Applicazione dell'elettroforesi su gel di poliacrilammide nell'analisi delle sottofrazioni lipoproteiche rilevanti per la malattia cardiovascolare aterosclerotica

Sommario

Questo protocollo mira a elaborare un metodo di analisi delle sottofrazioni lipoproteiche basato sull'elettroforesi su gel di poliacrilammide, che fornisce un'importante base diagnostica per la valutazione del rischio di malattie cardiovascolari. Può dividere l'LDL in sette sottofrazioni. LDL1 e LDL2 sono caratterizzate come particelle di grandi dimensioni, mentre da LDL3 a LDL7 sono caratterizzate da particelle piccole.

Abstract

Il colesterolo LDL-C (lipoproteine a bassa densità) è un fattore chiave nello sviluppo della malattia cardiovascolare aterosclerotica (ASCVD). Livelli elevati di LDL-C sono strettamente legati alla formazione di placche aterosclerotiche e al rischio di eventi cardiovascolari. Tuttavia, l'eterogeneità delle LDL influenza in modo significativo la sua capacità di promuovere l'aterosclerosi. La ricerca indica che le particelle di lipoproteine a bassa densità (LDL) possono essere ulteriormente classificate in LDL dense piccole (sdLDL) e LDL galleggianti grandi (lbLDL). Tra questi, l'sdLDL ha maggiori probabilità di penetrare nell'endotelio vascolare e ha una maggiore attività di modificazione ossidativa, che è particolarmente associata all'ASCVD. Nei pazienti con sindrome metabolica, diabete e ipertrigliceridemia, i livelli di LDL-C possono essere normali, ma la proporzione di sdLDL è elevata, portando a una sottostima del rischio cardiovascolare. Pertanto, rilevare con precisione le sottofrazioni di LDL è fondamentale per stratificare il rischio di ASCVD e ottimizzare le strategie di intervento.

I metodi tradizionali di rilevamento del colesterolo LDL, come la formula di Friedewald e la misurazione diretta, riflettono solo i livelli di colesterolo totale e non possono distinguere tra le sottofrazioni. I metodi per rilevare le sottofrazioni di LDL-C includono l'ultracentrifugazione (UC), la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e le tecniche di risonanza magnetica nucleare (NMR). Tuttavia, questi metodi hanno requisiti tecnici elevati, operazioni complesse o apparecchiature costose, che li rendono poco pratici per un uso clinico diffuso.

La tecnologia dell'elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE) separa le particelle di lipoproteine attraverso l'effetto setaccio molecolare e le differenze di carica. Questa tecnica utilizza sistemi di gel a gradiente non denaturanti, combinati con coloranti specifici come il nero Sudan, che offrono alta risoluzione, forte riproducibilità e facilità d'uso. La tipizzazione delle lipoproteine con la tecnologia PAGE può fornire una valutazione più completa e precisa dei livelli di lipoproteine dei pazienti, aiutando nelle decisioni cliniche di trattamento. Questo articolo ha presentato cinque risultati rappresentativi. La dimensione media delle particelle LDL del campione A, B, C, D, E è di 275,3 Å, 266,6 Å, 258,2 Å, 257,4 Å e 252,9 Å, indicando rispettivamente un rischio basso, marginale, lieve, moderato e grave di malattie cardiovascolari dovute a dislipidemia.

Introduzione

Secondo il rapporto dell'Organizzazione Mondiale della Sanità del 2021, le malattie cardiovascolari (CVD) rimangono la principale causa di morte tra le malattie umane. Il rapporto indica che 17,9 milioni di persone in tutto il mondo sono morte a causa di CVD nel 2019, pari a quasi un terzo dei decessi^globali1. L'ASCVD, un tipo di CVD, è la principale causa di morte tra i residenti urbani e rurali in Cina, rappresentando oltre il 40% di tutti i decessi². L'aterosclerosi è una malattia infiammatoria vascolare cronica guidata da fattori di rischio tradizionali e non tradizionali³. È caratterizzata dalla deposizione di lipidi nella parete arteriosa⁴, dalla proliferazione del tessuto fibroso e dalla calcificazione, che alla fine porta all'ispessimento della parete del vaso, alla riduzione dell'elasticità e al restringimento del lume. La dislipidemia è il fattore di rischio più significativo per l'ASCVD, mentre l'LDL-C è un fattore di rischio patogeno per l'ASCVD, svolgendo un ruolo cruciale nello sviluppo dell'ASCVD⁵. Numerosi studi epidemiologici, studi di randomizzazione mendeliana e studi randomizzati controllati hanno costantemente dimostrato che i livelli plasmatici di LDL-C sono positivamente correlati con il rischio di ASCVD. Ridurre i livelli di LDL-C può ridurre il rischio di ASCVD⁶.

