Test di biodegradazione aerobica dei materiali utilizzando un inoculo naturale di acqua marina marina e un respirometro a circuito chiuso

Sommario

Il protocollo descrive la procedura operativa standard per testare materiali potenzialmente biodegradabili, sia sintetici che naturali, in condizioni aerobiche utilizzando un inoculo naturale di acqua di mare e un sistema automatizzato di respirometria a circuito chiuso.

Abstract

La corretta valutazione dei materiali biodegradabili dipende dall'ampia adozione di metodi di prova standard. Sebbene esistano tali metodi, la capacità di test rimane limitata, limitata dai costi e dai tempi di avvio per creare nuovi laboratori. Questo protocollo di screening modificato si basa sul metodo di prova standard ASTM International D6691-24a per la determinazione della biodegradazione aerobica di materiali plastici nell'ambiente marino da parte di un consorzio microbico definito o di un inoculo naturale dell'acqua di mare. Valuta la biodegradazione dei materiali in un ambiente marino, confrontando i risultati con i controlli positivi e negativi, e utilizza un inoculo naturale di acqua di mare integrato con ammonio e fosfato per prevenire la limitazione dei nutrienti. I materiali vengono esposti a quest'acqua di mare arricchita di sostanze nutritive e incubati a 30 °C. Un respirometro Micro-Oxymax misura la produzione di biogas (anidride carbonica, CO_{2 2}) nel tempo. Il grado di mineralizzazione (biodegradazione) è determinato calcolando la proporzione di carbonio derivato dal materiale convertito in biogas-carbonio. La percentuale di produzione di CO₂ , espressa come frazione del contenuto di carbonio misurato o teorico, è riportata in funzione del tempo. Il sistema di respirometria a circuito chiuso ospita una serie di recipienti del reattore, preparati in triplice copia per ciascun materiale, un controllo negativo (solo inoculo di acqua di mare) e un controllo positivo (cellulosa cromatografica su strato sottile). Questo metodo è importante per valutare i materiali nell'ambiente marino e affronta la prevenzione dell'inquinamento globale.

Introduzione

I rifiuti di plastica rappresentano una minaccia per gli ecosistemi marini e la salute umana¹. La crescente preoccupazione per l'inquinamento da plastica, insieme ai detriti marini di qualsiasi materiale presente nell'oceano, sottolinea la necessità di soluzioni sostenibili, come una migliore gestione dei rifiuti a fine vita e materiali biodegradabili che si biodegradano facilmente nell'ambiente marino. A differenza delle plastiche sintetiche tradizionali, che persistono da decenni a secoli e generano microplastiche che si accumulano nelle reti alimentari ^2,3,4, i materiali biodegradabili, componenti organici del carbonio, possono essere metabolizzati in CO 2 e metano (CH₄) o assimilati nella biomassa microbica⁵. Comprendere la biodegradazione dei materiali nell'acqua di mare è quindi fondamentale per quantificare e mitigare gli impatti ambientali dei rifiuti marini.

La biodegradazione nell'ambiente marino è controllata dall'interazione di variabili spazio-temporali, tra cui la luce e la disponibilità di nutrienti, la pressione, la temperatura, la composizione delle specie microbiche e la natura fisico-chimica e la struttura del polimero, che determinano il tasso, il grado e il meccanismo di degradazione⁶. Queste variabili rappresentano una sfida significativa per gli studi di biodegradazione in laboratorio che simulano gli ambienti marini. Questa procedura operativa standard (SOP) utilizza l'acqua di mare naturale come inoculo, catturando la comunità microbica in situ presente e registra variabili rilevanti tra cui i nutrienti disciolti nell'acqua di mare, il particolato di carbonio e azoto, la clorofilla, la salinità, il pH e la temperatura. Questo approccio controllato basato su laboratori ottimizza le condizioni per promuovere la mineralizzazione e consente misurazioni dirette della biodegradazione che non sono fattibili in situ. L'ASTM International D6691-24a, Metodo di prova standard per la determinazione della biodegradazione aerobica di materiali plastici nell'ambiente marino da parte di un consorzio microbico definito o di un inoculo naturale di acqua di mare (di seguito ASTM D6691), e questa SOP sono stati sviluppati come strumento di screening rapido e affidabile per valutare la biodegradabilità dei materiali 7,8,9,10.

In linea con ASTM D6691, un test di screening per la biodegradabilità intrinseca dei polimeri, questo protocollo valuta la biodegradazione dei materiali in condizioni ottimali, 30 °C, la superficie massima del campione macinato e l'eccesso di nutrienti inorganici (azoto, 130 mg/L; fosforo, 23 mg/L)⁹, per promuovere la mineralizzazione e prevenire le limitazioni dei nutrienti. Mentre i test di screening offrono preziose informazioni iniziali, potrebbero essere necessari ulteriori test, come gli ormeggi costieri e in acque profonde, che misurano la perdita di peso in funzione del tempo, per una valutazione completa in condizioni marine naturali. Poiché questi test di ormeggio costiero e in acque profonde stimano la biodegradazione in base alla perdita di peso in funzione del tempo^10,11, i ricercatori dovrebbero prima eseguire questo test di screening, che misura direttamente il metabolismo microbico, prima di passare a un esperimento di ormeggio costiero e in acque profonde in situ, che è anche più costoso.

