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Articolo metodologico

Integrazione della Farmacologia di Rete per Indagare l'Effetto Protettivo della Cinnamaldeide contro la Neurotossicità Indotta da Ossalaliplatina

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DOI:

10.3791/69013

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28 novembre 2025

 ,  ,  , 
1Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Medical Oncology, Cancer Hospital of China Medical University, Cancer Hospital of Dalian University of Technology, Liaoning Cancer Hospital & Institute, 2China Medical University, 3Liaoning University of Traditional Chinese Medicine

In questo articolo

Sommario

Questo studio indaga gli effetti protettivi della cinnamaldeide (CA) contro i danni indotti da oxaliplatino (OXA) nelle cellule del ganglio della radice dorsale (DRG) del ratto. Il meccanismo sottostante prevede la soppressione della via di segnalazione JAK2/STAT3 e l'attivazione della via SLC7A11-GSH-GPX4, come rivelato tramite farmacologia di rete e validazione sperimentale.

Abstract

Questo studio indaga gli effetti protettivi della cinnamaldeide (CA) contro i danni indotti da oxaliplatino (OXA) nelle cellule del ganglio della radice dorsale (DRG) del ratto. Le attività farmacologiche della CA sono state analizzate e i suoi potenziali bersagli, insieme a quelli dei suoi metaboliti, sono stati identificati utilizzando il Traditional Chinese Chinese Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP), la Network Computational Research Platform of Traditional Chinese Medicine (TCMIP) basata su Farmacologia Integrativa e le piattaforme PharmMapper. Il saggio CCK-8 viene utilizzato per determinare le concentrazioni ottimali dei farmaci, mentre i sami malondialdeide (MDA) vengono applicati per valutare il livello di perossidazione lipidica. I livelli intracellulari di Fe2+ e delle specie reattive di ossigeno (ROS) sono stati quantificati utilizzando sonde fluorescenti. L'impatto della CA sui livelli di espressione proteica, inclusi p-STAT3, XCT e GPX4, nelle cellule DRG trattate con OXA è stato esaminato tramite immunoblotting. L'analisi farmacologica di rete ha identificato 14 bersagli sovrapposti tra "CA-neuropatica del dolore (NP)-ferroptosi". I risultati sperimentali hanno dimostrato che un trattamento di 24 ore con 4,0 μmol/L CA ha prodotto effetti ottimali, riducendo significativamente i livelli di MDA, Fe2+ e ROS nelle cellule DRG (P < 0,05). Inoltre, il trattamento con CA ha ridotto l'espressione di JAK2, STAT3, p-STAT3, TFRC, ErbB-1 e fattore nucleare-kappa B (NF-κB) (P < 0,05) mentre aumentava l'espressione di XCT, GPX4 e FTH1 (P < 0,05). Questi risultati suggeriscono che la CA mitighi i danni indotti da OXA nelle cellule DRG inibendo la via di segnalazione JAK2/STAT3 e attivando l'asse SLC7A11-GSH-GPX4.

Introduzione

Negli ultimi anni, la ferroptosi, in quanto modalità di morte cellulare non apoptotica, si è dimostrata coinvolta nel danno tissutale indotto da vari farmaci chemioterapeutici. Il meccanismo centrale della ferroptosi è l'accumulo di prodotti di perossidazione lipidica dipendenti dalferro 1. Le ricerche sui meccanismi della neurotossicità da cisplatino rivelano che questo farmaco induce la ferroptosi neuronale attraverso molteplici vie di ricerca, con questo processo direttamente collegato allo sviluppo della neurotossicità. In particolare, il cisplatino inibisce l'attività della glutatione perossidasi 4 (GPX4). Come "molecola freno" critica nella ferroptosi, l'inattivazione di GPX4 impedisce la liberazione degli idroperossidi lipidici (L-OOH), causando così danni ossidativi alle membrane cellularineuronali 2. Nel frattempo, l'ossalplatino può favorire il rilascio di ferroptosi nelle cellule nervose e aggravare la generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) attraverso la reazione di Fenton, amplificando ulteriormente la cascata diferroptosi 3. Queste evidenze suggeriscono che una regolazione mirata della neurodegenerazione possa essere una strategia potenziale per alleviare la neurotossicità dell'ossalplatino.

L'osaliplatino (OXA), un agente chemioterapeutico di terza generazione a base di platino ampiamente utilizzato per il cancro colorettale, offre una robusta efficacia antitumorale ma è frequentemente associato a una significativa neurotossicità. La somministrazione cronica spesso porta a dolore neuropatico indotto da OXA (OINP), con un tasso di incidenza che raggiunge il 60%4, caratterizzato da allodinia meccanica, iperalgesia termica e ipersensibilità alfreddo5. Nonostante la sua prevalenza, le attuali strategie di trattamento per l'OINP rimangono inadeguate, riducendo sostanzialmente la qualità della vita del paziente. Di conseguenza, chiarire i meccanismi molecolari alla base dell'OINP e identificare nuovi bersagli terapeutici rimangono aree critiche di ricerca incorso 6.

La cinnamaldeide (CA), il principale componente attivo dell'olio essenziale di cannella, è un liquido giallo eviscoso 7,8 con attività biologiche diversificate, tra cui insetticida9, antimicrobico10, antifungino11, antiossidante12, antidiabetico13,anticanceroso 14, antinfiammatorio e effetti protettivineurovascolari 15,16. Le evidenze emergenti suggeriscono che la CA potrebbe inibire l'attivazione della via di segnalazioneJAK/STAT 17. La formula chimica della CA è C9H8O, e la sua struttura chimica è mostrata nella Figura 1. In quanto monomero naturale della medicina tradizionale cinese, l'AC presenta una vasta gamma di attività farmacologiche. In termini di neuroprotezione, numerosi studi hanno confermato che la CA può entrare nel sistema nervoso centrale attraverso la barriera emato-encefalica, promuovere l'espressione di enzimi antiossidanti (come HO-1 e NQO1) attivando la via di segnalazione Nrf2/AR, ridurre l'accumulo di ROS nelle cellule nervose e quindi alleviare i danni neuroossidativi nell'ictus ischemico. Malattia di Alzheimer e altre malattie18,19. Allo stesso tempo, la CA può inibire l'iperattivazione della microglia, ridurre il rilascio di fattori infiammatori (come TNF-α, IL-1β) e ridurre la rispostaneuroinfiammatoria 20. Tuttavia, non è stato riportato se la CA possa alleviare la neurotossicità indotta dall'ossaliplatino regolando la via della ferroptosi.