L'LDL è la lipoproteina primaria responsabile del trasporto del colesterolo endogeno nell'organismo⁷. L'LDL plasmatico è eterogeneo, costituito da una varietà di particelle con diverse dimensioni, densità e composizioni chimiche⁸. Le particelle LbLDL hanno una densità inferiore e dimensioni maggiori, mentre le particelle sdLDL hanno una densità maggiore e dimensioni più piccole. L'eterogeneità delle LDL è alla base dei suoi vari effetti biologici⁹. Le particelle di LbLDL hanno un diametro maggiore (≥ 25,5 nm), una densità inferiore (vicino a 1,02 g/mL) e una morfologia libera, costituite da LDL1 e LDL2. Le particelle di LbLDL contengono una quantità maggiore di esteri del colesterolo. È meno probabile che vengano ossidati o penetrino nell'endotelio vascolare, rendendoli relativamente più sicuri. Al contrario, le particelle sdLDL hanno un diametro più piccolo (< 25,5 nm)¹⁰, una densità più elevata (vicina a 1,06 g/mL) e una struttura densa, costituita da LDL3 a LDL7. Le particelle di SdLDL contengono una quantità inferiore di estere di colesterolo ma livelli più elevati di trigliceridi e apolipoproteina B (ApoB) rispetto all'lbLDL. Le loro proprietà fisiche li rendono più propensi a penetrare la barriera endoteliale arteriosa. Sotto il subendotelio, le particelle di sdLDL vengono ossidate dalle specie reattive dell'ossigeno (ROS) per formare LDL ossidate (ox-LDL)¹¹. L'ox-LDL inibisce l'attività endoteliale dell'ossido nitrico sintasi (eNOS), riduce la produzione di NO e induce le cellule endoteliali ad esprimere VCAM-1/MCP-1, promuovendo l'adesione e la migrazione dei monociti¹². Le cellule endoteliali mononucleate in migrazione si differenziano in macrofagi, che assorbono ox-LDL senza limiti attraverso i recettori scavenger. L'accumulo di estere di colesterolo intracellulare si trasforma in cellule schiumose, che sono i componenti principali delle striature lipidiche aterosclerotiche. Le cellule schiumogene secernono fattori infiammatori come IL-1β e TNF-α, che espandono ulteriormente lo stress ossidativo e il danno endoteliale, formando un ciclo di feedback positivo¹³. Può attivare l'infiammazione delle cellule endoteliali, promuovere la formazione di cellule schiumose e accelerare la progressione della placca. Due ampi studi di coorte hanno dimostrato che l'sdLDL-C ha un valore clinico di riferimento maggiore rispetto all'LDL-C nel prevedere e valutare i potenziali rischi di ASCVD^14-15. Ma il metodo tradizionale di rilevamento del colesterolo LDL non è in grado di testare le sottofrazioni lipoproteiche a causa della limitazione del metodo.

Le particelle LDL (LDL-P) riflettono il numero di particelle LDL per unità di volume di sangue e fungono da trasportatori per le molecole LDL, ciascuna contenente una molecola di ApoB e più molecole di colesterolo. L'LDL-C rappresenta la massa totale di colesterolo trasportata da queste particelle. I livelli di LDL-C sono influenzati dal numero di particelle LDL e dalla densità del colesterolo, che potrebbero non riflettere completamente il rischio effettivo¹⁶. Ad esempio, i pazienti con sindrome metabolica, diabete o ipertrigliceridemia possono avere livelli normali di LDL-C ma LDL-P anormalmente elevati (a causa di particelle più piccole e contenuto di colesterolo inferiore). Anche se i livelli di LDL-C raggiungono l'obiettivo, un alto livello di LDL-P può comunque aumentare il rischio cardiovascolare residuo. Gli studi hanno dimostrato che l'LDL-P è più predittivo di qualsiasi altro parametro correlato all'LDL¹⁷. L'analisi delle sottofrazioni lipoproteiche è fondamentale per comprendere la patogenesi dell'ASCVD, valutare il rischio residuo e guidare un trattamento di precisione. Negli ultimi anni, le linee guida nazionali hanno anche raccomandato le sottofrazioni di LDL come indicatori per la valutazione del rischio di ASCVD o il monitoraggio del trattamento¹⁸.

