Il protocollo descrive la procedura operativa standard per testare materiali potenzialmente biodegradabili, sia sintetici che naturali, in condizioni aerobiche utilizzando un inoculo naturale di acqua di mare e un sistema automatizzato di respirometria a circuito chiuso.
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Articolo metodologico
Test di biodegradazione aerobica dei materiali utilizzando un inoculo naturale di acqua marina marina e un respirometro a circuito chiuso
In questo articolo
Sommario
Abstract
La corretta valutazione dei materiali biodegradabili dipende dall'ampia adozione di metodi di prova standard. Sebbene esistano tali metodi, la capacità di test rimane limitata, limitata dai costi e dai tempi di avvio per creare nuovi laboratori. Questo protocollo di screening modificato si basa sul metodo di prova standard ASTM International D6691-24a per la determinazione della biodegradazione aerobica di materiali plastici nell'ambiente marino da parte di un consorzio microbico definito o di un inoculo naturale dell'acqua di mare. Valuta la biodegradazione dei materiali in un ambiente marino, confrontando i risultati con i controlli positivi e negativi, e utilizza un inoculo naturale di acqua di mare integrato con ammonio e fosfato per prevenire la limitazione dei nutrienti. I materiali vengono esposti a quest'acqua di mare arricchita di sostanze nutritive e incubati a 30 °C. Un respirometro Micro-Oxymax misura la produzione di biogas (anidride carbonica, CO2 2) nel tempo. Il grado di mineralizzazione (biodegradazione) è determinato calcolando la proporzione di carbonio derivato dal materiale convertito in biogas-carbonio. La percentuale di produzione di CO2 , espressa come frazione del contenuto di carbonio misurato o teorico, è riportata in funzione del tempo. Il sistema di respirometria a circuito chiuso ospita una serie di recipienti del reattore, preparati in triplice copia per ciascun materiale, un controllo negativo (solo inoculo di acqua di mare) e un controllo positivo (cellulosa cromatografica su strato sottile). Questo metodo è importante per valutare i materiali nell'ambiente marino e affronta la prevenzione dell'inquinamento globale.
Introduzione
I rifiuti di plastica rappresentano una minaccia per gli ecosistemi marini e la salute umana1. La crescente preoccupazione per l'inquinamento da plastica, insieme ai detriti marini di qualsiasi materiale presente nell'oceano, sottolinea la necessità di soluzioni sostenibili, come una migliore gestione dei rifiuti a fine vita e materiali biodegradabili che si biodegradano facilmente nell'ambiente marino. A differenza delle plastiche sintetiche tradizionali, che persistono da decenni a secoli e generano microplastiche che si accumulano nelle reti alimentari 2,3,4, i materiali biodegradabili, componenti organici del carbonio, possono essere metabolizzati in CO 2 e metano (CH4) o assimilati nella biomassa microbica5. Comprendere la biodegradazione dei materiali nell'acqua di mare è quindi fondamentale per quantificare e mitigare gli impatti ambientali dei rifiuti marini.
La biodegradazione nell'ambiente marino è controllata dall'interazione di variabili spazio-temporali, tra cui la luce e la disponibilità di nutrienti, la pressione, la temperatura, la composizione delle specie microbiche e la natura fisico-chimica e la struttura del polimero, che determinano il tasso, il grado e il meccanismo di degradazione6. Queste variabili rappresentano una sfida significativa per gli studi di biodegradazione in laboratorio che simulano gli ambienti marini. Questa procedura operativa standard (SOP) utilizza l'acqua di mare naturale come inoculo, catturando la comunità microbica in situ presente e registra variabili rilevanti tra cui i nutrienti disciolti nell'acqua di mare, il particolato di carbonio e azoto, la clorofilla, la salinità, il pH e la temperatura. Questo approccio controllato basato su laboratori ottimizza le condizioni per promuovere la mineralizzazione e consente misurazioni dirette della biodegradazione che non sono fattibili in situ. L'ASTM International D6691-24a, Metodo di prova standard per la determinazione della biodegradazione aerobica di materiali plastici nell'ambiente marino da parte di un consorzio microbico definito o di un inoculo naturale di acqua di mare (di seguito ASTM D6691), e questa SOP sono stati sviluppati come strumento di screening rapido e affidabile per valutare la biodegradabilità dei materiali 7,8,9,10.
In linea con ASTM D6691, un test di screening per la biodegradabilità intrinseca dei polimeri, questo protocollo valuta la biodegradazione dei materiali in condizioni ottimali, 30 °C, la superficie massima del campione macinato e l'eccesso di nutrienti inorganici (azoto, 130 mg/L; fosforo, 23 mg/L)9, per promuovere la mineralizzazione e prevenire le limitazioni dei nutrienti. Mentre i test di screening offrono preziose informazioni iniziali, potrebbero essere necessari ulteriori test, come gli ormeggi costieri e in acque profonde, che misurano la perdita di peso in funzione del tempo, per una valutazione completa in condizioni marine naturali. Poiché questi test di ormeggio costiero e in acque profonde stimano la biodegradazione in base alla perdita di peso in funzione del tempo10,11, i ricercatori dovrebbero prima eseguire questo test di screening, che misura direttamente il metabolismo microbico, prima di passare a un esperimento di ormeggio costiero e in acque profonde in situ, che è anche più costoso.