La via di segnalazione JAK2/STAT3 è un importante meccanismo di trasduzione del segnale intracellulare che trasmette i segnali ricevuti dalla membrana cellulare al nucleo cellulare, ed è strettamente correlata a processi biologici chiave come la proliferazione cellulare, la differenziazione, l'apoptosi, lo stress ossidativo e le risposteinfiammatorie 21. Come via strettamente correlata alle risposte infiammatorie, la via di segnalazione JAK3/STAT3 può scatenare risposte infiammatorie in uno stato attivato, causando danni infiammatori ai tessuti. Gli studi indicano che inibire la via di segnalazione JAK3/STAT3 può ridurre la risposta infiammatoria e i danni ossidatori nei ratti con demenza vascolare, migliorando così la funzione cognitiva deiratti. Inoltre, inibire la via di segnalazione JAK3/STAT3 può anche alleviare la risposta infiammatoria nei ratti epilettici, ridurre il tasso di apoptosi neuronale e mitigare la lesionecerebrale 23. Sebbene l'acido caffeico (CA) abbia un certo effetto protettivo sul sistema nervoso, non è ancora chiaramente concluso se il suo effetto di miglioramento sia legato alla regolazione della via di segnalazione JAK3/STAT3.

Questo studio mira a verificare se l'inibizione in vitro della segnalazione JAK2/STAT3 e l'attivazione dell'asse LC7A11-GSH-GPX4 possano mitigare i danni indotti da AXA nelle cellule DRG dei ratti. Inoltre, esplora i potenziali effetti antiferroptotici della CA ed esamina il ruolo dei principali bersagli identificati tramite la farmacologia di rete nel modulare l'infiammazione nelle cellule DRG.

Gli approcci terapeutici attuali per la neurotossicità indotta da ossalplatino si concentrano principalmente sulla chelazione degli ioni platino liberi per mitigare i danni nervosi, come l'uso di complessi calciomagnesio, con l'obiettivo principale di alleviare le neuropatie periferiche acute (ad esempio, intorpidimento e formicolio a mani e piedi)24. Tuttavia, i meccanismi esatti rimangono poco chiari. Questi trattamenti non hanno la capacità di invertire condizioni croniche come la degenerazione assonale e il deterioramento delle fibre nervose causate dall'ossalplatino, e dimostrano un'efficacia limitata nella prevenzione della neurotossicità cumulativa. In questo esperimento, è stato esplorato l'effetto neuroprotettivo di 4 μM di CA sotto trattamento a 5 μM con OXA combinando meccanismi antinfiammatori e anti-ferroptosi. I risultati confermano che l'attivazione di questo meccanismo rappresenta un passaggio iniziale cruciale nell'OINP. La scoperta di inibitori specifici potrebbe sostituire gli approcci non specifici esistenti, migliorando così sia la precisione che l'efficacia degli interventi terapeutici.

Il modello in vitro utilizzato in questo esperimento coinvolge neuroni gangliari dorsali (DRG) isolati di ratto per lo studio dell'OINP. Tuttavia, questo modello differisce significativamente dalle cellule primarie umane per il background genetico, le caratteristiche metaboliche e la sensibilità alla tossicità, il che può rendere difficile applicare direttamente le conclusioni della ricerca. Inoltre, il mantenimento funzionale dei tessuti neurali in vivo si basa su una regolazione precisa della coordinazione multicellulare e dei microambienti dinamici - fattori complessi che sono difficili da replicare pienamente i modelli in vitro .

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Protocollo

NOTA: La linea cellulare è stata derivata da linee cellulari di ratto.

1. Analisi della farmacologia delle reti

NOTA: I link si trovano nella Tabella dei Materiali.

  1. Trovare possibili obiettivi della CA
    1. Recuperare informazioni strutturali dal database PubChem ed esplorare i potenziali meccanismi biologici della CA. Successivamente, effettuare l'analisi della previsione dei bersagli utilizzando SwissTargetPrediction, sfruttando le sue avanzate capacità computazionali.
    2. Per migliorare l'accuratezza e la completezza dell'analisi, incrociare i target previsti con database specifici della Medicina Tradizionale Cinese, inclusi TCMSP e TCMIP.
    3. Esaminare la letteratura pertinente per identificare ulteriori potenziali obiettivi. Duplicare la lista consolidata degli obiettivi per creare un dataset completo, che funga da riferimento critico per ulteriori studi sull'attività biologica e lo sviluppo di farmaci che coinvolgono la CA.
  2. Identificazione di potenziali bersagli del dolore neuropatico (NP)
    1. Utilizzando il database GeneCards e il database TTD, effettua una ricerca approfondita utilizzando le parole chiave "dolore neuropatico" e "ferroptosi". Dai priorità ai geni target dal database GeneCards con un "punteggio di rilevanza" superiore alla mediana, poiché questi geni dimostrano una maggiore pertinenza al focus di ricerca.
    2. Integrare i target genici precedentemente selezionati con i dati recuperati dal TTD (Therapeutic Target Database). Garantire un'identificazione completa dei potenziali target durante il processo di integrazione incrociando tutti i target genici selezionati con le voci del database TTD. Rimuovono sistematicamente le voci duplicate dal dataset integrato dei geni bersaglio. Verifica che il dataset risultante contenga una lista unica di potenziali target.
  3. Identificazione degli obiettivi di intersezione della "CA-NP- Ferroptosi"
    1. Determina l'intersezione dei target per CA, NP e ferroptosi utilizzando un diagramma di Venn generato online.
    2. Questi obiettivi di intersezione sono stati designati come potenziali candidati per il "percorso NP-ferroptosi regolato dalla CA."
  4. Costruire la rete di Interazione Proteina-Proteina (PPI)
    1. Per approfondire ulteriormente, inviare i target comuni per "CA-NP-ferroptosis", "CA-NP" e "CA-ferroptosis" al database STRING.
    2. Imposta la soglia del punteggio di interazione a "massima confidenza > 0,4" e limita il numero massimo di interattori a 10 sia per il primo che per il secondo livello di interazione. Applicare le impostazioni predefinite per tutti gli altri parametri e costruire una rete a 4,5 PPI per la "CA-NP-ferroptosi".
  5. Analisi di arricchimento GO e KEGG
    1. Carica gli obiettivi di intersezione per "CA-NP-ferroptosi" sulla piattaforma DAVID con i seguenti parametri: "seleziona identificatore: simbolo genetico ufficiale", "tipo di lista: genelist" e "specie: Homo sapiens." L'analisi di arricchimento dell'Ontologia Genica (GO) è stata condotta in tre categorie: Processo Biologico (BP), Componente Cellulare (CC) e Funzione Molecolare (MF).
    2. Esegui l'analisi di arricchimento dei percorsi KEGG e visualizza i dati risultanti utilizzando diagrammi a barre creati sulla piattaforma Hiplot.