L'ASCVD è la principale causa di morte a livello globale. Le sue strategie di prevenzione e controllo dipendono fortemente dalla gestione dei lipidi. Attualmente, lo screening di individui con dislipidemia nella pratica clinica si basa principalmente sui tradizionali quattro test lipidici, tra cui trigliceridi (TG), colesterolo totale (TC), colesterolo lipoproteico ad alta densità (HDL-C) e LDL-C. Inoltre, altri marcatori lipidici come la lipoproteina (a), l'apolipoproteina A1 (ApoA1) e l'ApoB sono utilizzati principalmente per le popolazioni ad alto rischio di ASCVD¹⁹, come i pazienti diabetici, i pazienti ipertesi e i fumatori o coloro i cui livelli di LDL-C sono stati controllati ma rappresentano ancora un rischio elevato.

Con il progredire della ricerca, i limiti dei test lipidici tradizionali sono diventati sempre più evidenti, in particolare per quanto riguarda l'efficacia dell'allerta precoce e la spiegazione del rischio residuo. A un numero considerevole di pazienti con ASCVD viene inizialmente diagnosticato un livello normale di lipidi, rendendo l'LDL-C inefficace per l'allarme primario. I dati epidemiologici mostrano che circa il 20% dei pazienti con sindrome coronarica acuta ha livelli di LDL-C entro l'intervallo normale (<3,4 mmol/L) al momento del ricovero, suggerendo che i test lipidici tradizionali possono non rilevare gli individui ad alto rischio. Inoltre, anche dopo aver raggiunto gli obiettivi di LDL-C, i pazienti con ASCVD possono ancora affrontare un elevato rischio cardiovascolare residuo. In questi pazienti, la maggior parte degli eventi coronarici residui non può essere spiegata da una riduzione dei livelli di LDL-C. Pertanto, il semplice test LDL-C potrebbe non soddisfare pienamente le esigenze cliniche per la diagnosi e il trattamento dell'ASCVD, perché i test lipidici di routine non possono distinguere tra lbLDL-C e sdLDL-C.

Diversi studi hanno confermato una chiara correlazione tra le sottofrazioni lipoproteiche e l'ASCVD. I risultati anomali del test delle sottofrazioni lipoproteiche possono fungere da avvertimento per la prevenzione primaria dell'ASCVD in individui con livelli lipidici normali, aiutando a identificare i gruppi nascosti ad alto rischio. Per la prevenzione secondaria dell'ASCVD, in cui i livelli di LDL-C rientrano già negli intervalli target, il test delle sottofrazioni lipoproteiche può aiutare a valutare il rischio residuo e guidare l'ulteriore trattamento²⁰. Pertanto, si prevede che l'individuazione di nuove sottofrazioni di LDL fornisca nuovi bersagli per la prevenzione e il trattamento della dislipidemia e dell'ASCVD rispetto ai test lipidici tradizionali.

Il sistema di rilevamento e analisi del nostro laboratorio utilizza principalmente PAGE per separare le sottofrazioni di lipoproteine in base alle loro dimensioni e carica. Le particelle di lipoproteine sono separate principalmente in base alle dimensioni a causa della setacciatura molecolare nella matrice di poliacrilammide da parte di PAGE. Le piccole molecole migrano velocemente mentre le grandi molecole sono ostacolate dall'ostruzione sterica e migrano lentamente. E più carica trasporta una molecola, più velocemente migra. Questo metodo può dividere rapidamente le lipoproteine in dodici sottofrazioni. L'LDL è diviso in sette sottofrazioni, etichettate come da LDL1 a LDL7. Hanno tutti dimensioni, densità, proprietà fisico-chimiche, comportamenti metabolici e potenziale aterosclerotico distinti. LDL1 e LDL2 sono classificati come lbLDL, mentre da LDL3 a LDL7 sono classificati come sdLDL. Le tecniche di rilevamento delle sottofrazioni lipoproteiche includono CU, HPLC e NMR. Tuttavia, a causa degli elevati requisiti delle apparecchiature, del funzionamento complesso e del consumo di tempo, la loro applicazione clinica è relativamente limitata²¹. Il metodo PAGE separa in modo efficiente varie sottofrazioni di LDL, rendendolo più facile da usare rispetto ad altre tecniche. L'attrezzatura utilizzata è economica e portatile, il che la rende più adatta per un uso diffuso nei laboratori clinici di routine. Questo studio mira a convalidare PAGE come metodo rapido ed economico per l'analisi delle sottofrazioni LDL in campioni di siero per supportare il processo decisionale clinico.