Il metodo di prova standard ASTM D6691 delinea le procedure per valutare la biodegradazione aerobica di materiali plastici non galleggianti in ambienti marini. Questo standard, insieme agli standard di specificazione, come ASTM D7081 (Standard Specification for Non-Floating Biodegradable Plastics in the Marine Environment; focusing on biodegradability in an acquoous medium, attualmente ritirato da ASTM e in fase di rivalutazione), fornisce un quadro per la certificazione dei polimeri sperimentali come biodegradabili marini 9,12. In generale, una specifica è uno standard di consenso di ASTM International che stabilisce i requisiti che un materiale, un prodotto o un sistema deve soddisfare. Garantisce che i materiali progettati per biodegradarsi in ambienti marini lo facciano entro tempi accettabili e non rilascino additivi potenzialmente tossici, come coloranti o plastificanti.
Basandosi su ASTM D6691, questo protocollo quantifica il tasso e il grado di biodegradazione aerobica dei materiali (substrato sperimentale) nell'acqua di mare naturale e amplia i controlli positivi dei materiali (ad esempio, cellulosa, carta Kraft, chitina/chitosano), storicamente dimostrati biodegradabili nell'ambiente marino 7,9,10. L'obiettivo di questo metodo è quello di vagliare i materiali in condizioni ottimizzate per vedere se i materiali si biodegradano nell'ambiente marino. L'inoculo sfrutta la comunità microbica naturale presente nell'acqua di mare, raccolta seguendo specifiche linee guida delineate nell'ASTM. Queste linee guida sottolineano l'utilizzo di acqua di mare con una salinità di circa 32, raccolta da un luogo privo di sostanze inquinanti come acque reflue, scarichi chimici o fuoriuscite di petrolio. Il test utilizza un respirometro automatizzato a circuito chiuso con recipienti del reattore da 250 mL mantenuti a 30 °C, ciascuno contenente 75 mL di acqua di mare e ~20 mg del substrato sperimentale o di controllo8. La mineralizzazione (biodegradazione) è espressa come la percentuale di biogas netto di carbonio (CO2-C) prodotto rispetto alla massa di carbonio iniziale aggiunta. Questo metodo non tiene conto dell'assimilazione del carbonio nella biomassa microbica.
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Protocollo
1. Raccolta e caratterizzazione dell'acqua marina
- Identificare un sito di raccolta dell'acqua di mare non interessato da acque reflue, sostanze chimiche, chiazze di petrolio o forte influenza dell'acqua dolce.
- Presso il sito di raccolta, registrare la fonte (posizione, latitudine e longitudine, profondità di raccolta, profondità totale e temperatura), la data di raccolta del campione e le condizioni dell'acqua osservate.
- Raccogli e combina campioni di acqua di mare da diverse profondità, posizioni dei siti ed eventi di campionamento per promuovere una composizione diversificata della comunità microbica.
- In una damigiana lisciviata acida da 20 L, raccogliere da 10 L a 20 L di acqua di mare utilizzando una grande bottiglia Niskin e riportarla in laboratorio.
- Dalla damigiana, trasferire 1 litro di sottocampione di acqua di mare intera in un flacone di polietilene ambrato ad alta densità (HDPE) da 1 litro lisciviato con acido per l'analisi di laboratorio del particolato, del carbonio e dell'azoto per le condizioni iniziali dell'acqua di mare. Dal campione da 1 L, filtrare (0,2 μm; acetato di cellulosa a basso contenuto di azoto) e raccogliere un sottocampione da 60 mL in un flacone di polietilene lisciviato con acido per l'analisi dei costituenti inorganici e organici disciolti di azoto (N) e fosforo (P).
- Etichettare i sottocampioni con il nome del progetto, l'ID del campione e la data. Misurare le concentrazioni di NH4+ utilizzando il metodo dell'indofenolo (4500-NH3)13,14 e i livelli di PO43- utilizzando il metodo della soluzione singola (4500-P E)13,15. Quantificare il particolato, l'azoto e il carbonio utilizzando il metodo di analisi elementare16. Misurare le concentrazioni di clorofilla-a seguendo i protocolli delineati da Parsons et al.17(10150 A, 10150 C)13.
NOTA: Le analisi della qualità dell'acqua relative ai nutrienti sono facoltative. Questo protocollo presuppone che le analisi siano condotte da un laboratorio esterno. - Coprire leggermente l'apertura della damigiana per mantenere le condizioni aerobiche e conservare l'acqua di mare a 30 °C al buio per un massimo di 7 giorni.
NOTA: L'acqua di mare può anche essere aerata utilizzando una pompa dell'aria e un sistema di gorgogliamento.
