In vivo Registrazione con patch-clamp a cellula intera dei neuroni peptidergici ipotalamici nelle larve di zebrafish

Sommario

Questo articolo presenta un protocollo per la registrazione in vivo dell'attività elettrica dei neuroni peptidergici ipotalamici utilizzando l'elettrofisiologia del patch-clamp a cellula intera in zebrafish larvale intatto.

Abstract

L'ipotalamo è un'antica regione del cervello che regola diversi aspetti della fisiologia e del comportamento, tra cui il sonno e la veglia, l'appetito, l'omeostasi energetica, l'ansia, la depressione e l'interazione sociale. Specifiche popolazioni neuronali nell'ipotalamo esercitano i loro effetti attraverso il rilascio di neurotrasmettitori e neuropeptidi. La registrazione patch-clamp su cellule intere è un approccio indispensabile per studiare i ruoli di questi fattori nella trasmissione sinaptica e nella funzione cerebrale. Tuttavia, è difficile accedere ai neuroni ipotalamici per le registrazioni elettrofisiologiche nei mammiferi intatti a causa della loro posizione in profondità all'interno del cervello. Di conseguenza, la nostra comprensione delle proprietà intrinseche e delle funzioni fisiologiche dei neuroni ipotalamici è limitata. Il pesce zebra larvale è un utile modello alternativo per studiare i neuroni ipotalamici grazie al suo cervello vertebrato trasparente e piccolo, ma ben conservato. Qui, presentiamo un protocollo per registrazioni in vivo di patch clamp di cellule intere di neuroni ipotalamici in zebrafish larvali intatti. Usando questa tecnica, possiamo registrare dai neuroni peptidergici nell'ipotalamo, esaminare le risposte di questi neuroni agli stimoli sensoriali ed esplorare i loro effetti sui neuroni a valle. Questa tecnica sperimentale fornisce quindi un approccio utile per studiare le funzioni fisiologiche dei neuroni neuropeptidergici ipotalamici in animali intatti.

Introduzione

Come popolare modello animale vertebrato, il pesce zebra (Danio rerio) è ampiamente utilizzato nella ricerca neuroscientifica e presenta diversi vantaggi¹. Il loro complemento di geni e l'architettura cerebrale è altamente conservato nei mammiferi e hanno un ricco repertorio comportamentale, che li rende utili per studiare i meccanismi genetici e neuronali che sono alla base di comportamenti come il sonno, l'ansia, la depressione e l'interazione sociale 2,3,4,5,6 . Le loro dimensioni ridotte e i bassi costi di manutenzione li rendono ideali per lo screening ad alto rendimento di geni o farmaci finalizzati al trattamento di malattie neuropsichiatriche ^7,8. Infine, la trasparenza ottica delle larve di zebrafish, combinata con tecniche avanzate di microscopio a foglio di luce e la disponibilità di più reporter fluorescenti, li rende particolarmente adatti per il monitoraggio dell'attività neuronale e astrogliale a risoluzione cellulare in tutto il cervello ^9,10,11.

L'ipotalamo del pesce zebra, situato in profondità nel diencefalo ventrale, è anatomicamente e molecolarmente conservato con l'ipotalamo dei mammiferi, ma è 2-3 ordini di grandezza più piccolo, fornendo un sistema più semplice per studiare la funzione dell'ipotalamo¹². I neuroni ipotalamici formano estese connessioni sinaptiche con più regioni del cervello, tra cui il talamo, il tronco encefalico, la ghiandola pituitaria e il telencefalo, attraverso i quali regolano l'omeostasi fisiologica, la segnalazione neuroendocrina e i comportamenti autonomici^13,14. Tale modulazione del comportamento e della fisiologia si basa in gran parte sui neuropeptidi, che sono amminoacidi a catena corta che agiscono legandosi ai recettori accoppiati a proteine G (GPCR)¹⁵. A differenza del rilascio di neurotrasmettitori di aminoacidi ad azione rapida nella sinapsi, i neuropeptidi possono diffondersi su distanze maggiori attraverso la trasmissione di volume e mediare lenti effetti modulatori sulla trasmissione sinaptica e sull'eccitabilità neuronale¹⁶.

