Questo protocollo descrive un sistema in vitro per modellare l'infezione de novo litica dell'herpesvirus associato al sarcoma di Kaposi utilizzando virioni derivati da BAC16. Il metodo consente di studiare la replicazione e la diffusione virale precoce. La produzione di virus infettivi è quantificata mediante saggi di unità infettive basate su GFP e PCR in tempo reale di genomi virali incapsulati.
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Articolo metodologico
Determinazione e quantificazione dell'infezione litica de novo da herpesvirus associato al sarcoma di Kaposi libero da cellule
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'herpesvirus associato al sarcoma di Kaposi (KSHV), un gammaherpesvirus implicato in molteplici neoplasie maligne umane, può subire la replicazione litica durante l'infezione primaria, un processo che contribuisce alla disseminazione virale, all'evasione immunitaria e alla patogenesi della malattia. Tuttavia, la mancanza di solidi sistemi in vitro per l'infezione de novolitica ha limitato le conoscenze sugli eventi precoci dell'infezione. Qui, presentiamo un protocollo trattabile che impiega cellule HCT 116 del cancro del colon-retto umano come bersagli per l'infezione con virioni liberi derivati da cellule produttrici di iSLK riattivate con il cromosoma artificiale 16 batterico KSHV (BAC16). Questo modello ricapitola i passaggi chiave dell'infezione primaria, tra cui l'ingresso virale, la consegna del genoma, l'espressione genica litica e la produzione di progenie. L'infezione viene sincronizzata tramite spinoculazione e monitorata temporalmente. La produzione del virus viene quantificata utilizzando un sistema a doppia lettura che comprende saggi dell'unità infettiva (UI) basata sulla proteina a fluorescenza verde (GFP) e qPCR del DNA virale incapsulato. Questi approcci consentono un'analisi dettagliata della cinetica di replicazione virale. Mentre l'attuale protocollo si concentra sul rilevamento di eventi in fase avanzata, il sistema è adattabile per lo studio delle prime fasi dell'infezione attraverso punti temporali di campionamento modificati. Offrendo una piattaforma riproducibile e scalabile per l'infezione de novo produttiva, questo sistema colma una lacuna metodologica nella ricerca KSHV e supporta studi meccanicistici sull'interazione herpesvirus-ospite e sulle strategie antivirali.
Introduzione
L'herpesvirus associato al sarcoma di Kaposi (KSHV) è un gammaherpesvirus umano eziologicamente legato al sarcoma di Kaposi (KS), al linfoma a versamento primario (PEL), alla malattia di Castleman multicentrica (MCD) e alla sindrome da citochine infiammatorie KSHV 1,2. Come tutti gli herpesvirus, KSHV stabilisce una persistenza permanente nell'ospite, alternando fasi latenti e litiche. Mentre la latenza predomina nella maggior parte delle cellule infette, un sottogruppo può entrare nel ciclo litico durante l'infezione primaria (de novo) o attraverso la riattivazione dalla latenza3. La replicazione litica coinvolge una cascata ordinata di espressione genica virale, che culmina nella replicazione del genoma, nell'assemblaggio del virione e nel rilascio della progenie. Questo processo è fondamentale per la disseminazione virale e la progressione della malattia 4,5. I primi studi sulla replicazione litica di KSHV si basavano spesso sull'espressione ectopica di singoli geni virali in sistemi eterologhi. Sebbene informativi, questi approcci non hanno catturato la regolazione genica coordinata e l'interazione virus-ospite presenti durante l'infezione autentica. Lo sviluppo di BAC-16, un cromosoma artificiale batterico ricombinante (BAC) che trasporta l'intero genoma KSHV, ha permesso la produzione di virus geneticamente manipolabili che mantengono la competenza per la replicazione e la produzione di virione infettivo6. Questo sistema facilita la mutagenesi mirata e l'analisi funzionale dei geni virali nel contesto del genoma completo. I modelli di riattivazione che impiegano cellule iSLK o BCBL-1 infettate in modo latente con BAC-16 o KSHV sono diventati standard per lo studio della replicazione litica di KSHV. Questi sistemi consentono l'induzione sincronizzata del ciclo litico utilizzando agenti come la doxiciclina (Dox) e il butirrato di sodio 7,8. Tuttavia, poiché i modelli di riattivazione eludono le prime fasi dell'infezione, tra cui l'ingresso virale, il traffico intracellulare e la decisione iniziale tra latenza e replicazione litica, non possono ricapitolare completamente le dinamiche dell'infezione primaria.