2. Preparazione del substrato sperimentale
- Aggiungere 10-15 g di substrato sperimentale (ad es. polisaccaridi naturali, legno, fibra di legno, polimeri) che può essere sotto forma di pellet, frammenti e pezzi formati in una giara di macinazione in acciaio inossidabile da 50 ml con una sfera in acciaio da 20 mm. Fresare il substrato sperimentale fino a ottenere una granulometria uniforme (0,10-0,25 mm) prima dell'inizio del test.
- Immergere il barattolo di macinazione nell'azoto liquido e infragilire per 15 minuti fino a quando l'azoto liquido smette di bollire.
ATTENZIONE: L'azoto liquido è un liquido criogenico che può causare ustioni, lesioni o congelamento. Leggere e seguire tutte le schede di sicurezza prima dell'uso. Indossare adeguati dispositivi di protezione individuale. - Fissare la giara di macinazione nell'accessorio del mulino a sfere e impostare i parametri dello strumento su 30 Hz e 2:30 min, quindi premere Start. Ripetere 4 volte con 30 s di raffreddamento in azoto liquido tra una prova e l'altra. Se il materiale è un polimero con una bassa temperatura di transizione vetrosa, eseguire cicli di fresatura aggiuntivi se necessario per produrre una distribuzione granulometrica uniforme.
- Verificare l'uniformità dimensionale e caratterizzare la distribuzione granulometrica mediante analisi al setaccio come descritto in ASTM D1921-9618. Assemblare setacci standard che coprono l'intervallo di dimensioni delle particelle previsto, con la dimensione della maglia più piccola sul fondo. Posizionare il campione fresato sul setaccio superiore e fissare la pila di setacci in un agitatore meccanico. Agitare fino a quando le particelle non passano attraverso la rete. Raccogliere e pesare il materiale trattenuto da ciascun setaccio per calcolare la distribuzione granulometrica. Utilizzare lo stesso set di setacci per tutti i trattamenti per mantenere la comparabilità. Registrare la distribuzione sulla scheda tecnica.
- Determinare il contenuto di carbonio per sottocampione in peso secco del substrato sperimentale fresato mediante analisi elementare16.
NOTA: Questo protocollo presuppone che l'analisi elementare sia condotta da un laboratorio esterno.
3. Preparazione dei nutrienti aggiuntivi per l'acqua di mare
- Riempire a metà un matraccio tarato da 2 L o 4 L con acqua di mare. Il volume totale necessario dipende dal numero di recipienti del reattore da utilizzare nell'esperimento. Ogni recipiente del reattore conterrà 75 ml di acqua di mare. Se la fonte di acqua di mare contiene alte concentrazioni di particolato organico, setacciare l'acqua di mare attraverso una maglia da 20 μm per eliminare la contaminazione eterogenea da particelle di grandi dimensioni.
- Utilizzando una bilancia di precisione con sensibilità fino a 0,001 g, tarare un piatto di pesata e pesare 0,5 g/L di cloruro di ammonio (NH4Cl) e quindi 0,1 g/L di fosfato di potassio monobasico (KH2PO4) sulla base di 2 L o 4 L di acqua di mare.
ATTENZIONE: Il cloruro di ammonio può causare danni o irritazioni agli occhi. Leggere e seguire tutte le schede di sicurezza prima dell'uso e indossare dispositivi di protezione individuale adeguati.
NOTA: Smaltire i rifiuti monobasici di cloruro di ammonio e fosfato di potassio in appositi contenitori per rifiuti pericolosi secondo le procedure istituzionali e le normative locali. Piccoli volumi di soluzioni diluite (<1%) di NH4Cl e KH2PO4 possono essere idonei per lo smaltimento degli scarichi dopo la diluizione con abbondante acqua, se consentito dall'istituto e dall'autorità locale per le acque reflue. - Aggiungere i nutrienti inorganici al matraccio tarato da 2 L o 4 L, portare a volume con acqua di mare, aggiungere una barretta di agitazione e mescolare su una piastra di agitazione fino a quando tutti i sali si sono sciolti. La soluzione deve essere limpida e priva di particelle visibili.
- Sottocampione 20-30 mL di acqua di mare integrata con nutrienti per la misurazione del pH e della salinità. Filtrare altri 60 mL attraverso un filtro in acetato di cellulosa a basso contenuto di azoto da 0,2 μm in un flacone di polietilene lisciviato con acido per l'analisi di N e P inorganici disciolti seguendo i metodi standard al punto 1.5.
- Misurare il pH e la salinità su un misuratore da banco seguendo le istruzioni del produttore. Si prevede una diminuzione del pH di circa un'unità per l'acqua di mare a piena forza a causa dell'acidità dell'integratore nutritivo.
4. Preparazione per l'incubazione del recipiente del reattore
- Lisciviare con acido tutta la vetreria, compresi i recipienti del reattore da 250 mL per i campioni e la pipetta volumetrica da 75 mL in acido cloridrico (HCl) al 10% per 24 ore e risciacquare 3 volte con acqua deionizzata.