Il metodo di prova standard ASTM D6691 delinea le procedure per valutare la biodegradazione aerobica di materiali plastici non galleggianti in ambienti marini. Questo standard, insieme agli standard di specificazione, come ASTM D7081 (Standard Specification for Non-Floating Biodegradable Plastics in the Marine Environment; focusing on biodegradability in an acquoous medium, attualmente ritirato da ASTM e in fase di rivalutazione), fornisce un quadro per la certificazione dei polimeri sperimentali come biodegradabili marini ^9,12. In generale, una specifica è uno standard di consenso di ASTM International che stabilisce i requisiti che un materiale, un prodotto o un sistema deve soddisfare. Garantisce che i materiali progettati per biodegradarsi in ambienti marini lo facciano entro tempi accettabili e non rilascino additivi potenzialmente tossici, come coloranti o plastificanti.

Basandosi su ASTM D6691, questo protocollo quantifica il tasso e il grado di biodegradazione aerobica dei materiali (substrato sperimentale) nell'acqua di mare naturale e amplia i controlli positivi dei materiali (ad esempio, cellulosa, carta Kraft, chitina/chitosano), storicamente dimostrati biodegradabili nell'ambiente marino ^7,9,10. L'obiettivo di questo metodo è quello di vagliare i materiali in condizioni ottimizzate per vedere se i materiali si biodegradano nell'ambiente marino. L'inoculo sfrutta la comunità microbica naturale presente nell'acqua di mare, raccolta seguendo specifiche linee guida delineate nell'ASTM. Queste linee guida sottolineano l'utilizzo di acqua di mare con una salinità di circa 32, raccolta da un luogo privo di sostanze inquinanti come acque reflue, scarichi chimici o fuoriuscite di petrolio. Il test utilizza un respirometro automatizzato a circuito chiuso con recipienti del reattore da 250 mL mantenuti a 30 °C, ciascuno contenente 75 mL di acqua di mare e ~20 mg del substrato sperimentale o di controllo⁸. La mineralizzazione (biodegradazione) è espressa come la percentuale di biogas netto di carbonio (CO_2-C) prodotto rispetto alla massa di carbonio iniziale aggiunta. Questo metodo non tiene conto dell'assimilazione del carbonio nella biomassa microbica.

Protocollo

1. Raccolta e caratterizzazione dell'acqua marina

1. Identificare un sito di raccolta dell'acqua di mare non interessato da acque reflue, sostanze chimiche, chiazze di petrolio o forte influenza dell'acqua dolce.
2. Presso il sito di raccolta, registrare la fonte (posizione, latitudine e longitudine, profondità di raccolta, profondità totale e temperatura), la data di raccolta del campione e le condizioni dell'acqua osservate.
3. Raccogli e combina campioni di acqua di mare da diverse profondità, posizioni dei siti ed eventi di campionamento per promuovere una composizione diversificata della comunità microbica.
4. In una damigiana lisciviata acida da 20 L, raccogliere da 10 L a 20 L di acqua di mare utilizzando una grande bottiglia Niskin e riportarla in laboratorio.
5. Dalla damigiana, trasferire 1 litro di sottocampione di acqua di mare intera in un flacone di polietilene ambrato ad alta densità (HDPE) da 1 litro lisciviato con acido per l'analisi di laboratorio del particolato, del carbonio e dell'azoto per le condizioni iniziali dell'acqua di mare. Dal campione da 1 L, filtrare (0,2 μm; acetato di cellulosa a basso contenuto di azoto) e raccogliere un sottocampione da 60 mL in un flacone di polietilene lisciviato con acido per l'analisi dei costituenti inorganici e organici disciolti di azoto (N) e fosforo (P).
6. Etichettare i sottocampioni con il nome del progetto, l'ID del campione e la data. Misurare le concentrazioni di NH₄⁺ utilizzando il metodo dell'indofenolo (4500-NH3)^13,14 e i livelli di PO₄^3- utilizzando il metodo della soluzione singola (4500-P E)^13,15. Quantificare il particolato, l'azoto e il carbonio utilizzando il metodo di analisi elementare¹⁶. Misurare le concentrazioni di clorofilla-a seguendo i protocolli delineati da Parsons et ^al.17(10150 A, 10150 C)¹³.
   NOTA: Le analisi della qualità dell'acqua relative ai nutrienti sono facoltative. Questo protocollo presuppone che le analisi siano condotte da un laboratorio esterno.
7. Coprire leggermente l'apertura della damigiana per mantenere le condizioni aerobiche e conservare l'acqua di mare a 30 °C al buio per un massimo di 7 giorni.
   NOTA: L'acqua di mare può anche essere aerata utilizzando una pompa dell'aria e un sistema di gorgogliamento.