2. Attracco molecolare

  1. Per chiarire l'interazione tra composti attivi e i loro bersagli associati alla malattia, ottieni informazioni strutturali sulle sostanze attive dal database PubChem come piccole molecole, recuperando le strutture 3D delle proteine target dal Protein Data Bank (PDB) come modelli proteici.
  2. Utilizzare PyMOL per preprocessare le strutture dei recettori proteici rimuovendo molecole d'acqua e liganti non essenziali. Successivamente, preparare le proteine target e le sostanze attive per l'aggancio utilizzando AutoDock Tools 1.5.7 ed eseguire l'aggancio molecolare semi-flessibile usando AutoDock Vina.
  3. Analizza le energie di legame e i siti attivi di legame delle sostanze sulle proteine recettori. Per la proteina JAK2, la sua struttura (PDB ID: 3e64) è stata selezionata dal database PDB sulla base dei dati di cristallografia a raggi X e della risoluzione ottimale.
  4. Usa il software PyMOL per preparare la struttura JAK2 eliminando liganti, rimuovendo molecole d'acqua e aggiungendo idrogeni. Le strutture a piccole molecole dei composti attivi sono state ricavate da PubChem.
  5. Carica sia le strutture proteiche che quelle composte in AutoDock Tools 1.5.7, definisci le scatole di docking ed esegui l'aggancio molecolare con AutoDock Vina.

3. Coltura cellulare

NOTA: I seguenti passaggi saranno ripetutamente utilizzati nell'esperimento di validazione. Segui rigorosamente tecniche asettiche. Questa parte dell'esperimento utilizzava una centrifuga a rotore orizzontale a bassa velocità.