ATTENZIONE: L'HCl può causare gravi ustioni e danni agli occhi. Leggere e seguire tutte le schede di sicurezza prima dell'uso. Indossare adeguati dispositivi di protezione individuale.
NOTA: Il 10% di rifiuti di HCl può essere neutralizzato con bicarbonato di sodio per formare una soluzione neutra prima dello smaltimento. Eseguire la neutralizzazione in conformità con le procedure istituzionali sui rifiuti pericolosi e le normative locali applicabili. - Autoclavare i recipienti vuoti del reattore da 250 mL lisciviati con acido, i coperchi con porte, gli O-ring di tenuta in silicone e i tappi a vite in un'autoclave a 121 °C per 15 minuti prima del giorno dell'esperimento.
- Etichettare le fiale del campione con il numero/ID del canale corrispondente ai recipienti che ricevono il campione o i materiali di controllo.
- Utilizzando la bilancia analitica, tarare una fiala (con tappo) e pesare 20 mg (± 0,1 mg) di test sperimentale o di controllo, registrare il peso completo della lettura e mettere da parte. Ripetere per tutte le repliche sperimentali e di controllo.
NOTA: Assicurati che i pesi siano accurati. Si consiglia di pesare tutti i substrati lo stesso giorno e dalla stessa persona. - Accendere l'incubatrice il giorno prima di aggiungere i recipienti e impostare la temperatura a 30 °C. Accendere il respirometro almeno 2 ore prima di eseguire la diagnostica del sistema e la calibrazione del sensore in base alle istruzioni del produttore.
NOTA: La preparazione del recipiente del reattore può procedere una volta che la temperatura dell'incubatore raggiunge e mantiene i 30 ± 2 °C. - Preparare la scheda tecnica registrando gli ID/repliche dei campioni e il numero di canale corrispondente. Organizzare i recipienti del reattore e i gruppi di tappi (coperchio con porte/O-ring) in ordine di numero di canale/ID (assicurarsi che ogni recipiente sia chiaramente etichettato). Controllare gli O-ring e i coperchi/porte per assicurarsi che siano puliti, asciutti e intatti.
5. Impostazione dei recipienti del reattore
- Utilizzare una pipetta volumetrica da 75 mL lisciviata con acido e un pipettatore motorizzato per erogare 75 mL di acqua di mare integrata con nutrienti in ciascun recipiente del reattore.
- Rimuovere una pipetta monouso di acqua di mare (~3 ml) da ciascun recipiente e appoggiarla su una superficie pulita accanto ad essa. Quest'acqua di mare sarà utilizzata per sciacquare i substrati sperimentali e di controllo macinati dalla fiala tarata (Figura 1).
- Trasferire i substrati in recipienti appropriati.
- Posizionare un O-ring sul bordo del recipiente del reattore, quindi posizionare un coperchio a due porte direttamente sopra l'O-ring. Fissare l'O-ring e il coperchio in posizione con un tappo a vite.
- Abbinare il contenitore del reattore alle linee di gas/condensazione corrispondenti. Inserire saldamente le tubazioni del gas nelle apposite porte di ingresso/uscita del coperchio del serbatoio.
- Accendere la piattaforma dell'agitatore a 0,05 x g (modalità continua). Eseguire un controllo visivo per assicurarsi che tutti i recipienti siano saldi, quindi chiudere lo sportello dell'incubatrice.
- Registra la temperatura dell'incubatore (lettura e sonda a termistore) e la pressione atmosferica utilizzando un barometro.
Figura 1: Impostazione e preparazione del recipiente. (A) Aggiunta di acqua di mare, (B) aggiunta del campione e (C) aggiunta dell'O-ring, del coperchio metallico e del tappo a vite. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
6. Avvio del sistema di respirometria
- Avvia il software sul computer collegato. Verificare che il sistema rilevi l'hardware tramite la connessione RS-232. Se l'hardware non viene trovato, una notifica indicherà che il dispositivo non è connesso e il programma deve essere riavviato.
- Nel menu principale del software, selezionare Strumenti > Diagnostica > Operazioni di base. Fare clic su Salva file di registro. Fare clic su valvole e sensori. Il software indicherà PASS o FAIL per ogni test. Procedere alla calibrazione a due punti del sensore di CO2 solo se entrambi i test vengono superati.
7. Calibrazione del sensore di CO2
- Collegare una colonna di calce sodata alla porta dell'azoto sul pannello posteriore della pompa del campione per rimuovere la CO2 ambientale per la calibrazione zero. Assicurati che la calce sodata appaia bianca gessosa e non scolorita (ad esempio, rosa o viola).
- Selezionare Strumenti > Calibrazione. Fare clic su Avvia calibrazione nell'angolo in basso a destra. Quando richiesto, regolare il flusso di campione a 0,5 L/min utilizzando il controllo della pompa di campionamento sul pannello frontale. Fare clic su OK.
