Istituzione e valutazione di un modello di ratto diabetico con arteriosclerosi dell'arto inferiore

Sommario

L'arteriosclerosi obliterante degli arti inferiori è una complicanza comune del diabete mellito. Qui presentiamo un nuovo metodo di modellazione animale che simula la progressione della malattia occlusiva aterosclerotica iniettando etanolo nei vasi sanguigni per disturbare la struttura vascolare, fornendo così una nuova piattaforma per il trattamento delle malattie vascolari.

Abstract

Questo studio mirava a stabilire e convalidare un nuovo modello di ratto per arteriosclerosi obliterante degli arti inferiori (ASO) nei ratti diabetici. A differenza della legatura tradizionale delle arteria femorale, abbiamo iniettato etanolo al 95% (0,1 mL) nell'arteria iliaca esterna. Postoperatoriamente, l'occlusione arteriosa e l'ischemia dell'arto posteriore sono state valutate nei giorni 1, 3, 7 e 14 utilizzando ecografia Doppler, immagini termiche e misurazione del peso muscolare umido. È stata effettuata un'analisi istologica dei vasi sanguigni e dei tessuti muscolari per valutare il tasso di successo e la stabilità del modello. L'etanolo ad alta concentrazione (95%) induce danni alle cellule endoteliali vascolari, portando all'occlusione dell'arteria femorale. Rispetto al gruppo di controllo, l'ecografia Doppler ha rivelato una riduzione progressiva del diametro arterioso e un aumento della velocità del flusso nell'arto colpito. La termografia ha mostrato una diminuzione della temperatura degli arti, mentre la misurazione del peso muscolare ha mostrato una significativa riduzione della massa muscolare ipsilaterale. L'analisi istopatologica ha confermato l'occlusione del lume arterioso, la diminuzione della densità microvascolare e l'esacerbazione progressiva delle lesioni nel tempo. In conclusione, l'iniezione dell'arteria iliaca al 95% di etanolo replica efficacemente le caratteristiche fisiopatologiche dell'occlusione arteriosa dell'arto inferiore, fornendo un modello innovativo per lo studio dell'arteriosclerosi obliterante nei ratti diabetici.

Introduzione

L'occlusione arteriosa degli arti inferiori diabetici (DLEAO) è una delle principali cause di disabilità e mortalità nei pazienti diabetici, compromettendo gravemente la qualità della vita e imponendo un notevole onere^{socioeconomico 1}. La patogenesi della malattia arteriale diabetica coinvolge interazioni complesse tra iperglicemia, dislipidemia, infiammazione cronica e disfunzione^{vascolare 2}. I modelli animali sono stati fondamentali nel chiarire questi meccanismi, fornendo intuizioni fondamentali per lo sviluppo terapeutico. I modelli animali sono strumenti preziosi per simulare la fisiopatologia della malattia arteriosa periferica (PAD) nei pazienti diabetici umani. Questi modelli consentono studi ad alta produttività e riproducibili per indagare la progressione della malattia e chiarire i meccanismi sottostanti. Inoltre, gli studi preclinici che utilizzano modelli animali forniscono dati essenziali per nuove terapie, inclusi agenti farmacologici, terapia genica e approcci di medicina rigenerativa (ad esempio, terapia con cellule ^staminali)3. Tali ricerche fondamentali sono fondamentali per informare i successivi studi clinici e per far avanzare la medicina traslazionale.

Attualmente, il metodo di legatura dell'arteria femorale (FAL) è ampiamente utilizzato nei laboratori per stabilire modelli di ratto di ischemia^{dell'arto posteriore 4}. Questo approccio induce rapidamente manifestazioni ischemiche negli arti^{inferiori 5}; tuttavia, la trombosi arteriosa risultante differisce dalla progressione fisiopatologica osservata nei pazienti diabetici con malattia arteriosa degli arti inferiori (LEAD), che comporta lesioni endoteliali, accumulo di fattori infiammatori e proliferazione delle cellule muscolari^{lisce 2,6}. Inoltre, il FAL innesca una rapida neovascolarizzazione e formazione di vasi collaterali, ripristinando la perfusione a basso flusso poco dopo la^{modellazione 5,7}. Questo contrasta con la progressione cronica del LEAD diabetico. Pertanto, è necessario sviluppare un modello animale che replichi con maggiore precisione i meccanismi fisiopatologici dell'arteriosclerosi umana.