I modelli di infezione de novo offrono un quadro complementare per affrontare queste lacune. Diversi modelli cellulari primari, come le cellule epiteliali endoteliali e gengivali umane, hanno dimostrato di supportare la replicazione litica dopo l'infezione da KSHV de novo 3,9,10,11. Tuttavia, la loro durata di vita limitata, il costo elevato e la scarsa adattabilità alla manipolazione genetica limitano la loro riproducibilità e scalabilità per gli studi meccanicistici. In questo protocollo, descriviamo un modello trattabile e scalabile di infezione de novo litica KSHV utilizzando la linea cellulare di carcinoma colorettale umano HCT 116. Sebbene non siano un bersaglio naturale di KSHV, le cellule HCT116 mostrano una robusta permissività all'infezione e forniscono una piattaforma stabile ed economica adatta per studi meccanicistici e applicazioni ad alto rendimento. Data la limitata capacità di formazione di placche di KSHV in coltura, utilizziamo il sistema BAC16 che incorpora un reporter GFP per generare virus liberi da cellule per l'infezione. Ciò consente la visualizzazione diretta delle cellule infette e la quantificazione dei titoli infettivi tramite saggi di unità infettive (UI) basati su GFP12. A complemento di ciò, il DNA associato al virione viene misurato mediante PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) dopo il trattamento con DNasi, offrendo un metodo sensibile per rilevare i genomi virali incapsidati. Insieme, questi saggi consentono un'analisi quantitativa temporalmente risolta delle dinamiche di replicazione litica durante l'infezione primaria.
Questo protocollo fornisce una piattaforma affidabile e flessibile per la modellazione dell'infezione de novo litica KSHV in vitro, facilitando la dissezione degli eventi precoci nel ciclo di vita virale, consentendo la valutazione della funzione genica e dell'attività antivirale.
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Protocollo
KSHV è classificato come patogeno umano di livello di biosicurezza 2 (BSL-2). Eseguire tutte le procedure che coinvolgono materiale infettivo in una cabina di biosicurezza certificata BSL-2. Decontaminare le superfici di lavoro con etanolo al 70% prima e dopo ogni procedura. Smaltire tutti i rifiuti in conformità con le normative istituzionali sulla biosicurezza e le linee guida BSL-2 dell'OMS. Una panoramica schematica dell'intero flusso di lavoro è fornita nella Figura 1. La procedura include la generazione di KSHV derivato da BAC16 libero da cellule iSLK riattivate, l'infezione de novo delle cellule HCT 116, la quantificazione dei titoli virali mediante test dell'unità infettiva (UI) e l'analisi qPCR del DNA virale associato al virione. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Produzione di KSHV derivato da BAC16 senza cellule
- Seminare cinque fiasche T75 di cellule iSLK Dox-inducibili che ospitano KSHV BAC 16 (iSLK-BAC16) di tipo largo (WT) a circa l'80% di confluenza. Incubare a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO 2 per 24 ore.
- Indurre la riattivazione litica aggiungendo 1 μg/mL di Dox e 1 mM di butirrato di sodio a ciascun pallone. Continua l'incubazione per 72-96 ore.
- Monitorare quotidianamente le cellule mediante microscopia a contrasto di fase. Raccogliere il surnatante una volta che >90% delle cellule presenta arrotondamento, distacco dalla superficie del pallone e/o lisi visibile, segni distintivi di effetto citopatico (CPE) indicativi di una robusta reazione litica. Dopo la raccolta del surnatante, decontaminare ed eliminare le cellule iSLK-BAC16 indotte liticamente utilizzando il 10% di candeggina.
- Centrifugare i surnatanti raccolti a 1.500 x g per 10 minuti a 4 °C per rimuovere i detriti. Filtrare il surnatante chiarificato attraverso un filtro a membrana in polietersulfone (PES) da 0,45 μm senza disturbare il pellet.
- Trasferire i surnatanti filtrati in provette per ultracentrifuga. Pellettare le particelle virali mediante centrifugazione a 25.000 x g per 3 ore a 4 °C utilizzando un rotore SW28.
- Scartare con cura il surnatante in candeggina al 10%. Risospendere il pellet virale in 1 ml di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) senza siero.
- Aliquotare il virus risospeso in provette sterili da microcentrifuga da 1,5 mL con tappo a vite. Conservare le aliquote a -80 °C fino al momento dell'uso. Determinare i titoli infettivi del ceppo virale utilizzando saggi di unità infettive (UI) basate su GFP in cellule SLK (vedere fase 3).
2. Infezione de novo delle cellule HCT116
NOTA: Un'elevata molteplicità di infezioni (MOI) è fondamentale per avviare in modo efficiente la replicazione litica nelle cellule HCT116 dopo l'infezione de novo da KSHV. Questa condizione consente una robusta espressione genica virale e una replicazione produttiva senza la necessità di stimoli esogeni. Un risultato rappresentativo che dimostra l'effetto MOI-dipendente sulla produzione di virione è fornito nella Figura 1A supplementare.