- Quando il timer raggiunge lo zero, premere i pulsanti di offset Su e Giù sul sensore di CO2 per regolare la lettura sullo schermo su 0.000 (o il più vicino possibile). I valori diventeranno verdi quando rientrano nell'intervallo accettabile. Fare clic su Avanti gas.
- Quando richiesto, collegare la bombola del gas di calibrazione alla porta di calibrazione sul pannello posteriore della pompa di campionamento. Regolare la pressione di uscita del gas di calibrazione su 5 PSIG. Assicurarsi che il gas in eccesso scorra attraverso il raccordo a T in modo che l'utente possa sentire e sentire il gas vicino al raccordo, prima di fare clic su OK.
- Quando il timer raggiunge lo zero, premere i pulsanti Su e Giù sul sensore di CO2 per regolare la lettura sullo schermo a 2.700 (o il più vicino possibile). I valori diventeranno verdi quando rientrano nell'intervallo accettabile. Fare clic su Next Gas per completare la calibrazione.
NOTA: Le concentrazioni di gas di span sono determinate dalla miscela di gas standard primaria certificata, come documentato nel certificato di analisi del fornitore.
8. Configurazione dell'esperimento nel software
- Seleziona Esperimento > Configurazione. Immettere i numeri dei canali iniziale e finale dai menu a discesa in base ai canali occupati.
- Impostare Soglia di aggiornamento (%) su 0,50, Intervallo di aggiornamento su N.A. e Finestra di aggiornamento (sec) su Auto.
- In Configurazione varie, selezionare la casella Sensori di spurgo; assicurarsi che la misurazione automatica del volume, il consumo positivo di O2 e l'opzione Abilita modalità flusso aperto non siano selezionati.
- Impostare l'intervallo di campionamento (ore) su 8.00 e la durata dell'esperimento (ore) su N.A. Impostare le unità di gas e tempo secondo necessità.
- Se si utilizza la sonda di temperatura primaria per la correzione della temperatura di incubazione, assicurarsi che l'opzione Inserimento manuale delle temperature della camera non sia selezionata. Seleziona la casella per la modalità di sfiato e assicurati che la modalità di scarico non sia selezionata.
- Assicurarsi che la modalità di sfiato anaerobico non sia selezionata.
- Selezionare Impostazione camera. Inserisci etichette di canale descrittive (ad es. NegCtrl_1, PosCtrl_2, Test_PHA_3).
- Fare clic su Utilità. Fare clic su Celle nella colonna EN solo per i canali occupati. Fare clic su Limitazione. Il software indicherà PASS o FAIL per ogni canale. Procedere solo se tutti i test di restrizione vengono superati.
- Fare clic su Volume per misurare i volumi dello spazio di testa.
NOTA: Il volume dello spazio di testa è uguale al volume dell'aria all'interno del recipiente del reattore del campione e del tubo a circuito chiuso. Verificare che i volumi siano ragionevoli per le dimensioni del recipiente e la lunghezza del tubo. - Fare clic su Perdita. Il software indicherà PASS o FAIL per ciascun canale in base al volume dello spazio di testa. Se si verifica un errore in un canale, eseguire la procedura seguente.
- Assicurarsi che l'O-ring sia pulito e privo di particelle e fibre e posizionato correttamente tra il bordo del recipiente e il coperchio metallico.
- Serrare il tappo a vite. Controllare il collegamento e i tubi alle porte IN/OUT e ai raccordi. Tagliare le estremità dei tubi usurate o deformate con una lama affilata per garantire un taglio netto e dritto.
- Se il canale continua a guastarsi, sostituire l'O-ring con uno nuovo compatibile specificato dal produttore.
- Fare clic su Volume per rimisurare i volumi dello spazio di testa. Fare clic su Esci. Assicurarsi che la colonna Volume della scheda Impostazione camera sia popolata per tutti i canali occupati.
- Nel menu principale, selezionare Strumenti > menu Servizio. Verificare che la sonda di temperatura primaria, che misura la temperatura dell'incubatore, sia a 30 °C ± 2 °C e stabile.
- Fare clic su Esegui. Salvare il file utilizzando un nome descrittivo che includa la data (ad esempio, 030325PositiveControlValidation). Registrare il nome del file sul foglio dati.
- Seleziona Esperimento > Visualizza > grafici per visualizzare i grafici in tempo reale. La produzione di biogas appare come tassi di produzione positivi di CO2 . I controlli negativi possono oscillare intorno allo zero; Tuttavia, il loro tasso medio dovrebbe essere zero o positivo.
- Se il sistema include essiccatori d'aria a condensazione, mantenere un registro giornaliero della condensa visibile nei tubi. Agitare delicatamente il tubo per interrompere le ostruzioni e consentire il drenaggio, se necessario.
- Aggiornare i file di dati (file di testo ASCII) al termine di ogni intervallo di campionamento. I dati, tra cui temperatura, % di gas (composizione del gas), velocità e accumulo, possono essere scaricati in vari altri pacchetti software durante l'esperimento o alla fine.