Recenti studi sul pesce zebra hanno rivelato diverse funzioni dei neuropeptidi ipotalamici attraverso approcci multidisciplinari come l'imaging del calcio dell'intero cervello, il sequenziamento dell'RNA a singola cellula, l'analisi comportamentale ad alto rendimento e la mappatura dei circuiti neuronali 4,12,17,18. Queste tecniche emergenti hanno trasformato la nostra capacità di caratterizzare la diversità cellulare su larga scala, collegare i meccanismi molecolari con le funzioni dei neuropeptidi a livello di circuito e mappare i circuiti neurali che sono alla base di comportamenti specifici^19,20. Tuttavia, questi approcci rimangono limitati nella loro capacità di risolvere le rapide dinamiche fisiologiche e i precisi meccanismi sinaptici che sono alla base della funzione dei neuropeptidi.

La tecnica del patch-clamp, sviluppata da Neher e Sakmann, rimane il gold standard per lo studio della fisiologia neuronale grazie alla sua impareggiabile risoluzione temporale e precisione biofisica, che consente la misurazione diretta delle fluttuazioni del potenziale di membrana, delle correnti sinaptiche e della dinamica dei canali ionici^21,22. Questa tecnica è particolarmente preziosa per lo studio delle cellule neuropeptidergiche, i cui caratteristici pattern di scoppio e le influenze neuromodulatorie richiedono una misurazione elettrofisiologica diretta per comprendere appieno il loro ruolo nel comportamento e nell'omeostasi 15,16,23.

Qui, abbiamo sviluppato un protocollo ottimizzato che consente registrazioni affidabili di patch-clamp a cellule intere di neuroni peptidergici ipotalamici larvali di zebrafish, nonostante le sfide tecniche poste dalla posizione anatomica profonda di questi neuroni. Questa metodologia fornisce un accesso diretto all'attività elettrica di queste cellule, consentendo un'indagine dettagliata delle loro risposte agli stimoli visivi e uditivi (Figura 1). Integrando l'elettrofisiologia patch-clamp con l'optogenetica, possiamo caratterizzare con precisione la connettività funzionale tra i circuiti ipotalamici e i neuroni a valle (Figura 2 e Figura 3), facilitando lo studio dei neuropeptidi nell'omeostasi fisiologica e nel controllo comportamentale. Questo approccio colma una lacuna critica nella ricerca neuroscientifica, consentendo l'esplorazione meccanicistica della funzione dei neuroni ipotalamici a livello biofisico, cellulare e circuitale simultaneo.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dall'Institutional Care and Use Committee (IACUC) dell'Università di Shanghai (protocollo animale YS 2025-169) e dall'IACUC del California Institute of Technology (protocollo animale 1836). I pesci zebra da 5 a 7 giorni dopo la fecondazione (dpf) sono stati nutriti con rotiferi e utilizzati per esperimenti. In questa fase dello sviluppo, il sesso non è determinato. Per la riproduzione sono stati utilizzati pesci zebra adulti su uno sfondo di madreperla [mitfa(w2/w2)]²⁴ .

1. Soluzioni e ricette

1. Preparare un terreno E3 contenente 5 mM di NaCl, 0,17 mM di KCl, 0,33 mM di CaCl₂ e 0,33 mM di MgSO₄. Regolare la soluzione con NaOH a pH 7,2. Conservare a temperatura ambiente per l'uso entro 1 mese.
2. Preparare la soluzione extracellulare contenente 134 mM di NaCl, 2,9 mM di KCl, 2,1 mM di CaCl₂, 1,2 mM di MgCl₂, 10 mM di HEPES e 10 mM di glucosio. L'osmolalità della soluzione extracellulare è ~290 mOsmol ^L-1. Regolare la soluzione con NaOH a pH 7,8. Conservare a 4 °C per l'uso entro 1 mese.
3. Preparare la soluzione intracellulare contenente 100 mM di K-gluconato, 10 mM di KCl, 2 mM di CaCl₂, 2 mM di Mg-ATP, 0,3 mM di Na-GFP, 10 mM di HEPES e 10 mM di EGTA. L'osmolalità della soluzione intracellulare è ~280 mOsmol ^L-1. Regolare la soluzione di KOH a pH 7,4. Aliquotare 100 μl della soluzione interna in provette per microfuge e conservare a -20 °C per l'uso entro 1 anno.
   NOTA: L'aggiunta di Mg-ATP e Na-GTP è consigliata per registrazioni prolungate e stabili. La soluzione intracellulare deve essere filtrata attraverso una membrana da 0,22 μm, che rimuove il particolato e i contaminanti microbici che potrebbero compromettere la formazione della tenuta o portare all'intasamento delle pipette.
4. α-bungarotossina: Sciogliere 1 mg di α-bungarotossina in 1 mL di terreno E3 fino a una concentrazione finale di 1 mg/mL. Aliquotare 20 μl della soluzione in provette per microfughe e conservare a -20 °C per l'uso entro 1 anno.
5. Agarosio a basso punto di fusione: Sciogliere 0,75 g di agarosio in 50 mL di terreno E3 in un flacone di vetro fino a una concentrazione finale dell'1,5%. Scaldare il composto in forno a microonde fino a quando l'agarosio non si sarà sciolto e la soluzione apparirà limpida ed omogenea. Mantenere l'agarosio fuso a 42-45 °C a bagnomaria per utilizzarlo entro 1 mese.