  1. Disinfettare le confezioni esterne e le bottiglie di coltura delle cellule sterili acquistate con alcol al 75%, poi trasferire in vasche di coltura su un banco da lavoro super pulito per la subcoltura fino a quando le cellule non vengono distribuite su cinque piastre di Petri da 10 cm di diametro per garantire un stock cellulare sufficiente.
  2. Criopreservare le celle a -80 °C per gli esperimenti successivi.
    1. Prepara DMEM, DMSO di qualità per coltura cellulare, siero bovino fetale (FBS), tubi centrifughe da 15 mL, pipette, cryovial e un bagno di ghiaccio. Mescola 1 mL di DMSO, 1 mL di FBS e 8 mL di DMEM per ottenere un volume totale di 10 mL. Raffredda il DMSO sul ghiaccio per 15 minuti. Prima trasferisci il mezzo di base al tubo della centrifuga, poi aggiungi lentamente il DMSO pre-raffreddato durante la rotazione. Mescola bene con una pipetta, poi aggiungi delicatamente FBS e mescola di nuovo. Conserva la miscela nel bagno di ghiaccio per un uso successivo.
      NOTA: Una concentrazione del 20%-50% di DMSO ha portato a un aumento significativo del rilascio di LDH, indicando che concentrazioni elevate di DMSO sono citotossiche, mentre il 10% di DMSO è relativamente sicuro. Questo non ha influenzato il nostro esperimento25.
    2. Prendi cellule in crescita logaritmicamente, lavale 3 volte con PBS, poi aggiungi lo 0,25% di tripsina a 400 μL/10 cm di piatto.
      NOTA: Una volta che avviene la retrazione citoplasmatica, le connessioni si allentano o se ci sono segni di galleggiamento su larga scala, il processo di digestione si interrompe immediatamente.
    3. Preparazione pre-digestione: Preriscaldare i reagenti chiave (0,25% soluzione tripsina-EDTA e mezzo DRG completo) a 37 °C. Rimuovere la fiaschetta di coltura cellulare dall'incubatrice e scartare il vecchio mezzo usando una pipetta sterile per evitare che il substrato residuo influisca sull'efficienza digestionale. Risciacqua delicatamente le cellule coltivate a strato singolo due volte con 5 mL di PBS sterile per rimuovere il siero residuo evitando l'eluzione cellulare.
    4. Aggiungere 2 mL di soluzione preriscaldata al 0,25% di tripsina-EDTA al recipiente di coltura, assicurando che copra completamente lo strato cellulare singolo. Incuba a temperatura ambiente per 1-3 minuti. Durante questo periodo, osserva le cellule al microscopio rovesciato ogni 30 secondi. Interrompere immediatamente la digestione quando la maggior parte delle cellule inizia a contrarsi, diventare rotonde e mostrare spazi intercellulari distinti (per prevenire la digestione eccessiva e i danni cellulari).
    5. Aggiungi rapidamente 4 mL di mezzo completamente preriscaldato al recipiente di coltura. Pipetta delicatamente la miscela 5 volte con una pipetta sterile per disperdere il cluster cellulare in una sospensione a singola cella. Trasferire l'intera sospensione a singola cella su tubi centrifughe sterili da 15 mL e raccogliere la pallina della cella tramite centrifugazione a 300 x g 5 min utilizzando una centrifuga a rotore orizzontale a bassa velocità a 25 °C.
    6. Scartare il sovrantantante e aggiungere 5 mL del mezzo di crioconservazione preparato. Soffia delicatamente con una pipetta per mescolare le cellule in modo uniforme. Distribuiscili equamente in 5 fiale.
    7. Etichetta il cryovial con il nome della cella, la data di congelamento e l'operatore; Mettilo in un contenitore congelabile e conservalo in un congelatore a -80 °C, poi trasferiscilo in azoto liquido dopo la conservazione notturna.
  3. Rianimazione cellulare
    1. Indossa i guanti, rimuovi la fiala dal contenitore di azoto liquido e immergila immediatamente in acqua tiepida a 37 °C, scuotendola di tanto in tanto per assicurare un rapido discongelamento (entro 1 minuto).
    2. Rimuovere la fiala dal bagno d'acqua a 37 °C, aprire il tappo, aspirare la sospensione cellulare con una pipetta, trasferirla in un tubo centrifuga, aggiungere 10 volte il volume del mezzo di coltura, mescolare bene e centrifugare a 300 x g per 5 minuti (25 °C).
    3. Scartare il soprantantante, aggiungere 5 mL di substrato di coltura integrato con siero bovino fetale al 10% (il mezzo completo per questa condizione di coltura cellulare), inoculare il piatto di coltura e incubare staticamente in un incubatore a 37 °C, 95% di umidità e 5% di CO2 .
    4. Sostituire il substrato di coltura il giorno successivo (per rimuovere residui di DMSO e cellule morte) e continuare a osservare la coltura per le condizioni di crescita. Se la densità cellulare è alta, eseguire la subcoltura tempestivamente per esperimenti successivi.
  4. Conteggio delle celle
    NOTA: Questa parte dell'esperimento utilizzava una centrifuga a rotore orizzontale a bassa velocità.
    1. Prepara in anticipo alcol al 75% per pulire la camera di conteggio e coprire il slip, poi asciugali per un uso successivo.
    2. Risospendere le celle digerite e centrifugate in 1 mL di mezzo e diluire 50 μL della sospensione cellulare con 150 μL di mezzo in un tubo EP da 1,5 mL per ottenere una diluizione di 4 volte.
    3. Oscilla uniformemente, prendi 10 μL e inietta tra il coverslip e la camera di conteggio per riempire completamente la camera evitando le bolle. Posizionate sotto il microscopio per osservazione e conteggio. Principi di conteggio: Non omettere né ricontare; contare le celle che toccano i bordi in alto e a sinistra, ma escludere quelle che toccano i bordi in basso e destra.
    4. Secondo i requisiti sperimentali, si calcola il volume cellulare in base al numero di celle desiderato per la piastratura o la semina a piatti e i risultati del conteggio, poi integra il volume totale del mezzo con mezzo intero.

4. Protocollo di saggio sulla viabilità cellulare

NOTA: La duloxetina è stata scelta come agente di controllo della medicina occidentale perché è un farmaco ampiamente utilizzato e clinicamente validato per il trattamento del dolore neuropatico periferico. La sua efficacia consolidata in questa indicazione (supportata da linee guida cliniche e studi controllati randomizzati) garantisce che il gruppo di controllo possa fornire un riferimento affidabile per valutare l'efficacia relativa dell'intervento di test.

  1. Per prima cosa, si elimina il vecchio mezzo di coltura dal vaso di coltura e si risciacqua la superficie cellulare con 5 mL PBS per rimuovere il siero residuo. Poi, aggiungi 2 mL di soluzione allo 0,25% di tripsina-EDTA e incuba a temperatura ambiente per 1-3 minuti. Quando l'osservazione microscopica rivela il restringimento, l'arrotondamento e il distacco cellulare, si aggiungono immediatamente 4 mL di DRG Complete Medium per interrompere la digestione e risospendere le cellule tramite pipetta.
  2. Trasferire la sospensione della cella su un tubo centrifugo e raccogliere il pellet della cella centrifugando a 300 x g per 5 minuti utilizzando una centrifuga a rotore orizzontale a bassa velocità a 25 °C. Scartare il sovrantantante e risospendere la pellet della cella in un tubo centrifuga da 15 mL, poi risospendere accuratamente e mescolare la sospensione.
  3. Prendi un tubo EP da 1,5 mL e aggiungi prima 150 μL di mezzo di coltura, seguito da 50 μL di sospensione cellulare. Mescola bene per ottenere una diluizione di 4 volte.
  4. Poi usa alcol al 75% per pulire la camera di conteggio e coprire il vetro, asciugarli e scuotere di nuovo il tubo EP in modo uniforme.
  5. Estrai 10 μL di sospensione della cella e iniettali tra il vetro di copertura e la camera di conteggio, assicurandoti che il liquido riempia la camera senza generare bolle.
  6. Osserva al microscopio e conta il numero di celle secondo il principio di conteggio, evitando omissioni o duplicati.
    NOTA: Se il numero conteggiato di celle è n, allora la concentrazione cellulare nel tubo centrifuga è n/mL.
  7. Secondo i requisiti sperimentali, si seminano le cellule in una piastra di 96 pozzi a una densità di 2.000 celle per pozzo secondo necessità.
  8. Per prima cosa, iniettare 200 μL di PBS in ogni pozzetto del cerchio periferico di una piastra da 96 pozzi, poi aggiungere un mezzo di coltura contenente cellule secondo il raggruppamento.
  9. Dopo l'incubazione per 24 ore nell'incubatrice a 37 °C, 95% di umidità e 5% CO 2, aspirare il vecchio mezzo e lavare due volte con 200 μL di PBS. Secondo la configurazione sperimentale, si diluisce la CA a passo (0 μM, 2 μM, 4 μM, 8 μM, 16 μM, 32 μM) e si aggiunge 200 μL a una piastra da 96 pozzi.
  10. Pretrattare le cellule con OXA (5 μM) per 24 ore, poi trattare le cellule DRG con concentrazioni variabili di CA (0 μM, 2 μM, 4 μM, 8 μM, 16 μM, 32 μM) per 24 ore, rispettivamente.
    NOTA: Questa sezione dell'esperimento mira a determinare la concentrazione ottimale di farmaco per la CA.
  11. Lavare la piastra a 96 pozzi tre volte con il buffer PBS, poi aggiungere 200 μL di soluzione di lavoro CCK-8 appena preparata in ciascun pozzo. Questo passaggio si svolge al buio e il tempo dell'esperimento viene controllato per essere completato entro 10 minuti. Incubare la soluzione per 4 ore in un incubatore a 37 °C, 95% di umidità e 5% CO2 . Infine, misura i valori di assorbanza usando un lettore di microplacche. Ripeti tutti gli esperimenti almeno tre volte in condizioni identiche.