- Per aprire .dat file in un foglio di calcolo, avvia Excel e seleziona Apri > file. Passare alla cartella contenente il file .dat. Nel menu a discesa del tipo di file, selezionare Tutti i file e scegliere il file desiderato.
- Quando richiesto dall'Importazione guidata testo, selezionare Delimitato come tipo di file e fare clic su Avanti.
- In Delimitatori, seleziona la casella Virgola. Assicurarsi che non siano selezionati altri delimitatori. La finestra di anteprima dovrebbe visualizzare i dati separati in colonne. Fare clic su Fine per caricare i dati nel foglio di calcolo.
- Salva il file in formato .xlsx o .csv per ulteriori analisi e archiviazione.
- Analizzare periodicamente i dati per assicurarsi che le repliche del trattamento siano coerenti. L'errore standard delle repliche di trattamento deve essere inferiore al 5% della produzione cumulativa media di CO2 . Ripetere i test che non superano questa soglia.
- Fare clic su Interrompi al termine dell'incubazione.
- Le incubazioni possono durare da 10 a 90 giorni. Se i materiali in esame sono altamente biodegradabili, terminare l'incubazione quando la produzione cumulativa di CO2 si stabilizza o prolungarla se non si osserva alcuna degradazione dopo 90 giorni.
- Concludere gli esperimenti quando non si osserva alcuna produzione netta di gas per almeno 5 giorni sia nei recipienti di controllo che in quelli di prova. Per produzione netta non si intende una variazione inferiore all'1% della percentuale di biodegradazione nell'arco di 5 giorni.
- Spegni il sistema o preparati per il prossimo esperimento.
9. Scomporre l'esperimento
- Registrare la temperatura dell'incubatore (sonda a termistore e lettura dell'incubatore). Scollegare il tubo dai recipienti del reattore dal respirometro e pesare ciascun recipiente del reattore campione utilizzando una bilancia di precisione. Registrare i pesi per determinare se si è verificata una perdita di peso/acqua durante il periodo di incubazione.
- Sottocampionare 20-30 mL di acqua di mare da ciascun recipiente del reattore per misurare il pH e la salinità e confrontare questi valori con quelli registrati nella fase 3.4 per verificare la stabilità durante l'incubazione. Filtrare altri 60 mL attraverso un filtro in acetato di cellulosa a basso contenuto di azoto da 0,2 μm in un flacone di polietilene lisciviato con acido per l'analisi di N e P inorganici disciolti seguendo i metodi standard del passaggio 1.5.
NOTA: I campioni di acqua di mare residua possono essere filtrati per rimuovere la plastica rimanente, diluiti per ridurre le concentrazioni di nutrienti e smaltiti mediante scarico in conformità con le normative istituzionali e locali. - Sciacquare recipienti, O-ring, coperchi metallici e tappi a vite con acqua di rubinetto. Immergere la vetreria in un bagno acido HCl al 10% per almeno 24 ore. Autoclave e conservare coperti in un foglio di alluminio per la successiva incubazione
10. Calcolo della percentuale di biodegradazione
- Calcolare il carbonio totale nel substrato sperimentale/di controllo come segue:
dove % C (contenuto di carbonio) è determinato attraverso l'analisi elementare.
NOTA: Il carbonio totale nei substrati sperimentali e di controllo può subire le seguenti trasformazioni biochimiche durante l'incubazione aerobica:
C + O2 → CO2
Ogni mmolo (12 mg) di carbonio organico proveniente dal substrato sperimentale/di controllo può essere convertito in 1 mmol di CO2 gassosa. Un mmole di gas prodotto occupa 22,4 mL a temperatura e pressione standard (STP). - Calcolare la percentuale di biodegradazione come segue:
dove Cg = quantità di carbonio gassoso prodotto dal substrato sperimentale/di controllo e controllo negativo (solo inoculo di acqua di mare), mmoles, e Ci = quantità di carbonio nel substrato sperimentale aggiunto, mmoles. - Calcolare l'errore standard, se, della percentuale di biodegradazione come segue:
dove n1 e n2 = numero di recipienti del substrato sperimentale/di controllo replicati e dei reattori di controllo negativo, rispettivamente, e s = deviazione standard del carbonio gassoso totale prodotto. - Calcolare i limiti di confidenza al 95% (CL) come segue:
dove t = valore di distribuzione t per probabilità del 95% con (n1 + n2 − 2) gradi di libertà, quindi n = 3 + 3 − 2 = 4.
11. Fine del protocollo
- Dopo aver completato i calcoli e l'analisi dei dati, è possibile inserire i risultati nel report finale o inserirli in un database condiviso in conformità con i piani di gestione dei dati del progetto o dell'istituto. Assicurarsi che tutti i materiali siano smaltiti secondo le linee guida istituzionali sui rifiuti pericolosi e che tutte le attrezzature siano pulite e conservate.