2. Preparazione del substrato sperimentale

1. Aggiungere 10-15 g di substrato sperimentale (ad es. polisaccaridi naturali, legno, fibra di legno, polimeri) che può essere sotto forma di pellet, frammenti e pezzi formati in una giara di macinazione in acciaio inossidabile da 50 ml con una sfera in acciaio da 20 mm. Fresare il substrato sperimentale fino a ottenere una granulometria uniforme (0,10-0,25 mm) prima dell'inizio del test.
2. Immergere il barattolo di macinazione nell'azoto liquido e infragilire per 15 minuti fino a quando l'azoto liquido smette di bollire.
   ATTENZIONE: L'azoto liquido è un liquido criogenico che può causare ustioni, lesioni o congelamento. Leggere e seguire tutte le schede di sicurezza prima dell'uso. Indossare adeguati dispositivi di protezione individuale.
3. Fissare la giara di macinazione nell'accessorio del mulino a sfere e impostare i parametri dello strumento su 30 Hz e 2:30 min, quindi premere Start. Ripetere 4 volte con 30 s di raffreddamento in azoto liquido tra una prova e l'altra. Se il materiale è un polimero con una bassa temperatura di transizione vetrosa, eseguire cicli di fresatura aggiuntivi se necessario per produrre una distribuzione granulometrica uniforme.
4. Verificare l'uniformità dimensionale e caratterizzare la distribuzione granulometrica mediante analisi al setaccio come descritto in ASTM D1921-96¹⁸. Assemblare setacci standard che coprono l'intervallo di dimensioni delle particelle previsto, con la dimensione della maglia più piccola sul fondo. Posizionare il campione fresato sul setaccio superiore e fissare la pila di setacci in un agitatore meccanico. Agitare fino a quando le particelle non passano attraverso la rete. Raccogliere e pesare il materiale trattenuto da ciascun setaccio per calcolare la distribuzione granulometrica. Utilizzare lo stesso set di setacci per tutti i trattamenti per mantenere la comparabilità. Registrare la distribuzione sulla scheda tecnica.
5. Determinare il contenuto di carbonio per sottocampione in peso secco del substrato sperimentale fresato mediante analisi elementare¹⁶.
   NOTA: Questo protocollo presuppone che l'analisi elementare sia condotta da un laboratorio esterno.

3. Preparazione dei nutrienti aggiuntivi per l'acqua di mare

1. Riempire a metà un matraccio tarato da 2 L o 4 L con acqua di mare. Il volume totale necessario dipende dal numero di recipienti del reattore da utilizzare nell'esperimento. Ogni recipiente del reattore conterrà 75 ml di acqua di mare. Se la fonte di acqua di mare contiene alte concentrazioni di particolato organico, setacciare l'acqua di mare attraverso una maglia da 20 μm per eliminare la contaminazione eterogenea da particelle di grandi dimensioni.
2. Utilizzando una bilancia di precisione con sensibilità fino a 0,001 g, tarare un piatto di pesata e pesare 0,5 g/L di cloruro di ammonio (NH₄Cl) e quindi 0,1 g/L di fosfato di potassio monobasico (KH₂PO₄) sulla base di 2 L o 4 L di acqua di mare.
   ATTENZIONE: Il cloruro di ammonio può causare danni o irritazioni agli occhi. Leggere e seguire tutte le schede di sicurezza prima dell'uso e indossare dispositivi di protezione individuale adeguati.
   NOTA: Smaltire i rifiuti monobasici di cloruro di ammonio e fosfato di potassio in appositi contenitori per rifiuti pericolosi secondo le procedure istituzionali e le normative locali. Piccoli volumi di soluzioni diluite (<1%) di NH₄Cl e KH₂PO₄ possono essere idonei per lo smaltimento degli scarichi dopo la diluizione con abbondante acqua, se consentito dall'istituto e dall'autorità locale per le acque reflue.
3. Aggiungere i nutrienti inorganici al matraccio tarato da 2 L o 4 L, portare a volume con acqua di mare, aggiungere una barretta di agitazione e mescolare su una piastra di agitazione fino a quando tutti i sali si sono sciolti. La soluzione deve essere limpida e priva di particelle visibili.
4. Sottocampione 20-30 mL di acqua di mare integrata con nutrienti per la misurazione del pH e della salinità. Filtrare altri 60 mL attraverso un filtro in acetato di cellulosa a basso contenuto di azoto da 0,2 μm in un flacone di polietilene lisciviato con acido per l'analisi di N e P inorganici disciolti seguendo i metodi standard al punto 1.5.
5. Misurare il pH e la salinità su un misuratore da banco seguendo le istruzioni del produttore. Si prevede una diminuzione del pH di circa un'unità per l'acqua di mare a piena forza a causa dell'acidità dell'integratore nutritivo.