- Seminare 1 x 105 cellule HCT116 per pozzetto in una piastra di coltura tissutale a 12 pozzetti. Incubare per 24 ore a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO 2 .
- Diluire lo stock virale concentrato in DMEM preriscaldato e privo di siero fino a un volume finale di 250 μl per ottenere una molteplicità di infezione (MOI) di 10.
- Aspirare il terreno di coltura da ciascun pozzetto. Aggiungere 250 μl di virus diluito direttamente nelle cellule.
- Centrifugare la piastra a 1.500 x g per 1 ora a 30 °C per sincronizzare l'infezione (spinoculazione). Trasferire immediatamente la piastra in un'incubatrice a 37 °C e continuare l'incubazione per un'altra 1 ora.
- Aspirare l'inoculo e lavare le cellule tre volte con PBS preriscaldato per rimuovere il virus residuo. Aggiungere 1 mL di DMEM completo a ciascun pozzetto.
- Monitorare l'espressione della GFP nelle cellule infette mediante microscopia a fluorescenza a 36 ore, 60 ore e 96 ore dopo l'infezione. In ogni momento, raccogliere 1 mL di surnatante di coltura da ciascun pozzetto.
NOTA: Dopo la raccolta del surnatante, le cellule HCT116 infettate da KSHV possono essere conservate per applicazioni a valle come l'estrazione dell'RNA, l'analisi delle proteine, l'immunofluorescenza o la citometria a flusso, in base agli obiettivi sperimentali. - Centrifugare i surnatanti raccolti a 1.500 x g per 10 minuti a 4 °C per rimuovere i detriti cellulari. Trasferire i surnatanti chiarificati in tubi freschi. Congelare in azoto liquido e conservare a -80 °C per ulteriori analisi.
3. Saggio delle unità infettive (saggio IU)
NOTA: Le cellule SLK sono permissive all'ingresso di KSHV e supportano l'espressione genica litica precoce. Questo test quantifica le unità infettive in base all'espressione di GFP nelle cellule SLK infette in seguito all'esposizione a surnatanti contenenti virus diluiti in serie.
- Seminare 1 x 104 cellule SLK per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti 24 ore prima dell'infezione. Assicurarsi che le cellule siano distribuite uniformemente e raggiungano una confluenza del ~60%-70% il giorno dell'infezione.
- Etichettare nove provette per microcentrifuga da 1,5 mL per diluizioni seriali doppie: Provetta 1 (non diluita, 1:1), Provetta 2 (1:2), Provetta 3 (1:4), Provetta 4 (1:8), Provetta 5 (1:16), Provetta 6 (1:32), Provetta 7 (1:64), Provetta 8 (1:128) e Provetta 9 (1:256).
- Aggiungere 200 μl di surnatante virale alla provetta 1. Aggiungere 100 μl di DMEM preriscaldato e privo di siero a ciascuna delle provette da 2 a 9. Per iniziare la serie di diluizioni, trasferire 100 μl dalla provetta 1 alla provetta 2 e miscelare accuratamente pipettando su e giù. Quindi trasferire 100 μl dalla provetta 2 alla provetta 3 e ripetere questo processo in sequenza attraverso la provetta 9, mescolando accuratamente ad ogni passaggio.
NOTA: Ogni provetta deve contenere un volume finale di 100 μl. Eseguire tutte le diluizioni in triplicato. - Aspirare il terreno di coltura dalle cellule SLK. Aggiungere 100 μl di ciascuna diluizione del virus nei pozzetti designati. Utilizzare 27 pozzetti in totale (3 pozzetti per diluizione da 1:1 a 1:256).
- Centrifugare la piastra a 96 pozzetti a 1.500 x g per 1 ora a 30 °C per favorire l'adsorbimento del flaconcino. Trasferire la piastra in un incubatore a 37 °C di CO 2 per un'altra 1 ora.
- Rimuovere l'inoculo e aggiungere delicatamente 100 μL di DMEM completo a ciascun pozzetto. Incubare la piastra per 24 ore a 37 °C.
- Raccogliere le cellule e analizzare l'espressione di GFP mediante citometria a flusso. Registrare il numero di cellule GFP-positive per pozzetto.