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Risultati
Vengono presentati i risultati dei test di biodegradazione marina. La biodegradazione è stata valutata per ciascun campione misurando la proporzione di carbonio convertito in anidride carbonica. I grafici di biodegradazione cumulativa, di velocità e percentuale mostrano tipicamente una fase di ritardo, seguita da una fase di crescita e infine da un plateau. La tempistica e l'entità di queste fasi dipendono dal materiale del campione, dalle condizioni sperimentali e dalla composizione del...
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Discussione
Le prestazioni del controllo positivo determinano la validità del test. È richiesta una biodegradazione minima del 70% di un substrato di controllo positivo facilmente biodegradabile in mare (ad esempio, cellulosa di grado analitico, carta Kraft, ecc.), in base alla sua resa massima teorica di gas. Questo benchmark verifica le condizioni favorevoli e una sufficiente attività microbica nell'acqua di mare naturale durante l'incubazione. Il mancato raggiungimento di questa soglia indica un ...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Columbus Instruments e il Biodegradability Laboratory presso la School for Marine Science and Technology dell'Università del Massachusetts Dartmouth per il supporto tecnico e l'accesso alle strutture. Il finanziamento per il sistema di respirometria Micro-Oxymax di Columbus Instruments e l'avvio del laboratorio sono stati forniti da PrimaLoft e dal Massachusetts Technology Collaborative.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0.2 & micro; M, filtro in acetato di cellulosa da 47 mm | Geofiltro Geotecnico | 83100056 | Filtrare l'acqua di mare |
| Pipetta volumetrica da 100 mL | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand | 13-650-2U | Classe A; Acido lisciviato e sciacquato con acqua deionizzata |
| Becher in vetro da 100-600 mL | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand | 50-194-5690 | Classe A; Acido lisciviato e sciacquato con acqua deionizzata |
| Sfere da fresatura da 20 mm | Retsch | 53680062 | Acciaio inox. Utilizzato con barattolo di macinazione per la macinazione criogenica del polimero |
| Barattoli da macinazione da 50 mL | Retsch | 14620216 | Acciaio inox. Utilizzato con sfere di fresatura Mixer Mill 400 e 20 mm per la macinazione criogenica del polimero |
| Pipetta volumetrica da 75 mL | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand | 13-650-2T | Classe A; Acido lisciviato e sciacquato con acqua deionizzata |
| Pompa d'aria e sistema di bolle | Tetra | 77846 | Aerare l'acqua di mare durante l'equilibrio pre-incubazione |
| Carta stagnola | Fisherbrand | 01-213-100 | Copritura per autoclaving e conservazione pulita |
| Cloruro di ammonio (NH4Cl) | Thermo Fisher Scientific, Fisher Chemical | A661-500 | Picco di nutrienti dell'acqua di mare |
| Bilanciamento analitico | Mettler | AT201 | Pesare i substrati sperimentali e di controllo |
| Autoclave | Tuttnauer | MFI-TTN-3870EA | Per sterilizzare recipienti e coperchi |
| Base Micro-Oxymax 120VAC Single Channel | Columbus Instruments | 0135-8000 | Utilizzato per immagazzinare controlli positivi e polimeri |
| Gas di calibrazione | Airgas | X03NI92P3000001 | miscele gassoase standard primarie; 2,7% anidride carbonica, 4,5% metano, bilanciamento azoto |
| Computer Monitor | Dell | 210-BMKK | Monitor hub USB-C Dell Pro 24 Plus. Utilizzato con computer per eseguire il software Micro-Oxymax |
| Guanti criogenici | Thermo Fisher Scientific, Tempshield, Cryo Gloves | 11-394-306 | Utilizzato per gestire l'azoto liquido |
| Termometro a quadrante | Thermo Fisher Scientific, H-B Instrument Durac | 13-201-433 | Termometro calibrato per la temperatura dell'acqua di mare al momento della raccolta |
| Pipette usa e getta | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand | 13-711-7M | Risciacquare i lati del recipiente per liberare il materiale |
| Involucro ENC52 a controllo di temperatura e luce | Columbus Instruments | 4740-4054 | Mantenere condizioni di temperatura e luce |
| Pinze per fiaschette | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand | S07387 | Usata per maneggiare barattoli di macinazione in azoto liquido |
| Fiaschede, 250 mL | DWK Scienze della Vita | 14395-250 | Vasi campione dei reattori |
| Fiale in vetro con chiusura in stile plug | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-339-26D | Memorizzazione dei campioni |
| Profondimetro portatile H22PX | West Marine, Norcross Marine | 6849368 | Determinare la profondità del sito di raccolta dell'acqua di mare |