2. Preparazione e dissezione del pesce zebra

1. Mettere un singolo maschio e femmina di pesce adulto contenenti un transgene desiderato, ad esempio il pesce Tg(hcrt:RFP) ²⁵, in una vasca di accoppiamento e separarli con un divisore trasparente durante la notte. La mattina del secondo giorno, rimuovere il divisorio per consentire ai pesci di riprodursi. Raccogli gli embrioni fecondati sul fondo della vasca e riporta i pesci adulti nelle loro vasche di casa entro il primo pomeriggio.
2. Allevare gli embrioni in una capsula di Petri di 9 cm di diametro con terreno E3 di cui blu di metilene allo 0,0005%. Mettere gli embrioni in un'incubatrice a 28,5 °C con cicli luce/buio 14:10 h. Cambia la soluzione E3 ogni giorno.
   NOTA: Il blu di metilene nel terreno E3 viene utilizzato per prevenire la crescita fungina fino a 3 giorni dopo la fecondazione (dpf), ma viene sostituito con il terreno E3 da solo a 3 dpf, poiché il blu di metilene può influenzare il metabolismo cellulare e la funzione mitocondriale nelle fasi successive dello sviluppo²⁶.
3. Screening dei pesci larvali con uno stereomicroscopio a epifluorescenza con ingrandimento massimo (~115x) a partire da circa 3 dpf. Metti i singoli pesci in goccioline d'acqua (più grandi delle loro dimensioni corporee) per facilitare la cernita. Per i pesci di età superiore a 3 dpf, anestetizzare il pesce utilizzando 3 ml di terreno E3 contenente lo 0,01% di tricaina per sopprimere l'attività locomotoria spontanea. Raccogli le larve con un'espressione brillante del fluoroforo nell'ipotalamo.
   NOTA: Indossare guanti in nitrile, occhiali di sicurezza e un camice da laboratorio quando si maneggia la tricaina. La tricaina in eccesso deve essere smaltita come rifiuto chimico secondo i protocolli per gli animali.
4. Dopo lo screening, lavare immediatamente la tricaina con il terreno E3 e rimettere queste larve nell'incubatrice. Aggiungere ~5 mL di soluzione di alimentazione contenente rotiferi nella piastra di Petri a partire da 5 dpf fino al giorno degli esperimenti. Cambiare la soluzione E3 e nutrire i pesci con rotiferi ogni giorno.
5. A 5-7 dpf, raccogli i pesci larvali che sembrano sani e mostrano una locomozione attiva. Trasferitele in una piccola capsula di Petri (3,5 cm di diametro) utilizzando una pipetta di vetro.
6. Rimuovere l'acqua intorno al pesce e aggiungere 20 μL di 1 mg/mL di α-bungarotossina sul pesce per ~30 s. Quindi lavare via il farmaco aggiungendo ~3 ml di terreno E3 nella piastra di Petri.
   NOTA: Indossare guanti in nitrile, occhiali di sicurezza e un camice da laboratorio quando si maneggia la α-bungarotossina. L'eccesso di α-bungarotossina deve essere smaltito come rifiuto chimico secondo i protocolli sugli animali.
7. Coprite la capsula di Petri con un foglio di alluminio per mantenere il pesce al buio e paralizzarlo gradualmente.
   NOTA: La α-bungarotossina è un bloccante del recettore dell'acetilcolina che agisce specificamente sulla giunzione neuromuscolare, paralizzando così il pesce senza influenzare il sistema nervoso. I pesci possono ancora percepire gli stimoli ambientali e la funzione cerebrale è normale, dopo la paralisi ^9,27.
8. Verificare la presenza di paralisi dopo ~15 minuti utilizzando uno stereomicroscopio e selezionare un pesce paralizzato che mostri un battito cardiaco normale e una robusta circolazione sanguigna nel cervello e nel corpo.
9. Trasferisci il pesce in una camera di registrazione su misura, che è una capsula di Petri da 35 mm con un foro di 10 mm di diametro al centro e un vetrino di vetro da 20 x 20 mm incollato sul fondo per coprire il foro. Rimuovi l'acqua e aggiungi ~200 μL di agarosio a basso punto di fusione all'1,5%.
10. Posizionare il pesce con la parte dorsale rivolta verso l'alto nell'agarosio usando una pinza (Dumont #5). Quando l'agarosio si è completamente solidificato, aggiungere la soluzione extracellulare per coprire l'agarosio. Ci vogliono 5-10 minuti perché l'agarosio si solidifichi completamente.
11. Tagliate e rimuovete l'agarosio sopra la testa del pesce usando un micro coltello. Quindi praticare una piccola incisione nella pelle sopra il ventricolo cerebrale tra il tettone ottico e il cervelletto utilizzando una micropipetta di vetro con apertura della punta di ~ 1 μm per l'avanzamento della pipetta nel passaggio successivo del cervello.
12. Rimuovere i detriti di tessuto o i coaguli di sangue attorno al foro di dissezione utilizzando una pipetta di vetro rotta.