Protocollo

Tutti i campioni di questo studio sono valutati e approvati dal Comitato di revisione etica dell'Ospedale popolare provinciale del Guangdong (numero di approvazione: KY2025-435-01). Tutti i partecipanti hanno firmato il consenso informato scritto prima dell'esperimento.

1. Preparazione del kit

1. Preparazione del tampone in gel
   1. Preparazione di acrilammide al 30% (ACR): pesare 30 g di acrilammide, aggiungere 80 ml di acqua deionizzata, mescolare per sciogliere e regolare a 100 ml. Conservare a 4 °C al buio fino al momento dell'uso.
   2. Preparazione di bisacrilammide all'1% (BIS): pesare 1 g di bisacrilammide, aggiungere 80 ml di acqua deionizzata, mescolare per sciogliere e regolare a 100 ml. Conservare a 4 °C al buio fino al momento dell'uso.
   3. Preparazione del 25% di saccarosio: pesare 25 g di saccarosio, aggiungere 70 ml di acqua deionizzata, mescolare per sciogliere e regolare a 100 ml per la conservazione a 4 °C.
   4. Preparazione di persolfato di ammonio al 10% (APS): sciogliere 0,1 g di persolfato di ammonio in 1 ml di acqua deionizzata e utilizzare immediatamente.
   5. Preparazione di 1M Tris (pH = 6,8): pesare 121,14 g di trisidrossimetilamminometano, aggiungere 800 ml di acqua deionizzata, mescolare per sciogliere e regolare il valore del pH a 6,8, quindi portare a 1000 ml.
   6. Preparazione di 1M Tris (pH = 8,6): pesare 121,14 g di trisidrossimetilamminometano, aggiungere 800 ml di acqua deionizzata, mescolare per sciogliere e regolare il valore del pH a 8,6, quindi portare a 1000 ml.
      NOTA: Quando si maneggia l'acrilammide, indossare guanti di gomma butilica, occhiali di sicurezza, indumenti protettivi e operare in una cappa aspirante. In caso di contatto con la pelle, lavare immediatamente con acqua e sapone, quindi consultare un medico. In caso di inalazione, spostarsi all'aria aperta.
2. Preparazione del gel di separazione
   1. Prendi un tubo di vetro pulito e sigilla lo strato inferiore con una pellicola sigillante.
   2. Aggiungere 8,29 mL di ACR al 30%, 17,76 mL di BIS all'1%, 10 mL di saccarosio al 25%, 1 mL di APS al 10%, 10 mL di Tris 1M (pH = 8,6), 0,1 mL di tetrametiletilendiammina (TEMED) e 32,85 mL di acqua deionizzata in un becher pulito in sequenza. Mescolare bene per ottenere 80 ml di liquore madre (con una concentrazione di poliacrilammide del 3,3%) e aggiungere alla provetta di vetro a 1,2 ml per radice. Polimerizzare a temperatura ambiente per 60 minuti e sigillare il liquido con acqua purificata per garantire una superficie piana del liquido.
3. Preparazione della colla concentrata
   1. Aggiungere 4,07 mL di ACR al 30%, 3,05 mL di BIS all'1%, 5 mL di saccarosio al 25%, 0,5 mL di APS al 10%, 5 mL di Tris 1M (pH = 6,8), 0,05 mL di TEMED e 32,33 mL di acqua deionizzata in un becher pulito in sequenza, mescolare bene per ottenere 50 mL di liquore madre (con concentrazione di poliacrilammide del 3,05%), aggiungere alla provetta di vetro a 0,2 ml per radice. Polimerizzare a temperatura ambiente per 60 minuti e sigillare il liquido con acqua purificata per garantire una superficie piana del liquido.
4. Preparazione della soluzione conservante
   1. Pesare 6,4 g di Tris, 75 g di saccarosio, 2,5 ml di glicerina e 0,3 ml di PC-300 (conservante antibatterico) e aggiungere 800 ml di acqua deionizzata, mescolare per sciogliere, regolare il valore del PH a 6,8 e infine diluire a 1000 ml. La concentrazione di Tris-HCl è di circa 52 mM.
5. Preparazione della soluzione colorante nera Sudan
   1. Pesare 0,03 g di nero Sudan e scioglierlo in una miscela di 2 ml di glicole etilenico, 6 ml di etanolo anidro e 2 ml di dimetilsolfossido. Dopo la filtrazione, dividerlo in 1 ml per flaconcino.
      NOTA: Quando si maneggia il nero Sudan e il dimetilsolfossido, indossare guanti in nitrile e occhiali protettivi per evitare il contatto diretto. Le operazioni devono essere condotte in un ambiente ventilato. Sciacquare immediatamente la pelle e gli occhi con acqua dopo l'esposizione, quindi consultare un medico se necessario.
6. Imballo interno
   1. Imballaggio completo secondo i requisiti di composizione del kit.