4. Preparazione per l'incubazione del recipiente del reattore

1. Lisciviare con acido tutta la vetreria, compresi i recipienti del reattore da 250 mL per i campioni e la pipetta volumetrica da 75 mL in acido cloridrico (HCl) al 10% per 24 ore e risciacquare 3 volte con acqua deionizzata.
   ATTENZIONE: L'HCl può causare gravi ustioni e danni agli occhi. Leggere e seguire tutte le schede di sicurezza prima dell'uso. Indossare adeguati dispositivi di protezione individuale.
   NOTA: Il 10% di rifiuti di HCl può essere neutralizzato con bicarbonato di sodio per formare una soluzione neutra prima dello smaltimento. Eseguire la neutralizzazione in conformità con le procedure istituzionali sui rifiuti pericolosi e le normative locali applicabili.
2. Autoclavare i recipienti vuoti del reattore da 250 mL lisciviati con acido, i coperchi con porte, gli O-ring di tenuta in silicone e i tappi a vite in un'autoclave a 121 °C per 15 minuti prima del giorno dell'esperimento.
3. Etichettare le fiale del campione con il numero/ID del canale corrispondente ai recipienti che ricevono il campione o i materiali di controllo.
4. Utilizzando la bilancia analitica, tarare una fiala (con tappo) e pesare 20 mg (± 0,1 mg) di test sperimentale o di controllo, registrare il peso completo della lettura e mettere da parte. Ripetere per tutte le repliche sperimentali e di controllo.
   NOTA: Assicurati che i pesi siano accurati. Si consiglia di pesare tutti i substrati lo stesso giorno e dalla stessa persona.
5. Accendere l'incubatrice il giorno prima di aggiungere i recipienti e impostare la temperatura a 30 °C. Accendere il respirometro almeno 2 ore prima di eseguire la diagnostica del sistema e la calibrazione del sensore in base alle istruzioni del produttore.
   NOTA: La preparazione del recipiente del reattore può procedere una volta che la temperatura dell'incubatore raggiunge e mantiene i 30 ± 2 °C.
6. Preparare la scheda tecnica registrando gli ID/repliche dei campioni e il numero di canale corrispondente. Organizzare i recipienti del reattore e i gruppi di tappi (coperchio con porte/O-ring) in ordine di numero di canale/ID (assicurarsi che ogni recipiente sia chiaramente etichettato). Controllare gli O-ring e i coperchi/porte per assicurarsi che siano puliti, asciutti e intatti.

5. Impostazione dei recipienti del reattore

1. Utilizzare una pipetta volumetrica da 75 mL lisciviata con acido e un pipettatore motorizzato per erogare 75 mL di acqua di mare integrata con nutrienti in ciascun recipiente del reattore.
2. Rimuovere una pipetta monouso di acqua di mare (~3 ml) da ciascun recipiente e appoggiarla su una superficie pulita accanto ad essa. Quest'acqua di mare sarà utilizzata per sciacquare i substrati sperimentali e di controllo macinati dalla fiala tarata (Figura 1).
3. Trasferire i substrati in recipienti appropriati.
4. Posizionare un O-ring sul bordo del recipiente del reattore, quindi posizionare un coperchio a due porte direttamente sopra l'O-ring. Fissare l'O-ring e il coperchio in posizione con un tappo a vite.
5. Abbinare il contenitore del reattore alle linee di gas/condensazione corrispondenti. Inserire saldamente le tubazioni del gas nelle apposite porte di ingresso/uscita del coperchio del serbatoio.
6. Accendere la piattaforma dell'agitatore a 0,05 x g (modalità continua). Eseguire un controllo visivo per assicurarsi che tutti i recipienti siano saldi, quindi chiudere lo sportello dell'incubatrice.
7. Registra la temperatura dell'incubatore (lettura e sonda a termistore) e la pressione atmosferica utilizzando un barometro.

Figura 1: Impostazione e preparazione del recipiente. (A) Aggiunta di acqua di mare, (B) aggiunta del campione e (C) aggiunta dell'O-ring, del coperchio metallico e del tappo a vite. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Avvio del sistema di respirometria

1. Avvia il software sul computer collegato. Verificare che il sistema rilevi l'hardware tramite la connessione RS-232. Se l'hardware non viene trovato, una notifica indicherà che il dispositivo non è connesso e il programma deve essere riavviato.
2. Nel menu principale del software, selezionare Strumenti > Diagnostica > Operazioni di base. Fare clic su Salva file di registro. Fare clic su valvole e sensori. Il software indicherà PASS o FAIL per ogni test. Procedere alla calibrazione a due punti del sensore di CO₂ solo se entrambi i test vengono superati.