5. MDA

  1. Seminare 10 ×10 6 cellule DRG in una piastra da 15 cm e coltura durante la notte in un incubatore a 37 °C, 95% di umidità e 5% CO2 . Rimuovere il mezzo di coltura, aggiungere i farmaci e incubare per 24 ore in un incubatore a 37 °C, 95% di umidità e 5% CO2 .
  2. Rimuovi il mezzo di coltura e lava una volta con 5 mL di PBS. Dopo la digestione, raccogliere le cellule in un tubo conico utilizzando un mezzo DMEM.
  3. Aggiungere le cellule DRG trattate a microtubi da 5 mL, rispettivamente. Centrifuga a 300 x g per 5 minuti con una centrifuga a rotore orizzontale a bassa velocità e rimuovi il sovrandante. Poi, aggiungi 1 mL di PBS, mescola tramite pipetto e trasferisci in un nuovo microtubo da 1,5 mL. Centrifuga a 300 x g per 5 minuti con una centrifuga a rotore orizzontale a bassa velocità e rimuovi il sovrandante.
  4. Aggiungi 100 μL di soluzione PBS antiossidante, pipetta per mescolare e prepara la sospensione cellulare. Prepara la soluzione standard MDA.
    NOTA: Vedi la preparazione della soluzione standard MDA utilizzando il metodo della fluorescenza; consulta la sezione "Componenti del kit" del kit per le procedure dettagliate.
  5. Aggiungi 100 μL di Lysis Buffer rispettivamente al tubo campione e al tubo standard, e miscela accuratamente utilizzando un oscillatore a vortice. Lascialo riposare a temperatura ambiente per 5 minuti.
  6. Aggiungi 250 μL della soluzione di lavoro preparata a ciascun tubo e mescola accuratamente usando un miscelatore a vortice. Riscalda il bagno maria a 95 °C in un ambiente naturale per 15 minuti, poi mettilo nel bagno di ghiaccio per 5 minuti per farlo raffreddare. Centrifuga a rotore angolare ad alta velocità a 10.000 x g per 10 minuti (4 °C).
  7. Prendi 100 μL di sovrantantante e aggiungili a una piastra nera a 96 pozzi. Misurare l'intensità di fluorescenza utilizzando un lettore di micropiastre a fluorescenza (es: 540 nm, Em: 590 nm). Calcola la concentrazione di MDA nel campione basandosi sulla curva standard.

6. Contenuto di Fe2+ nelle celle misurato con un kit di rilevamento Fe2+

  1. Preriscalda il bagno d'acqua in anticipo e alza la temperatura a 37 °C. Indossa i guanti, preleva le celle DRG dall'azoto liquido, avvolgile in uno strato di sacchetto di plastica, poi immergile in acqua calda a 37 °C scuotendole delicatamente a intermittenza per assicurare lo scongelamento completo entro 1 minuto.
  2. Dopo lo scongelamento, rimuovere la fiala dal bagno d'acqua a 37 °C, aprire il tappo, aspirare la sospensione della cella, trasferirla in un tubo centrifuga da 15 mL e aggiungere 10 mL di mezzo di coltura goccia, mescolando accuratamente. Centrifuga orizzontale a rotore a bassa velocità a 300 x g per 5 minuti (25 °C).
  3. Dopo la centrifugazione, si elimina il surnadante, aggiungi 10 mL di mezzo fresco per la coltura, fai una pipetta per mescolare accuratamente e centrifuga nuovamente. Ripeti questa procedura 3 volte prima di vaccinare su nuovi piatti di coltura.
  4. Coltivare le cellule staticamente in un incubatore a 37 °C, 95% di umidità e 5% di CO2 . Sostituisci il substrato il giorno dopo per rimuovere il DMSO residuo e le cellule morte, poi continua la coltivazione. Se la densità cellulare è alta, subcoltura tempestiva. Successivamente, raccogliere cellule nella fase di crescita logaritmica, digerirle, centrifugare e risopendere. Semina le cellule risospese in piastre a 12 pozzi a una densità del 70%-80%, poi riposiziona le piastre nell'incubatore a 37 °C, 95% di umidità e 5% CO2 per ulteriori coltivazioni.
  5. Osservare lo stato cellulare il giorno successivo, somministrare i trattamenti corrispondenti secondo l'impianto sperimentale e poi rimetterlenell'incubatrice a 37 °C, 95% di umidità e 5% di CO 2 per la coltivazione continua.
  6. Dopo 24 ore di somministrazione del farmaco, scartare il mezzo di coltura originale e lavare le cellule una volta con PBS. Aggiungere 300 μL/pozzo di sonda FerroOrange (1 μM) diluita in HBSS, e incubare a 37 °C, 95% di umidità e 5% anidride carbonica per 30 minuti.
  7. Poi aggiungi la soluzione di colorazione per cellule vive Hoechst 33342 (100x) sulla piastra cellulare con un rapporto di 1:100, incuba a temperatura ambiente al buio per 5 minuti per colorare i nuclei cellulari.
  8. Osserva l'effetto di colorazione al microscopio a fluorescenza e scatta fotografie per la documentazione. Successivamente, si utilizza ImageJ per calcolare l'intensità media di fluorescenza, ripetendo l'esperimento tre volte per l'analisi statistica.