- Calcolare le unità infettive per mL (UI/mL) utilizzando la seguente formula13:
UI/mL = [(numero di cellule GFP-positive per pozzetto)/ volume dell'inoculo (mL)] x fattore di diluizione. Determinare il titolo virale finale utilizzando l'ultima diluizione con cellule GFP-positive rilevabili
4. Quantificazione di genomi virali incapsulati mediante qPCR
- Aggiungere la DNasi I a una concentrazione finale di 100 U/mL a 400 μL di surnatante chiarificato (vedere la fase 1 per la chiarificazione del surnatante e la rimozione dei detriti). Incubare per 15 minuti a 37 °C per digerire il DNA virale e cellulare non incapsulato. Un risultato rappresentativo che dimostra la specificità e l'efficacia del trattamento con DNasi è mostrato nella Figura 1B supplementare.
- Aggiungere EDTA a una concentrazione finale di 50 mM per arrestare la reazione DNasi. Incubare a 75 °C per 15 minuti per inattivare la DNasi I.
- Estrarre il DNA virale dal surnatante trattato con DNasi utilizzando il DNA Mini Kit secondo il protocollo del produttore.
- Eluire il DNA virale in 30 μL di tampone di eluizione. Utilizzare 5 μL di DNA eluito per ogni reazione qPCR.
- Amplificare il KSHV open reading frame 73 (ORF 73) utilizzando i seguenti inneschi: Avanti: 5'-CCGAGGACGAAATGGAAGTG-3'; Rovescio: 5'-GGTGATGTTCTGAGTACATAGCGG-3.
- Preparare le reazioni qPCR in triplicato utilizzando SYBR Green Master SuperMix. Impostare le condizioni di ciclo come segue: Denaturazione iniziale: 95 °C per 3 min; Amplificazione: 40 cicli a 95 °C per 10 s, 52 °C per 30 s e 72 °C per 30 s; Analisi della curva di fusione: rampa standard per specificità dell'amplicona.
- Generare una curva standard utilizzando diluizioni seriali di 10 volte del DNA virale derivato da BAC-16, che vanno da 109 a 101 copie per reazione. Tracciare i valori Ct rispetto al log10 del numero di copie in ingresso per valutare la linearità del saggio. Una curva standard rappresentativa è mostrata nella Figura 1C supplementare.
- Determinare il numero di copie del genoma virale confrontando i valori Ct con la curva standard. Normalizzare e riportare i risultati come copie di DNA virale per mL di surnatante.
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Risultati
Per quantificare il titolo del virus infettivo, i surnatanti raccolti 72 ore dopo la riattivazione litica delle cellule iSLK-BAC16 sono stati sottoposti a doppia diluizione seriale e utilizzati per infettare le cellule SLK. Il numero di cellule SLK GFP-positive a ciascuna diluizione è mostrato nella Figura 2A e le corrispondenti unità infettive (UI) per mL sono state calcolate e presentate nella Figura 2B...
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Discussione
La modellazione dell'infezione de novo litica di KSHV è stata a lungo ostacolata dalla forte propensione del virus a stabilire la latenza nella maggior parte dei tipi di cellule permissive. Sebbene sia stato dimostrato che alcune cellule primarie, come le cellule epiteliali endoteliali e orali, supportano la replicazione litica dopo l'infezione de novo 9,10, la loro durata di vita limitata, il costo elevato e la...
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Jae U. Jung (Cleveland Clinic) per aver condiviso la linea cellulare iSLK-BAC16 che produce KSHV ricombinante. Il design grafico è stato creato utilizzando BioRender.com, per il quale gli autori possiedono una licenza. Questo lavoro è stato supportato dai premi NIH R21 DE028256, R01 CA140964 e R01 CA262631 a C. Liang (PI), il Wistar Science Accelerator Postdoctoral Award a Q. Zhu.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,45 & micro; m filtro in polietersulfoma (PES) | VWR | 76479-020 | |
| Biorender | Biorender | N/A | Il progetto grafico è stato realizzato con BioRender.com, per il quale gli autori possiedono una licenza |
| Sistema di PCR in tempo reale CFX Opus 96 | Bio-Rad | 184-5072 | |
| DMEM completo | Il medium Eagle's modificato di Dulbecco (DMEM; Sigma-Aldrich) integrato con siero fetale bovino al 10% (v/v) (FBS; Gibco), 2 mM di L-glutammina (Gibco) e 100U/ml di penicillina-streptomicina (Pen-Strep; GenClone). | ||
| DNasi I | Biolaboratori del New England | Codice: M0303S | |
| Doxiciclina | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| Citometro a flusso LSR II 18 | BD Bioscienze | N/A | |
| PerfeCTa SYBR Verde Master SuperMix | Quantabio | 95054-02K | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 56304 | |
| butirrato di sodio (NaB) | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0 | Thermo Fisher | 15575020 |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