7. Calibrazione del sensore di CO₂

1. Collegare una colonna di calce sodata alla porta dell'azoto sul pannello posteriore della pompa del campione per rimuovere la CO₂ ambientale per la calibrazione zero. Assicurati che la calce sodata appaia bianca gessosa e non scolorita (ad esempio, rosa o viola).
2. Selezionare Strumenti > Calibrazione. Fare clic su Avvia calibrazione nell'angolo in basso a destra. Quando richiesto, regolare il flusso di campione a 0,5 L/min utilizzando il controllo della pompa di campionamento sul pannello frontale. Fare clic su OK.
3. Quando il timer raggiunge lo zero, premere i pulsanti di offset Su e Giù sul sensore di CO₂ per regolare la lettura sullo schermo su 0.000 (o il più vicino possibile). I valori diventeranno verdi quando rientrano nell'intervallo accettabile. Fare clic su Avanti gas.
4. Quando richiesto, collegare la bombola del gas di calibrazione alla porta di calibrazione sul pannello posteriore della pompa di campionamento. Regolare la pressione di uscita del gas di calibrazione su 5 PSIG. Assicurarsi che il gas in eccesso scorra attraverso il raccordo a T in modo che l'utente possa sentire e sentire il gas vicino al raccordo, prima di fare clic su OK.
5. Quando il timer raggiunge lo zero, premere i pulsanti Su e Giù sul sensore di CO₂ per regolare la lettura sullo schermo a 2.700 (o il più vicino possibile). I valori diventeranno verdi quando rientrano nell'intervallo accettabile. Fare clic su Next Gas per completare la calibrazione.
   NOTA: Le concentrazioni di gas di span sono determinate dalla miscela di gas standard primaria certificata, come documentato nel certificato di analisi del fornitore.

8. Configurazione dell'esperimento nel software

1. Seleziona Esperimento > Configurazione. Immettere i numeri dei canali iniziale e finale dai menu a discesa in base ai canali occupati.
   1. Impostare Soglia di aggiornamento (%) su 0,50, Intervallo di aggiornamento su N.A. e Finestra di aggiornamento (sec) su Auto.
   2. In Configurazione varie, selezionare la casella Sensori di spurgo; assicurarsi che la misurazione automatica del volume, il consumo positivo di O₂ e l'opzione Abilita modalità flusso aperto non siano selezionati.
   3. Impostare l'intervallo di campionamento (ore) su 8.00 e la durata dell'esperimento (ore) su N.A. Impostare le unità di gas e tempo secondo necessità.
   4. Se si utilizza la sonda di temperatura primaria per la correzione della temperatura di incubazione, assicurarsi che l'opzione Inserimento manuale delle temperature della camera non sia selezionata. Seleziona la casella per la modalità di sfiato e assicurati che la modalità di scarico non sia selezionata.
   5. Assicurarsi che la modalità di sfiato anaerobico non sia selezionata.
2. Selezionare Impostazione camera. Inserisci etichette di canale descrittive (ad es. NegCtrl_1, PosCtrl_2, Test_PHA_3).
3. Fare clic su Utilità. Fare clic su Celle nella colonna EN solo per i canali occupati. Fare clic su Limitazione. Il software indicherà PASS o FAIL per ogni canale. Procedere solo se tutti i test di restrizione vengono superati.
4. Fare clic su Volume per misurare i volumi dello spazio di testa.
   NOTA: Il volume dello spazio di testa è uguale al volume dell'aria all'interno del recipiente del reattore del campione e del tubo a circuito chiuso. Verificare che i volumi siano ragionevoli per le dimensioni del recipiente e la lunghezza del tubo.
5. Fare clic su Perdita. Il software indicherà PASS o FAIL per ciascun canale in base al volume dello spazio di testa. Se si verifica un errore in un canale, eseguire la procedura seguente.
   1. Assicurarsi che l'O-ring sia pulito e privo di particelle e fibre e posizionato correttamente tra il bordo del recipiente e il coperchio metallico.
   2. Serrare il tappo a vite. Controllare il collegamento e i tubi alle porte IN/OUT e ai raccordi. Tagliare le estremità dei tubi usurate o deformate con una lama affilata per garantire un taglio netto e dritto.
   3. Se il canale continua a guastarsi, sostituire l'O-ring con uno nuovo compatibile specificato dal produttore.
6. Fare clic su Volume per rimisurare i volumi dello spazio di testa. Fare clic su Esci. Assicurarsi che la colonna Volume della scheda Impostazione camera sia popolata per tutti i canali occupati.
7. Nel menu principale, selezionare Strumenti > menu Servizio. Verificare che la sonda di temperatura primaria, che misura la temperatura dell'incubatore, sia a 30 °C ± 2 °C e stabile.
8. Fare clic su Esegui. Salvare il file utilizzando un nome descrittivo che includa la data (ad esempio, 030325PositiveControlValidation). Registrare il nome del file sul foglio dati.
9. Seleziona Esperimento > Visualizza > grafici per visualizzare i grafici in tempo reale. La produzione di biogas appare come tassi di produzione positivi di CO₂ . I controlli negativi possono oscillare intorno allo zero; Tuttavia, il loro tasso medio dovrebbe essere zero o positivo.
10. Se il sistema include essiccatori d'aria a condensazione, mantenere un registro giornaliero della condensa visibile nei tubi. Agitare delicatamente il tubo per interrompere le ostruzioni e consentire il drenaggio, se necessario.
11. Aggiornare i file di dati (file di testo ASCII) al termine di ogni intervallo di campionamento. I dati, tra cui temperatura, % di gas (composizione del gas), velocità e accumulo, possono essere scaricati in vari altri pacchetti software durante l'esperimento o alla fine.
    1. Per aprire .dat file in un foglio di calcolo, avvia Excel e seleziona Apri > file. Passare alla cartella contenente il file .dat. Nel menu a discesa del tipo di file, selezionare Tutti i file e scegliere il file desiderato.
    2. Quando richiesto dall'Importazione guidata testo, selezionare Delimitato come tipo di file e fare clic su Avanti.
    3. In Delimitatori, seleziona la casella Virgola. Assicurarsi che non siano selezionati altri delimitatori. La finestra di anteprima dovrebbe visualizzare i dati separati in colonne. Fare clic su Fine per caricare i dati nel foglio di calcolo.
    4. Salva il file in formato .xlsx o .csv per ulteriori analisi e archiviazione.
12. Analizzare periodicamente i dati per assicurarsi che le repliche del trattamento siano coerenti. L'errore standard delle repliche di trattamento deve essere inferiore al 5% della produzione cumulativa media di CO₂ . Ripetere i test che non superano questa soglia.
13. Fare clic su Interrompi al termine dell'incubazione.
    1. Le incubazioni possono durare da 10 a 90 giorni. Se i materiali in esame sono altamente biodegradabili, terminare l'incubazione quando la produzione cumulativa di CO₂ si stabilizza o prolungarla se non si osserva alcuna degradazione dopo 90 giorni.
    2. Concludere gli esperimenti quando non si osserva alcuna produzione netta di gas per almeno 5 giorni sia nei recipienti di controllo che in quelli di prova. Per produzione netta non si intende una variazione inferiore all'1% della percentuale di biodegradazione nell'arco di 5 giorni.
14. Spegni il sistema o preparati per il prossimo esperimento.