7. Kit di rilevamento ROS

  1. Prendi le cellule nella fase di crescita logaritmica, digerisci, centrifugale e risospendi, quindi semina le cellule in una piastra a 12 pozzi a densità (70%-80%). Dopo aver miscelato accuratamente le cellule, posizionale nell'incubatore a 37 °C, 95% di umidità e 5% di CO2 per la coltivazione continua.
    NOTA: Per i passaggi di digestione, centrifugazione e rispensione, si riferisca al passo 4.1.
  2. Osservare lo stato cellulare il giorno successivo, somministrare i trattamenti corrispondenti secondo l'impianto sperimentale e poi rimettere le cellule nell'incubatore a 37 °C, 95% di umidità e 5% CO2 per la coltura continua. Dopo 24 ore di somministrazione, scartare il substrato di coltura originale e lavare le cellule due volte con HBSS.
  3. Aggiungi 200 μL di soluzione lavorativa DCFH-DA altamente sensibile, poi incuba a 37 °C, 95% di umidità e 5% di CO2 per 30 minuti.
  4. Scartare il soprantantante, lavare due volte con HBSS e tingere con 2 μL di soluzione di colorazione per cellule vive Hoechst 33342 (100x) per 5 minuti, poi esaminare al microscopio a fluorescenza. Ripeti l'esperimento tre volte con analisi statistica.

8. Morfologia mitocondriale delle cellule osservate utilizzando TEM

  1. Scartare il mezzo di coltura dalle cellule ben coltivate, aggiungere 1 mL di soluzione fissativa di glutaraldeide al 2,5% a temperatura ambiente e fissare le cellule al buio a temperatura ambiente per circa 5 minuti. Raschia delicatamente le celle in una direzione usando un raschietto a celle.
  2. Trasferire la sospensione della cella a un tubo centrifuga e centrifugare a 25 °C, 600 g per 3 minuti utilizzando una centrifuga a rotore orizzontale a bassa velocità.
  3. Dopo aver scartato il sovrantato della soluzione fissativa, aggiungere un nuovo fissatore per microscopia elettronica (usare 1 mL per pozzo per una piastra da 12 pozzi), fissare a temperatura ambiente lontano dalla luce per 30 minuti, quindi trasferire a 4 °C per la conservazione.
  4. Infiltrazione da disidratazione: inserire il campione nella piastra di incorporazione e metterlo in un forno a 37 °C per tutta la notte.
  5. Polimerizzare il mezzo di incassamento in un forno a 60 °C per 48 secondi. Taglia sezioni ultrasottili di 60-80 nm usando un ultramicrotomo.
  6. Tingi le sezioni con una soluzione alcolica satura di acetato di uranile al 2% per 15 minuti, poi con citrato di piombo per altri 15 minuti. Asciuga le sezioni colorate durante la notte a temperatura ambiente. Osserva e fotografa le sezioni con un microscopio elettronico a trasmissione.