2. Composizione del kit

1. Assicurarsi che il prodotto contenga colonne prefabbricate, soluzione conservante e soluzione colorante nera Sudan. Le colonne prefabbricate devono contenere acrilammide, bisacrilammide, saccarosio, persolfato di ammonio, Tris e tetrametiletilendiammina. La lunghezza della colonna prefabbricata è di 75 ± 0,5 mm, il diametro interno è di 5,5 ± 0,02 mm e il diametro esterno è di 7,0 ± 0,02 mm. La soluzione conservante deve contenere Tris, saccarosio, glicerina e conservanti. La soluzione colorante nera Sudan deve contenere nero Sudan, glicole etilenico, etanolo anidro e dimetilsolfossido. Assicurarsi che le specifiche dell'imballaggio siano diverse in base alla quantità di colonne prefabbricate. Una porzione di reagente deve avere una colonna prefabbricata. Non combinare kit di reagenti di lotti diversi, poiché ciò potrebbe influire sui risultati sperimentali.

3. Preparazione del campione

1. Preparazione del paziente: assicurarsi che il paziente sia a stomaco vuoto durante il prelievo di campioni di sangue.
2. Utilizzare provette per il campionamento del gel di separazione del siero ed eseguire la raccolta del campione in conformità con la procedura operativa standard. Il sangue deve essere separato il prima possibile dopo il prelievo del sangue per evitare l'emolisi.
3. Testare i campioni di siero dopo la separazione il prima possibile a temperatura ambiente. Se non è possibile eseguire l'analisi immediata, conservare i campioni a 2-8 °C per un massimo di 7 giorni o a -20 °C per un massimo di 30 giorni.
4. Riportare i campioni a temperatura ambiente e mescolare completamente prima dell'uso, in particolare per i campioni congelati e scongelati. Il congelamento-scongelamento ripetuto non è consentito in quanto potrebbe compromettere l'integrità del campione. Sia i campioni di lipemia che quelli di emolisi possono influenzare i risultati del test. Se si tratta di un campione di lipemia o emolisi lieve, si consiglia di eseguire la centrifugazione ad alta velocità a 14.462 x g a temperatura ambiente per 15 minuti. Per i campioni di lipemia, utilizzare una pipetta per aspirare l'intero strato trasparente dal basso. Per i campioni di emolisi, raccogliere il surnatante. Quindi trasferirlo in una nuova provetta da centrifuga e colorare. Tuttavia, se la lipemia o l'emolisi sono molto gravi, si consiglia di prelevare nuovamente il sangue.