9. Scomporre l'esperimento

1. Registrare la temperatura dell'incubatore (sonda a termistore e lettura dell'incubatore). Scollegare il tubo dai recipienti del reattore dal respirometro e pesare ciascun recipiente del reattore campione utilizzando una bilancia di precisione. Registrare i pesi per determinare se si è verificata una perdita di peso/acqua durante il periodo di incubazione.
2. Sottocampionare 20-30 mL di acqua di mare da ciascun recipiente del reattore per misurare il pH e la salinità e confrontare questi valori con quelli registrati nella fase 3.4 per verificare la stabilità durante l'incubazione. Filtrare altri 60 mL attraverso un filtro in acetato di cellulosa a basso contenuto di azoto da 0,2 μm in un flacone di polietilene lisciviato con acido per l'analisi di N e P inorganici disciolti seguendo i metodi standard del passaggio 1.5.
   NOTA: I campioni di acqua di mare residua possono essere filtrati per rimuovere la plastica rimanente, diluiti per ridurre le concentrazioni di nutrienti e smaltiti mediante scarico in conformità con le normative istituzionali e locali.
3. Sciacquare recipienti, O-ring, coperchi metallici e tappi a vite con acqua di rubinetto. Immergere la vetreria in un bagno acido HCl al 10% per almeno 24 ore. Autoclave e conservare coperti in un foglio di alluminio per la successiva incubazione

10. Calcolo della percentuale di biodegradazione

1. Calcolare il carbonio totale nel substrato sperimentale/di controllo come segue:
   
   dove % C (contenuto di carbonio) è determinato attraverso l'analisi elementare.
   NOTA: Il carbonio totale nei substrati sperimentali e di controllo può subire le seguenti trasformazioni biochimiche durante l'incubazione aerobica:
   C + O₂ → CO₂
   Ogni mmolo (12 mg) di carbonio organico proveniente dal substrato sperimentale/di controllo può essere convertito in 1 mmol di CO₂ gassosa. Un mmole di gas prodotto occupa 22,4 mL a temperatura e pressione standard (STP).
2. Calcolare la percentuale di biodegradazione come segue:
   
   dove C_g = quantità di carbonio gassoso prodotto dal substrato sperimentale/di controllo e controllo negativo (solo inoculo di acqua di mare), mmoles, e C_i = quantità di carbonio nel substrato sperimentale aggiunto, mmoles.
3. Calcolare l'errore standard, s_e, della percentuale di biodegradazione come segue:
   
   dove n1 e n2 = numero di recipienti del substrato sperimentale/di controllo replicati e dei reattori di controllo negativo, rispettivamente, e s = deviazione standard del carbonio gassoso totale prodotto.
4. Calcolare i limiti di confidenza al 95% (CL) come segue:
   
   dove t = valore di distribuzione t per probabilità del 95% con (n1 + n2 − 2) gradi di libertà, quindi n = 3 + 3 − 2 = 4.