3 Registrazione patch-clamp a cellula intera

1. Preparare micropipette di registrazione con apertura del puntale di ~1 μm e resistenza di ~20 MΩ utilizzando capillari borosilicati il giorno dell'esperimento. Conservare le micropipette estratte in un contenitore e utilizzarle lo stesso giorno per evitare contaminazioni.
2. Accendere il computer, la telecamera CCD, il monitor, l'amplificatore, il digitalizzatore, il micromanipolatore e il software associato. L'amplificatore e il digitalizzatore devono essere accesi prima di aprire il software.
3. Spostare con cautela il pesce su un rig elettrofisiologico dove verrà eseguito l'esperimento del patch clamp.
4. Perfondere il pesce con una soluzione extracellulare ossigenata a ~2 ml al minuto utilizzando una pompa peristaltica per mantenere la salute del pesce e la vitalità cellulare.
5. Spostare la camera di registrazione utilizzando un traslatore X-Y (su misura) per centrare il pesce nel campo visivo di un obiettivo 4x sotto un microscopio verticale.
6. Passa a un obiettivo 60x e sposta il traslatore per visualizzare la regione dell'ipotalamo bersaglio. Regola il contrasto di interferenza differenziale (DIC) di Nomarski con luce infrarossa a 900 nm per ottenere la migliore visualizzazione delle celle.
7. Accendi la sorgente luminosa di eccitazione della fluorescenza (ad esempio, la lampadina al mercurio) e usala per visualizzare i neuroni fluorescenti nell'ipotalamo. Individua i neuroni sani che mostrano una fluorescenza brillante e confini cellulari chiari, che spesso indicano una buona salute cellulare e facilitano registrazioni elettrofisiologiche di alta qualità.
8. Riempire lentamente una micropipetta di registrazione con una soluzione intracellulare utilizzando una punta a microloader sottile.
9. Fissare l'elettrodo all'headstage dell'amplificatore e serrare la manopola per evitare perdite d'aria. Applicare una leggera pressione positiva (~150-200 mBar) all'interno della micropipetta attraverso il tubo collegato al supporto, impedendo ai contaminanti all'interfaccia aria-soluzione di entrare nella punta dell'elettrodo.
10. Abbassare la micropipetta nella soluzione del bagno utilizzando un micromanipolatore in modalità veloce e posizionare la punta della micropipetta sopra il foro sezionato sotto l'obiettivo 4x.
11. Cambia il micromanipolatore in modalità lenta e cambia l'obiettivo in quello 60x. Far avanzare lentamente la punta della pipetta di vetro attraverso il foro di dissezione e lungo il ventricolo tra i due emisferi tectali.
12. Portare la punta della pipetta ortogonalmente verso una cellula fluorescente target visualizzata utilizzando sia la CID che la fluorescenza. Una volta che la punta della pipetta tocca la membrana cellulare, si forma una piccola rientranza.
    NOTA: Per visualizzare i tessuti profondi come l'ipotalamo, viene utilizzato un IR-DIC da 900 nm insieme a filtri polarizzatori e analizzatori finemente regolati per IR-DIC.
13. Il rilascio rapido della pressione positiva quando il puntale tocca una cellula consente alla cellula di formare una tenuta con la pipetta. Contemporaneamente, applicare una breve pressione negativa attraverso il tubo collegato al supporto.
    NOTA: Il valore della resistenza sul software dovrebbe aumentare rapidamente fino a > 1 GΩ, indicando che si è formata una tenuta ad alta resistenza. Quando la cellula ipotalamica fluorescente viene registrata con successo, dovrebbe esserci una membrana cellulare fluorescente all'interno della punta della micropipetta di registrazione.
14. Bloccare la cella a -60 mV e attendere 1-2 minuti fino a quando la linea di base e la resistenza di accesso sono stabili. Applicare un breve impulso elettrico o un'aspirazione delicata per bocca per rompere la membrana cellulare sotto la punta della micropipetta.
15. Compensa la corrente capacitiva e la resistenza in serie in una configurazione software elettrofisiologica. Scartare i dati se la resistenza in serie è maggiore di 100 MΩ e varia > 20% nelle registrazioni.
16. Applicare un impulso di tensione di 1 s -10 mV in modalità tensione per monitorare la resistenza intrinseca della membrana prima e dopo gli esperimenti. Scartare la cella se la resistenza o il potenziale di membrana variano molto.
17. Prima registrazione in modalità voltage-clamp (VC) quando la cella viene mantenuta a un valore negativo. Dopo aver stabilito una registrazione stabile, passare alla modalità current-clamp (IC), se necessario.
    NOTA: Il giga-seal potrebbe non essere stabile poco dopo la rottura, quindi il bloccaggio della cella a -60 mV in modalità VC per alcuni minuti all'inizio di un esperimento può fornire migliori condizioni cellulari.
18. Elabora l'analisi dei dati elettrofisiologici e il rilevamento dei picchi offline utilizzando MATLAB al termine dell'esperimento.
19. Dopo gli esperimenti, sopprimere le larve di pesce utilizzando ipoclorito di sodio (NaClO) all'1,5% e smaltirle secondo i protocolli istituzionali di cura degli animali.