4. Fasi operative

1. Preparazione
   1. Estrarre le colonne prefabbricate e i campioni da testare. Utilizzare una pipetta per aspirare il liquido di conservazione residuo dalla porta del campione delle colonne prefabbricate. Bilanciare le colonne prefabbricate e i campioni a temperatura ambiente e sciogliere 14,3 g di polvere tampone elettroforetico con 800 ml di acqua deionizzata.
2. Tingere
   1. Prendi le provette da centrifuga pulite e numerale. Il numero di provette è coerente con l'ordine delle provette per la raccolta del sangue. Aggiungere le provette da centrifuga con un rapporto di 50 μl di campione per 10 μl di soluzione di colorazione nera Sudan, mescolare bene e lasciare riposare per 30 minuti a temperatura ambiente per colorare.
      NOTA: Il principio di colorazione del nero Sudan si basa sulla sua proprietà lipofila. Può indurre reazioni cromogeniche specifiche con sostanze lipidiche come grassi neutri, fosfolipidi e steroidi all'interno delle cellule, con conseguente formazione di particelle nero-brunastre o nere scure. In questo sistema, abbiamo ottimizzato il tempo di colorazione e il dosaggio utilizzando un disegno sperimentale a fattore singolo con il seguente protocollo. Vengono selezionati tre campioni di siero di LDL-C (alte, medie e basse concentrazioni), con volumi di colorazione corrispondenti rispettivamente di 5 μl, 10 μl, 15 μl e 20 μl. La durata della colorazione è fissata a 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 35 min, 45 min e 60 min. Vengono condotti esperimenti elettroforetici, seguiti da un'analisi in scala di grigi delle bande elettroforetiche per verificare l'efficacia della colorazione. Le condizioni ottimali sono determinate per un volume di colorazione di 10 μl con una durata di colorazione di 30 minuti ± 5 minuti. Il volume e la durata della colorazione inferiori provocano una colorazione debolmente del colesterolo lipoproteico. Sebbene le condizioni ottimali abbiano raggiunto l'equilibrio, non sono necessari un volume e una durata di colorazione più elevati.
3. Separazione ionofortica
   1. Inserire le colonne prebilanciate nella presa in gomma della vasca per elettroforesi. La porta del campione della colonna di gel si trova a circa 2 cm di distanza dal tappo di gomma. Assicurarsi che sia ben chiuso e che non si verifichino perdite. Quando il numero di colonne di gel campione non è pieno, riempire lo spazio vuoto con un tappo di gomma senza fori.
   2. Quindi versare il tampone per elettroforesi nei serbatoi superiore e inferiore. Rimuovere le bolle all'imboccatura delle colonne prefabbricate. Aggiungere 25 μl di campioni colorati alla porta del campione delle colonne prefabbricate.
   3. Coprire il coperchio, collegare l'interruttore di alimentazione e impostare i parametri di tensione (U = 100 V), corrente (I = 3 mA/tubo), potenza (P = 120 W), tempo (T = 70 min) per la separazione per elettroforesi.
      NOTA: Voltage, potenza e tempo sono parametri fissi. La corrente deve essere impostata in base al numero di campioni di prova (ad esempio, 10 provette per campioni, I = 3 mA x 10 tubi = 30 mA).
   4. Al termine dell'elettroforesi, spegnere l'alimentazione, rimuovere il coperchio e versare il tampone per elettroforesi sulla parte superiore del dispositivo per elettroforesi. Estrarre a turno le colonne di gel e posizionarle sul telaio di fissaggio, versare il tampone per elettroforesi in eccesso sulla superficie superiore e analizzare nel sistema di analisi a scansione.
4. Analisi della scansione
   NOTA: Il tipo di analizzatore è DY-03 e il software di scansione è KBL 3.3.9 GD.
   1. Accendere l'interruttore di alimentazione dell'analizzatore di scansione, fare doppio clic sul software di sistema desktop e fare clic su Raccolta per accedere all'interfaccia del software. Fare clic su Esporta vassoio campioni nell'interfaccia del software, posizionare le colonne di gel sul rack dei campioni con l'estremità del campionamento rivolta verso l'interno del dispositivo. Assicurarsi che le colonne di gel siano posizionate nelle posizioni numerate corrispondenti. Le posizioni 25 e 26 sono designate solo per i test di controllo qualità.
   2. Fare clic su Importa vassoio campioni nell'interfaccia software per importare il vassoio campioni nel dispositivo. Fare clic su Scansione per ottenere immagini di scansione di esempio. Il dispositivo è dotato di un sistema di messa a fuoco automatica integrato. Regola automaticamente la messa a fuoco tra il modulo di scansione e il tubo del gel per garantire immagini nitide. Il software identifica automaticamente la posizione iniziale (VLDL) e la posizione di terminazione (HDL) dell'elettroforogramma. Quando vengono rilevati picchi evidenti in queste posizioni, il software si blocca sull'area di analisi designata per l'analisi spettrale.
   3. Dopo aver inserito le informazioni sui pazienti e scansionato il codice a barre, fare clic su Analisi ed elaborazione nell'interfaccia del software, il sistema analizzerà e genererà automaticamente i rapporti di prova. Fare clic su Carica LIS per trasferire i rapporti di test al sistema LIS.
   4. Estrarre le colonne prefabbricate dopo la scansione e l'analisi e trattarle secondo le specifiche dei rifiuti sanitari.

