Aldrich	M9272	Cloruro di magnesio esaidrato, grado reagente
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	Cloruro di sodio, grado reagente
Piastre di Petri sterili (100 mm)	Corning	430167	Piastre di Petri in plastica per la coltura embrionale
Piastre di Petri sterili (35 mm)	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	Piastre di Petri a fondo di vetro per montare embrioni
Acqua distillata ultrapura	Millipore	Riferimento Milli-Q	Acqua per la preparazione della soluzione
ZembryoAnalyzer Software	GitHub (Darko Puflovic)	https://github.com/darkopuflovic/ZembryoAnalyser	Software per l'analisi della funzione cardiaca