11. Fine del protocollo

1. Dopo aver completato i calcoli e l'analisi dei dati, è possibile inserire i risultati nel report finale o inserirli in un database condiviso in conformità con i piani di gestione dei dati del progetto o dell'istituto. Assicurarsi che tutti i materiali siano smaltiti secondo le linee guida istituzionali sui rifiuti pericolosi e che tutte le attrezzature siano pulite e conservate.

Risultati

Vengono presentati i risultati dei test di biodegradazione marina. La biodegradazione è stata valutata per ciascun campione misurando la proporzione di carbonio convertito in anidride carbonica. I grafici di biodegradazione cumulativa, di velocità e percentuale mostrano tipicamente una fase di ritardo, seguita da una fase di crescita e infine da un plateau. La tempistica e l'entità di queste fasi dipendono dal materiale del campione, dalle condizioni sperimentali e dalla composizione del...

Discussione

Le prestazioni del controllo positivo determinano la validità del test. È richiesta una biodegradazione minima del 70% di un substrato di controllo positivo facilmente biodegradabile in mare (ad esempio, cellulosa di grado analitico, carta Kraft, ecc.), in base alla sua resa massima teorica di gas. Questo benchmark verifica le condizioni favorevoli e una sufficiente attività microbica nell'acqua di mare naturale durante l'incubazione. Il mancato raggiungimento di questa soglia indica un ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0.2 & micro; M, filtro in acetato di cellulosa da 47 mm	Geofiltro Geotecnico	83100056	Filtrare l'acqua di mare
Pipetta volumetrica da 100 mL	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	13-650-2U	Classe A; Acido lisciviato e sciacquato con acqua deionizzata
Becher in vetro da 100-600 mL	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	50-194-5690	Classe A; Acido lisciviato e sciacquato con acqua deionizzata
Sfere da fresatura da 20 mm	Retsch	53680062	Acciaio inox. Utilizzato con barattolo di macinazione per la macinazione criogenica del polimero
Barattoli da macinazione da 50 mL	Retsch	14620216	Acciaio inox. Utilizzato con sfere di fresatura Mixer Mill 400 e 20 mm per la macinazione criogenica del polimero
Pipetta volumetrica da 75 mL	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	13-650-2T	Classe A; Acido lisciviato e sciacquato con acqua deionizzata
Pompa d'aria e sistema di bolle	Tetra	77846	Aerare l'acqua di mare durante l'equilibrio pre-incubazione
Carta stagnola	Fisherbrand	01-213-100	Copritura per autoclaving e conservazione pulita
Cloruro di ammonio (NH4Cl)	Thermo Fisher Scientific, Fisher Chemical	A661-500	Picco di nutrienti dell'acqua di mare
Bilanciamento analitico	Mettler	AT201	Pesare i substrati sperimentali e di controllo
Autoclave	Tuttnauer	MFI-TTN-3870EA	Per sterilizzare recipienti e coperchi
Base Micro-Oxymax 120VAC Single Channel	Columbus Instruments	0135-8000	Utilizzato per immagazzinare controlli positivi e polimeri
Gas di calibrazione	Airgas	X03NI92P3000001	miscele gassoase standard primarie; 2,7% anidride carbonica, 4,5% metano, bilanciamento azoto
Computer Monitor	Dell	210-BMKK	Monitor hub USB-C Dell Pro 24 Plus. Utilizzato con computer per eseguire il software Micro-Oxymax
Guanti criogenici	Thermo Fisher Scientific, Tempshield, Cryo Gloves	11-394-306	Utilizzato per gestire l'azoto liquido
Termometro a quadrante	Thermo Fisher Scientific, H-B Instrument Durac	13-201-433	Termometro calibrato per la temperatura dell'acqua di mare al momento della raccolta
Pipette usa e getta	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	13-711-7M	Risciacquare i lati del recipiente per liberare il materiale
Involucro ENC52 a controllo di temperatura e luce	Columbus Instruments	4740-4054	Mantenere condizioni di temperatura e luce
Pinze per fiaschette	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	S07387	Usata per maneggiare barattoli di macinazione in azoto liquido
Fiaschede, 250 mL	DWK Scienze della Vita	14395-250	Vasi campione dei reattori
Fiale in vetro con chiusura in stile plug	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	03-339-26D	Memorizzazione dei campioni
Profondimetro portatile H22PX	West Marine, Norcross Marine	6849368	Determinare la profondità del sito di raccolta dell'acqua di mare