| GPS portatile 73 | Garmin | 10-01504-00 | Utilizzato per determinare la posizione del sito di raccolta dell'acqua di mare |
| Padella HDPE | Thermo Scientific, Nalgene | 13-359-26 | Usato per usare acidi in vetro & nbsp; in soluzione al 10% di HCl |
| Acido cloridrico (soluzione acquosa acida) | Thermo Fisher Scientific, Fisher Chemical | A144-212 | ACS Plus certificato, 36,5-38,0%. Controllo sensori CO2 e vetri con liscivia acida |
| Cappa a flusso laminare | Scienza dell'Aria | FLOW-48-A | Minimizzare i contaminanti aerotrasportati durante la preparazione del campione |
| Niskin grande; Solo bottiglia Beta Plus - 8,2L orizzontale, PVC | La scienza prima | 3-1980-H65 | Per la raccolta dell'acqua di mare dal molo o dalla barca |
| Padella per azoto liquido | Thermo Fisher Scientific, Bel Art Magic Touch 2 | 11-999-063 | Trattenere azoto liquido |
| Recipiente di trasferimento di azoto liquido, 10 L | Thermo Scientific | TY509X2 | Conservare e dispensare azoto liquido per la criomillazione |
| Azoto liquido, grado industriale, 22 PSI | Airgas | NI 180LT22 | Usata per fragilizzare e macinare polimeri |
| Setacciatore meccanico | Humbolt, Grainger | 5DPL6 | Analisi del crivello per la distribuzione delle dimensioni delle particelle |
| Micro-Oxymax | Columbus Instrumentts | 7395-113-D64 | O-ring sigillato in silicone, porta metallica con 3 raccordi e tappo a vite GL45 e nbsp; |
| Interfaccia di espansione Micro-Oxymax a 10 canali | Columbus Instruments | 0135-8101 | Componente del Sistema di Respirometria |
| Micro-Oxymax Respirometro (sensore CO2) | Columbus Instruments | 0135-8403 | Infrarosso non dispersivo |
| Mulino miscelatore 400 | Retsch | 207450001 | Mulino miscelatore 400. Utilizzato per la macinazione criogenica di polimeri |
| Regolatore motorizzato per pipette | Eppendorf | 4430000018 | Trasferire acqua di mare ai recipienti del reattore campione |
| Bottiglia a bocca stretta in ambra HDPE Quality Lab, 1 L | Thermo Scientific, Nalgene | 02-923-5 | Campione discreto di acqua di mare intera |
| Nylon Mesh 20 Micron | ELKO Filtering Co. | 41718 | Usata per setacciare acqua di mare grezza per rimuovere particelle eterogenee più grandi |
| Shaker Orbitale Aperto | Thermo Fisher Scientific | SK4000 | Mantenere il movimento orbitale dei vasi del reattore durante l'incubazione |
| OptiPlex 5090 Computer a piccolo fattore di forma | Dell | C0SL03 | Computer Desktom usato per eseguire il software Micro-Oxymax |
| Misuratore pH/Cond | Mettler Toledo, SevenExcellence S470-Basic | 30046252 | Misuratore di pH/conducibilità da banco per misurare l'inoculo iniziale e finale dell'acqua di mare |
| Bottiglia di polietilene, 60 mL | Qorpak | PLC-03564 | Campione discreto di acqua di mare filtrata |
| Fosfato di potassio monobasico (KH2(PO4)) | Thermo Fisher Scientific, Fisher BioReagents | BP362-500 | Picco di nutrienti dell'acqua di mare |
| Bilanciamento di precisione | Sartorius | Practum2102-1S | Pesare il tare e il peso totale dei recipienti |
| Carboy rotondo, 20 L | Thermo Fisher Scientific | 02961A | Lisciviata con acido per l'immagazzinamento dell'acqua di mare |
| Occhiali di sicurezza | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand | 19-181-513 | |
| Scoopula | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand, Scoopula | 01-257-567 | Scoopula da laboratorio in acciaio inossidabile |
| Crivelli | Advantech, Grainger | 40PR18-40PR55 | Setacci in acciaio inossidabile. Il numero e le dimensioni dei setacci dipendono dal materiale da testare. |
| Cellulosa Sigmacell, Tipo 101 | Sigma-Aldrich | 435236-250G | Polvere, substrato di controllo positivo |
| Bicarbonato di sodio | Thermo Fisher Scientific, Fisher Chemical | S233-500 | Controllo sensori CO2 |
| Solfito di sodio, anidro, 98% | Thermo Fisher Scientific, Thermo Scientific Chemicals | AAA1793336 | Controllo sensori CO2 |
| Sonda termometrica/termistore | Fisherbrand | 15-079-700 | Verifica la temperatura dell'incubatrice |
| Barometro a Manopola di Precisione Tracciabile | Fisherbrand | 14-648-51 | Registrare la pressione atmosferica all'inizio dell'esperimento |
| Regolatore a due stadi di idrogeno Victor di media funzione, metano a due stadi, CGA - 350 | AirGas | VIC0781-3559 | Regolatore di gas di calibrazione & nbsp; |
| Fiaschette volumetriche, 2 L | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand | FB4002000 | Classe A; acido lisciviato e risciacquato con acqua deionizzata. Usata per preparare acqua di mare ricca di nutrienti. |
| Padella di pesatura | Thermo Fisher Scientific | 02-202-101 | Polietilene |
Riferimenti
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