9. Western blotting

  1. Estrai la proteina totale delle cellule
    1. Trattare e inoculare le cellule in una piastra di Petri da 6 cm fino a raggiungere il 70% di densità.
      NOTA: Consulta il passo 3.3 per le istruzioni sul rinascimento cellulare e l'inoculazione.
    2. Nel piatto di coltura, aggiungi 3 mL di OA (5 μM) e dopo 4 ore aggiungi CA (4 μM).
    3. Prepara in anticipo una scatola di ghiaccio, PBS pre-raffreddatore, raschietti per celle, tampone di lisi preparato e diversi tubi EP etichettati.
    4. Dopo il trattamento farmacologico, rimuovere il substrato di coltura dalle cellule e lavarle due volte con PBS pre-raffreddato. Esegui questo processo sul ghiaccio e aspira eventuali residui di PBS utilizzando una centrifuga a vuoto.
    5. Etichetta ogni piastra di Petri, poi aggiungi 300 μL di tampone per la lisi e lascia riposare sul ghiaccio per 5 minuti con agitazione costante per evitare lisi incomplete e congelamento.
    6. Successivamente si utilizza uno spatoio a celle pre-raffreddate per staccare le celle aderenti, raccogliendo 300 μL in un tubo EP dopo ogni raschiamento. Usa un nuovo raschiatore a celle per ogni raschiatura e non riutilizzarlo.
    7. Tieni la parte superiore del tubo EP e mescola accuratamente su un miscelatore a vortice, poi continua a mettere il gel sul ghiaccio per 25 minuti. In questo momento, accendi in anticipo la centrifuga a rotore angolare ad alta velocità a 4 °C, poiché il pre-raffreddamento richiede un certo tempo.
    8. Dopo la fine del timer, si torna a fare un vortice, poi centrifugare a rotore angolare ad alta velocità a 4500 x g per 15 minuti in una centrifuga a 4 °C.
    9. Ora accendi il riscaldatore per il bagno a secco e imposta la temperatura a 100 °C.
    10. Estrai il kit di quantificazione delle proteine BCA, aggiungi campioni e reagenti alla piastra da 96 pozzi, mescola bene e reagisci in un incubatore a 37 °C, 95% di umidità e 5% CO2 per 30 minuti. Misura il contenuto proteico estratto utilizzando un lettore di microplacche multifunzionale, poi aggiusta con il restante buffer di lisi in base ai risultati per garantire che la concentrazione di ogni campione sia coerente.
    11. Infine, in base al contenuto di ogni surnanteante, si aggiunge 1/5 di volume del 6× Loading Buffer per preparare il sistema di carico proteico. Aspirare con cura 150 μL di sovrantantante in un nuovo tubo EP. Aggiungi 30 μL di buffer di carico 6× al sovrantantante e mescola accuratamente (tipicamente a un rapporto 1:5). Conserva la miscela sul freddo.
    12. Poi riscalda a 100 °C su un riscaldatore per 6 minuti, assicurandoti di tenere premuto il tappo del tubo EP per evitare che si apra. Dopo il riscaldamento, raffreddalo in un bagno di ghiaccio.
  2. Prepara un gel proteico al 10% di concentrazione.
    1. Risciacqua la piastra di gel con acqua pura, asciugala all'aria, togli l'eccesso di umidità ed evita macchie d'acqua e polvere il più possibile.
    2. Rimuovi il supporto per il gel, con le piastre corte delle due lastre di vetro davanti e le piastre lunghe dietro, allineando i fondi per assicurare che lo spazio tra le lastre di vetro si adatti saldamente alla striscia sigillante in fondo al supporto per evitare perdite, poi fissa saldamente le lastre per prepararle al gel.
    3. Prepara il gel inferiore con 6 mL di acqua pura, 3,75 mL di 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 0,15 mL di SDS al 10%, 5 mL di Acry/bis al 30%, 75 μL di APS al 10% e 7,5 μL di TEMED.
    4. Fai ruotare delicatamente per evitare schiuma, poi aggiungi rapidamente e in modo uniforme tra i due piatti di vetro, lasciando spazio per il gel superiore. Successivamente, appiattire la superficie liquida con 1 mL di isopropanolo e lasciarla riposare per circa 30 minuti.
    5. Sciacquare il pettine per la preparazione del gel con acqua pura, asciugare all'aria e mettere da parte. Dopo che il gel inferiore si è completamente solidificato, versa l'isopropanolo, risciacqua con cura 2-3 volte con acqua pura, assorbi il liquido e inverti la piastra del gel per svuotare il liquido residuo.
    6. Prepara il gel di impilamento superiore con 6 mL di acqua pura, 2,5 mL di 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,1 mL di SDS al 10%, 1,34 mL di Acry/bis al 30%, 50 μL di APS al 10% e 10 μL di TEMED.
    7. Riempi lo strato superiore e inserisci con cura un pettine da 15 pozzi e 1,5 mm di spessore. Dopo 1-2 minuti, riempi gli spazi vuoti, facendo attenzione a minimizzare la formazione delle bolle durante questo processo. Usa un gel completamente polimerizzato.
  3. Elettroforesi proteica in gel
    1. Preconfigura il Running Buffer e il Transfer Buffer, con il Transfer Buffer pre-raffreddato in un frigorifero a 4 °C.
    2. Risciacqua il gel proteico con acqua ultrapura, estrai un serbatoio pulito per l'elettroforesi, fissa le due piastre corte del gel proteico verso l'interno e opposte, versa il Running Buffer e controlla eventuali perdite.
    3. Rimuovere con attenzione il pettine, caricare 10 μL per pozzo con un totale di 4 gruppi campioni. Carica 3 gruppi campione per gel, separati da un marcatore proteico di 4 μL tra ciascun gruppo, per un totale di 15 pozzi.
    4. Dopo aver caricato i campioni, versare tutto il Running Buffer rimanente nel serbatoio di elettroforesi, coprirlo con il coperchio, impostare la tensione a 140 V ed eseguire l'elettroforesi a tensione costante per 20 minuti.
    5. Quando le bande proteiche entrano nel gel di separazione dopo la concentrazione, si regolerà la tensione a 120 V per una elettroforesi a tensione costante. Durante questo processo, immergi la membrana NC nel Transfer Buffer. Fermare l'elettroforesi quando il blu di bromofenolo indica che il campione ha raggiunto il bordo inferiore del gel, e prepararsi al trasferimento di membrana.
    6. Riempi una scatola di schiuma a metà con ghiaccio, togli la morsa di trasferimento, il Transfer Buffer pre-raffreddato e la membrana NC bagnata. Versa metà del Transfer Buffer in un contenitore quadrato piatto.
    7. Estrai il gel proteico, sciacqualo accuratamente con acqua ultrapura, posiziona il lato nero rivolto verso il basso e il lato trasparente verso l'alto. Al centro, disporti uno strato di spugna, uno strato di carta filtrante, il gel proteico, la membrana NC, poi aggiungi un altro strato di carta filtrante e spugna.
    8. Dopo aver premuto per rimuovere le bolle d'aria, stringi la cassetta di trasferimento e inserila nel serbatoio di trasferimento. Una volta che entrambi i gel proteici sono completamente inseriti, versa tutto il Transfer Buffer nel serbatoio di trasferimento, poi aggiungi due impacchi di ghiaccio per raffreddare e copri con il coperchio.
    9. Circonda la cassetta di trasferimento con ghiaccio e trasferisci a una tensione costante di 120 V per 90 minuti. Il processo di trasferimento genera calore significativo, quindi è necessario un bagno di ghiaccio per il raffreddamento.
    10. Rimuovi la membrana NC, immergila e tintindola in 20 mL di soluzione di colorazione Ponceau S, segna la dimensione del marcatore con una matita e taglia la membrana con una matita in base alla dimensione della proteina bersaglio da rilevare.
    11. Recupera la soluzione di colorazione Ponceau S. Lava via la soluzione di colorazione con PBS e incuba la membrana NC con 20 mL di tampone bloccante, poi blocca a temperatura ambiente su uno shaker a bassa velocità per 1-2 ore.
    12. Scartare la soluzione bloccante, risciacquare rapidamente la membrana due volte con PBS su uno shaker decolorante per rimuovere completamente la soluzione bloccante, poi aggiungere i relativi anticorpi in base ai rapporti di utilizzo del Western Blot di ciascun anticorpo nella scatola di incubazione degli anticorpi e incubare durante la notte a 4 °C.
    13. Separatamente recupera gli anticorpi primari e immagazzina a -20 °C. Le membrane sono state lavate rapidamente 4 volte con TBST su uno shaker decolorante, per 5 minuti ogni volta, per rimuovere completamente gli anticorpi primari. Poi, aggiungi 4 mL del tampone bloccante con anticorpi secondari e incuba le membrane a temperatura ambiente su uno shaker lento per 1 ora.
    14. Lava l'anticorpo secondario quattro volte con il tampone TBST per 5 minuti ciascuna, poi sostituisci con il tampone PBS per inumidire completamente la membrana NC.
    15. Secondo il manuale di istruzioni per i reagenti di chemiluminescenza ECL, si prepara la soluzione luminescente e si lascia cadere sulla superficie della membrana, quindi incubare per 1-2 minuti prima di sviluppare con un sistema di imaging in gel.
    16. Elabora i dati grezzi nel sistema di imaging Image J, poi trasferili al software Photoshop per la creazione delle figure.