Nei modelli animali diabetici, una lesione meccanica dell'arteria intima femorale tramite catetere con palloncino o induzione chimica (ad esempio, stimolazione con cloruro ferrico) scatena efficacemente cambiamenti patologici, tra cui la denudazione endoteliale, l'infiltrazione delle cellule infiammatorie e la migrazione/proliferazione delle cellule muscolari^{lisce 8}. Questo approccio replica meglio le caratteristiche patologiche distintive dell'aterosclerosi umana. Rispetto al modello FAL tradizionale, il vantaggio principale del metodo indotto dall'etanolo risiede nella sua capacità di simulare con maggiore precisione il complesso processo fisiopatologico del LEAD diabetico. L'etanolo interrompe direttamente l'endotelio vascolare, attivando l'aggregazione piastrinica e la trombosi, imitando così l'evento iniziale nel LEAD⁹ diabetico. Ancora più importante, distruggendo gradualmente la microstruttura vascolare, l'etanolo evita efficacemente la rapida compensazione della circolazione collaterale comunemente osservata nel modello FAL, replicando così con successo lo stato tipico di ipperfusione cronica del LEAD¹⁰ diabetico. Al contrario, il modello di ischemia indotta da legatura delle arteria femurali presenta limitazioni notevoli: i roditori (ad esempio, topi, ratti) compensano rapidamente l'ischemia acuta grazie alla loro circolazione collaterale ben sviluppata, portando a una gravità ischemica incoerente e a una scarsa riproduzione dell'ischemia critica dell'arto umano (CLI^)11,12. Inoltre, la malattia delle arterie periferiche umane (PAD) deriva principalmente dalla progressione cronica dell'aterosclerosi, mentre il modello di legatura dell'arteria femorale rappresenta un evento ischemico acuto con meccanismi fisiopatologici fondamentalmente^{distinti 13}. L'obiettivo principale di questo studio era stabilire e caratterizzare un modello sperimentale stabile e a lungo termine della arteriosclerosi obliterante degli arti inferiori diabetici (LEAOD) che imiti accuratamente la progressione della malattia nei pazienti. L'occlusione indotta dall'etanolo è operativamente semplice, richiedendo solo un'iniezione minimamente invasiva, che riduce la barriera tecnica e la mortalità animale. I suoi parametri chiave sono facilmente standardizzabili, garantendo un'elevata riproducibilità. Inoltre, il metodo è conveniente, elimina la necessità di attrezzature specializzate ed è facilmente trasferibile tra laboratori. Attualmente, persiste la carenza di modelli animali durevoli per convalidare interventi terapeutici innovativi.

Protocollo

Questo studio è stato condotto secondo un protocollo approvato dal Comitato Etico Animale dell'Ospedale Yantai Yuhuangding. Questo studio ha utilizzato 40 maschi di ratti Sprague-Dawley (peso: 250-300 g, età: 6 settimane) alloggiati in un ciclo di 12 ore chiaro/buio. A partire dalle 7 settimane di età, venivano nutriti con una dieta ricca di grassi e saccarosio¹⁴^,¹⁵ ad libitum, con accesso gratuito all'acqua per 8 settimane. Dopo 4 settimane di dieta, il diabete è stato indotto tramite iniezione di streptozotocina (STZ)¹⁶. Dopo 8 settimane, l'affermazione riuscita del modello diabetico è stata confermata prima degli esperimenti successivi. La chirurgia di occlusione arteriosa dell'arto posteriore è stata eseguita su ratti di 14 settimane come descritto di seguito.

1. Induzione chirurgica dell'arteriosclerosi obliterante dell'arto posteriore nei ratti diabetici

1. Preparare tutti gli strumenti e materiali chirurgici come elencato nella Tabella dei Materiali e illustrato nella Figura 1.
2. Anestetizzare il ratto utilizzando una macchina anestesica che somministra isoflurano (1,5-2,5%) e ossigeno (O₂, 1-2 L/min). Mantieni una respirazione spontanea per tutto il tempo. Valuta la profondità dell'anestesia tramite il riflesso del pizzicotto del piede per garantire un piano chirurgico di anestesia.
3. Metti il ratto in posizione supina su una piattaforma di contenzione. Rimuovere i peli dall'addome agli arti inferiori usando crema depilatoria e una lametta da rasoio.
4. Fissa gli arti. Disinfetta la pelle degli arti posteriori con alcol. Fai un'incisione di 2-3 cm sulla coscia mediale destra usando pinze curve e forbici.
   NOTA: Tutte le procedure chirurgiche sono state eseguite da un chirurgo esperto per garantire coerenza e riproducibilità dei modelli animali.
5. Al microscopio, sezionare i tessuti circostanti per esporre l'arteria/vena iliaca esterna e il nervo femorale. Isola i vasi e il nervo. Traccia l'arteria iliaca esterna fino alla sua biforcazione in arterie femorali superficiali e profonde.
6. Pinza il segmento centrale e l'arteria femorale profonda con clip vascolari. Iniettare lentamente 0,1 mL di etanolo al 95% nell'arteria iliaca esterna distale. Dopo 60 secondi, rimuovere le clip; Raggiungere l'emostasi tramite compressione. Chiudi la ferita strato dopo strato.
   NOTA: Durante l'iniezione sono stati osservati immediatamente sbiancamenti dell'arteria e tremori transitori del piede ipsilaterale, confermando una riuscita somministrazione intravascolare di etanolo.
7. Non immobilizzare l'arto colpito dopo l'intervento. Somministrare un'iniezione intramuscolare di penicillina sodica (400.000 UI) per prevenire infezioni.
   NOTA: In questo modello unilaterale di occlusione arteriosa dell'arto inferiore, l'arto controlaterale funge da controllo. Il tempo di occlusione viene calcolato a partire dalle 24 ore dopo la procedura.