5. Controllo qualità

1. Eseguire un test di controllo qualità di due livelli prima del test giornaliero del campione. Le fasi operative del test di controllo qualità sono le stesse di un test a campione. Il riferimento di tipo A è il diametro medio delle particelle maggiore di 268 Å. Il riferimento di tipo B è il diametro medio delle particelle inferiore a 265 Å.
   NOTA: Analisi dei risultati: TIPO A, la dimensione media delle particelle LDL è > 268 Å, LDL1 e LDL2 rappresentano di più, indicando un basso rischio di CVD. TIPO INTERMEDIO (TIPO INT), la dimensione media delle particelle LDL è compresa tra 265 e 268 Å, indicando che la proporzione tra LDL3 e LDL7 è superiore al valore critico. TIPO B, la dimensione media delle particelle LDL è < 265 Å, da LDL3 a LDL7 ne rappresentano di più, indicando un alto rischio di CVD.

6. Miglioramenti tecnici

1. Per garantire risultati diagnostici accurati, è necessario implementare i seguenti miglioramenti tecnici.
   1. Pre-esame: assicurarsi che i pazienti siano completamente a digiuno prima del prelievo di sangue. Utilizzare siero o plasma anticoagulante EDTA invece del plasma anticoagulante eparina. Assicurarsi che la pipetta sia accurata nell'assorbimento. Evitare campioni chilosi o emolitici gravi.
   2. Durante l'esame: Impostare i parametri di elettroforesi di tensione (U = 100 V), corrente (I = 3 mA/tubo), potenza (P = 120 W), tempo (T = 70 min) secondo i protocolli standard. Indossare guanti sterili per evitare la contaminazione dei tubi di vetro che potrebbe influire sulla capacità di scattare foto e scansionare.
   3. Dopo l'esame: quando si emettono i rapporti, esaminare i cromatogrammi anomali per individuare potenziali interferenze ed eseguire una nuova analisi per evitare di fornire conclusioni diagnostiche errate.
      1. Il cromatogramma normale: nella posizione iniziale delle VLDL e nella posizione di terminazione delle HDL, entrambe hanno un picco distinto (vedere la sezione Risultati rappresentativi).
      2. Il cromatogramma delle anomalie: nella posizione iniziale delle VLDL o nella posizione di terminazione delle HDL non ha o ha più di un picco.

Risultati

Questo studio mira a inventare un metodo che utilizza PAGE per rilevare le sottofrazioni lipoproteiche nel siero dei partecipanti. L'obiettivo è determinare se le sottofrazioni di LDL-C sono principalmente particelle grandi (LDL1 e LDL2) o piccole particelle (da LDL3 a LDL7). Dopo la colorazione con il nero Sudan, i campioni vengono separati dal dispositivo di elettroforesi in un gel di poliacrilammide. Le lipoproteine vengono quindi separate in bande distinte all'interno delle provette di gel e l'analisi delle sottofraz...

Discussione

Sebbene il ruolo delle sdLDL come fattore di rischio cardiovascolare nello sviluppo dell'aterosclerosi sia stato confermato dalla ricerca, attualmente non esiste un metodo consolidato per identificare le sottofrazioni di LDL. Negli ultimi decenni, sono stati compiuti progressi significativi nello sviluppo di metodi di rilevamento per le sottofrazioni LDL. L'UC è considerato il gold standard. È in grado di separare le sottofrazioni LDL in base alle loro differenze di densità, distinguendo...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Polvere tampone elettroforetico	Azienda tecnologica Guangxi Kangbolai	25030401	Per la preparazione di soluzioni tampone e la fornitura di condizioni di elettroforesi
Prodotti di alto valore per il controllo della qualità	Azienda tecnologica Guangxi Kangbolai	25030301	Per il monitoraggio dell'accuratezza e della precisione
Soluzione di separazione della densità del campione di lipoproteine (elettroforesi su gel a gradiente)	Azienda tecnologica Guangxi Kangbolai	LSS60-SB1-A1  25030301	Per separare i componenti del sottotipo lipoproteico dai campioni di siero
Prodotti per il controllo qualità a basso valore	Azienda tecnologica Guangxi Kangbolai	25030301	Per il monitoraggio dell'accuratezza e della precisione
Soluzione colorante nera Sudan	Azienda tecnologica Guangxi Kangbolai	LSS60-SB1-A1  25030301	Per la colorazione dei campioni