GPS portatile 73	Garmin	10-01504-00	Utilizzato per determinare la posizione del sito di raccolta dell'acqua di mare
Padella HDPE	Thermo Scientific, Nalgene	13-359-26	Usato per usare acidi in vetro & nbsp; in soluzione al 10% di HCl
Acido cloridrico (soluzione acquosa acida)	Thermo Fisher Scientific, Fisher Chemical	A144-212	ACS Plus certificato, 36,5-38,0%. Controllo sensori CO2 e vetri con liscivia acida
Cappa a flusso laminare	Scienza dell'Aria	FLOW-48-A	Minimizzare i contaminanti aerotrasportati durante la preparazione del campione
Niskin grande; Solo bottiglia Beta Plus - 8,2L orizzontale, PVC	La scienza prima	3-1980-H65	Per la raccolta dell'acqua di mare dal molo o dalla barca
Padella per azoto liquido	Thermo Fisher Scientific, Bel Art Magic Touch 2	11-999-063	Trattenere azoto liquido
Recipiente di trasferimento di azoto liquido, 10 L	Thermo Scientific	TY509X2	Conservare e dispensare azoto liquido per la criomillazione
Azoto liquido, grado industriale, 22 PSI	Airgas	NI 180LT22	Usata per fragilizzare e macinare polimeri
Setacciatore meccanico	Humbolt, Grainger	5DPL6	Analisi del crivello per la distribuzione delle dimensioni delle particelle
Micro-Oxymax	Columbus Instrumentts	7395-113-D64	O-ring sigillato in silicone, porta metallica con 3 raccordi e tappo a vite GL45 e nbsp;
Interfaccia di espansione Micro-Oxymax a 10 canali	Columbus Instruments	0135-8101	Componente del Sistema di Respirometria
Micro-Oxymax Respirometro (sensore CO2)	Columbus Instruments	0135-8403	Infrarosso non dispersivo
Mulino miscelatore 400	Retsch	207450001	Mulino miscelatore 400. Utilizzato per la macinazione criogenica di polimeri
Regolatore motorizzato per pipette	Eppendorf	4430000018	Trasferire acqua di mare ai recipienti del reattore campione
Bottiglia a bocca stretta in ambra HDPE Quality Lab, 1 L	Thermo Scientific, Nalgene	02-923-5	Campione discreto di acqua di mare intera
Nylon Mesh 20 Micron	ELKO Filtering Co.	41718	Usata per setacciare acqua di mare grezza per rimuovere particelle eterogenee più grandi
Shaker Orbitale Aperto	Thermo Fisher Scientific	SK4000	Mantenere il movimento orbitale dei vasi del reattore durante l'incubazione
OptiPlex 5090 Computer a piccolo fattore di forma	Dell	C0SL03	Computer Desktom usato per eseguire il software Micro-Oxymax
Misuratore pH/Cond	Mettler Toledo, SevenExcellence S470-Basic	30046252	Misuratore di pH/conducibilità da banco per misurare l'inoculo iniziale e finale dell'acqua di mare
Bottiglia di polietilene, 60 mL	Qorpak	PLC-03564	Campione discreto di acqua di mare filtrata
Fosfato di potassio monobasico (KH2(PO4))	Thermo Fisher Scientific, Fisher BioReagents	BP362-500	Picco di nutrienti dell'acqua di mare
Bilanciamento di precisione	Sartorius	Practum2102-1S	Pesare il tare e il peso totale dei recipienti
Carboy rotondo, 20 L	Thermo Fisher Scientific	02961A	Lisciviata con acido per l'immagazzinamento dell'acqua di mare
Occhiali di sicurezza	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	19-181-513
Scoopula	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand, Scoopula	01-257-567	Scoopula da laboratorio in acciaio inossidabile
Crivelli	Advantech, Grainger	40PR18-40PR55	Setacci in acciaio inossidabile. Il numero e le dimensioni dei setacci dipendono dal materiale da testare.
Cellulosa Sigmacell, Tipo 101	Sigma-Aldrich	435236-250G	Polvere, substrato di controllo positivo
Bicarbonato di sodio	Thermo Fisher Scientific, Fisher Chemical	S233-500	Controllo sensori CO2
Solfito di sodio, anidro, 98%	Thermo Fisher Scientific, Thermo Scientific Chemicals	AAA1793336	Controllo sensori CO2
Sonda termometrica/termistore	Fisherbrand	15-079-700	Verifica la temperatura dell'incubatrice
Barometro a Manopola di Precisione Tracciabile	Fisherbrand	14-648-51	Registrare la pressione atmosferica all'inizio dell'esperimento
Regolatore a due stadi di idrogeno Victor di media funzione, metano a due stadi, CGA - 350	AirGas	VIC0781-3559	Regolatore di gas di calibrazione & nbsp;
Fiaschette volumetriche, 2 L	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	FB4002000	Classe A; acido lisciviato e risciacquato con acqua deionizzata. Usata per preparare acqua di mare ricca di nutrienti.
Padella di pesatura	Thermo Fisher Scientific	02-202-101	Polietilene