Risultati

In questo manoscritto, presentiamo una tecnica di registrazione patch-clamp in vivo migliorata per lo studio dei neuroni ipotalamici in zebrafish intatti, con particolare attenzione ai neuroni dell'ipocretina (Hcrt).

Come presentato nella Figura 1, la nostra metodologia consente registrazioni elettrofisiologiche dirette da questi neuroni in profondità all'interno del cervello in un animale intatto (Figura 1A), superando i lim...

Discussione

Il protocollo qui descritto consente registrazioni patch-clamp di neuroni peptidergici nell'ipotalamo larvale del pesce zebra, una delle regioni cerebrali più profonde e tecnicamente più difficili da accedere. A causa della difficoltà intrinseca di questa preparazione, le registrazioni di patch clamp di successo richiedono un'attenzione meticolosa ad alcuni parametri critici, vale a dire la qualità delle pipette, la tecnica di approccio, la purezza della soluzione e la salute dei tessuti...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Amplificatore	Assone	700B
Capillari in vetro borosilicato	Sutter	BF100-58-10
Telecamera CCD	Dage-MTI	IR-1000
Computer per registrazioni elettrofisiologiche	Valletta	Precisione 3660
Digidata	Assone	1440A
Gabbia di Faraday	Personalizzato
Forcipe	F.S.T.	Dumont #5
Incubatrice	Lonroy	GZP-150B
Filtro a membrana	Millipore Sigma	SLGV004SL
Micro coltello	F.S.T.	10318-14
Obiettivo	Olimpo	Mplan 5X/0.1; UMPlanFI/IR 60X/0.9w
Pompa peristaltica	Maggiore	BT100-1L
Porta pipette	Narishige	H-7	per dissezione
Estrattore	Strumento Sutter	P-97
Stereomicroscopio per screening e dissezione fluorescente	Olimpo	SZX16
Stimolatore	A.M.P.I	Maestro8
Micromanipolatore tridimensionale	Strumento Sutter	Pannello MPC-325
Microscopio DIC a infrarossi verticale	Olimpo	BX51WI
Tavolo antivibrante	Catalogo TMC	61-541-06
Monitor video	SUNSPO	SP-717
Bagnomaria	Yiheng	HWS-12
Traduttore X-Y	Personalizzato