2. Determinazione della temperatura dell'arto inferiore

1. Anestesiate il ratto e posizionatelo in posizione supina sulla piattaforma chirurgica.
2. Rasi entrambi gli arti posteriori e posizionali in modo simmetrico.
3. Misurare la temperatura di entrambi gli arti posteriori utilizzando un sistema di termografia a infrarossi.

3. Diametro arterioso e velocità del flusso sanguigno

1. Anestesiate il topo.
2. Prepara l'ecografia e la sonda.
   1. Accendi l'ecografia premendo il pulsante di accensione sul pannello frontale.
   2. Seleziona la sonda a matrice lineare ad alta frequenza (ad esempio, 40 MHz) e collegala al sistema.
   3. Applica una generosa quantità di gel di accoppiamento acustico sulla superficie della sonda.
3. Individua l'arteria femorale superficiale.
   1. Posiziona il ratto in posizione supina su un tappetino riscaldante per mantenere la temperatura corporea.
   2. Rasi il pelo dalla zona mediale della coscia bilateralmente, circa 1-2 cm sopra l'articolazione del ginocchio, usando una cesoia elettrica.
   3. Posiziona delicatamente la sonda perpendicolare alla superficie cutanea sopra l'area rasata.
   4. Regolare la posizione della sonda in modalità B per visualizzare l'arteria femorale come una struttura tubolare pulsatile e anecoica.
4. Misura il diametro arterioso.
   1. Congela l'immagine in modalità B premendo il pulsante Freeze sulla macchina o sull'interfaccia software.
   2. Seleziona lo strumento Misurazione dal menu a schermo.
   3. Usa la funzione del caliper per misurare il diametro interno dalla parete più vicina a quella lontana dell'arteria.
   4. Ripeti la misura tre volte nello stesso punto e registra il valore medio.
5. Misura la velocità del flusso sanguigno.
   1. Passa alla modalità Doppler a onda pulsata cliccando sull'icona Doppler PW .
   2. Posiziona la porta del campione sopra il centro del lume dell'arteria.
   3. Regola l'angolo Doppler a ≤ 60° usando lo strumento di correzione dell'angolo.
   4. Premi Aggiorna o Cattura per registrare la forma d'onda della velocità su almeno tre cicli cardiaci.
   5. Utilizza la funzione di tracciamento automatico del software per calcolare la velocità sistolica massima (PSV) e la velocità post-diastolica (EDV).
   6. Salva i dati cliccando su Salva ed esportando i risultati in un file di foglio di calcolo (ad esempio, CSV, Excel).

4. Pesatura muscolare

1. Dopo l'anestesia profonda, sopportare il ratto tramite una lussazione cervicale.
2. Dissezionare i muscoli gastrocnemici da entrambi gli arti posteriori, preservando i tendini d'Achille (Figura 2).
3. Posiziona immediatamente i muscoli su una bilancia elettronica per misurare il peso bagnato.
4. Usa i muscoli controlaterali come controlli.
5. Confronta le misurazioni di quattro punti temporali e presentale in un grafico a curva.

5. Analisi istopatologica

1. In ciascuno dei quattro momenti, eutanasia rapidamente un gruppo di ratti.
2. Preleva immediatamente le arterie femorali superficiali bilaterali.
3. Fissa i tessuti arteriosi con il 4% di paraformaldeide.
4. Immergi i tessuti nella paraffina e dividili a 5 μm di spessore.
5. Eseguire la colorazione di ematossilina ed eosina (H&E) per esaminare i cambiamenti istopatologici.

6. Analisi statistica

1. Esprimi tutti i dati come media ± deviazione standard (SD). Si considerino differenze statisticamente significative a un p-valore di <0,05.

Risultati

Questo studio ha utilizzato iniezioni intraarteriose di etanolo per stabilire un modello nei ratti diabetici SD (n = 40). Il modello è stato caratterizzato da un tasso di successo dell'85% (33/40), basato sulla conferma ultrasonica della riduzione del diametro arterioso controlaterale e della velocità del flusso sanguigno entro 14 giorni dall'iniezione. È stato registrato un tasso di mortalità correlato al modello dell'8% (5/40), prevalentemente durante il periodo iniziale. Sebbene la citotossicità dell'etanolo comporti ...

Discussione

In sintesi, abbiamo stabilito con successo un modello ratto di occlusione arteriale progressiva che imita da vicino le manifestazioni cliniche osservate nei pazienti diabetici. Valutazioni coerenti dell'ipoperfusione dell'arto posteriore sono state ottenute tramite misurazioni ultrasonografiche e valutazioni del peso muscolare umido per periodi superiori a due settimane. La legatura dell'arteria femorale ha indotto un'occlusione vascolare superficiale, consentendo al contempo la ricircol...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
GraphPad versione 8.0.1			RRID:SCR_002798
Termometro a infrarossi basato su telefono	HIKMICRO		HM-TJP10B-3AMF
Ratto di Sprague-Dawley	Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd.		250 g
Macchina per ultrasuoni	Vevo 2100