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Risultati

Farmacologia di rete e Docking Molecolare
Identificazione dei potenziali bersagli della CA: nell'indagine approfondita sull'attività farmacologica della CA, 60 potenziali bersagli sono stati selezionati meticolosamente da una vasta revisione della letteratura rilevante. Per ampliare ulteriormente l'ambito dell'analisi, sono stati identificati altri 12 potenziali target associati alla CA tramite il database TCMSP. Per una maggiore accuratezza e accuratezza, sono state ...

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Discussione

La ferroptosi, una modalità di morte cellulare recentemente identificata, è caratterizzata da un eccessivo accumulo intracellulare di ferro e da perossidazione lipidica. Morfologicamente, la ferroptosi si manifesta come ritiro mitocondriale, perdita o riduzione delle strutture delle cristi e aumento della densità della membrana, mentre la membrana cellulare e la morfologia nucleare rimangonoinalterate 26. Meccanicamente, la ferroptosi è guidata da esaurimento del ...

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Dichiarazioni

Non ci sono conflitti di interesse finanziari da rivelare

Ringraziamenti

Esprimiamo la nostra più sentita gratitudine per le condizioni superiori offerte dall'ospedale e dai suoi dipartimenti, che ci hanno permesso di raggiungere questi risultati. Allo stesso tempo, estendiamo anche il nostro sincero ringraziamento ai numerosi membri del laboratorio per i loro instancabili sforzi e i preziosi contributi nel corso degli anni. Il duro lavoro di ogni partecipante è una parte indispensabile del nostro successo e in futuro continueremo a collaborare per promuovere i progressi nel campo della medicina. Fondazione Nazionale Cinese per le Scienze Naturali (82104838), Programma Spark della China Promotion Foundation (XH-D001), Programma Chiave di Ricerca e Sviluppo della Provincia del Liaoning (2024JH2/102500062) e Fondazione Provinciale di Scienze Naturali del Liaoning (2025-MSLH-490).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
  GlicinaBiofroxx1275KG001
  Tris-baseBiofrooxx1115KG001
0,5  M  Buffer Tris-HCl (pH  6,8)Biorad1610799
1 M Tris-Hcl (PH 7,5)BeyotimeST775
1,5  M  Buffer Tris-HCl (pH  8,8)Biorad1610798
APSBeyotimeST005
Alimentazione di base per elettroforesiBIO-RAD PowerPac Basic
Kit di quantificazione delle proteine BCABeyotimeP0012
Anticorpo ricombinante beta actinaHuabio81115-1-RR
Incubatore a anidride carbonicaThermo150L
Kit di analisi CCK-8ApexbioK1018
Kit per il test di attività cellulare e citotossicitàBeyotimeC2015M
Cinnamaldeide (CA)MacklinC805134purezza 98%
Shaker decoloranteKylin-BellTS-100
DMEM (Eagle Medium Modificato di Dulbecco)BasalMediaL110KJ
DMSOSigmaD2650
Radice dorsale del ganglio (DRG)Biografia di FuhengFH165Numero di serie: 20211227-1
Mezzo completo DRGBiografia di FuhengFH-DRG
Soluzione luminescente ECLThermo34580
ErbB-1Proteintech06-8471:2000
Fetal  Bovino  SieroMacklinFO193
Sonda di rilevamento ioni ferrosi - FerroOrangeDojindoF374
FTH1Tecnologia di segnalazione cellulare4393S1:1000
Sistema di imaging a gelBIO-RAD ChemiDoc Touch
Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS)SolarbioH1025
Centrifuga refrigerata ad alta velocitàEppendorf5804R
Hoechst 33342 Soluzione per la colorazione a cellule viveBeyotimeC1028
Kit di immunoistochimicaBiosharpBS-24-PB
Sistema di microscopio a fluorescenza invertitaLeicaLeica Dmi 8
Anticorpo monoclonale del coniglio ricombinante JAK2 [SY0245]HuabioET1607-351:2000
Microscopio da laboratorio a contrasto di fase invertitoLeicaLeica Dmi 1
Centrifuga a bassa velocitàEppendorf5804
Kit di rilevamento dei contenuti MDASangonD799762
Lettore di microplaccheALBA DEL SOLE&NBSP;TECAN
Lettore multifunzione di microplaccheBMGLABTECH PHERAstar FS
NF-& kappa; Anticorpo policlonale B p65Proteintech10745-1-AP1:1000
ParaformaldeideMacklinP804536
Soluzione di colorazione PonceauBeyotimeP0022
Marcatore proteicoThermo26617
P-STAT3 (Ser727)Tecnologia di segnalazione cellulare9134S1:1000
P-STAT3 (Tyr705)Tecnologia di segnalazione cellulare9145S1:2000
Anticorpo ricombinante antiglutatione perossidasi 4[EPNCIR144]abcamab1250661:1000
Anticorpo ricombinante anti-XCT[EPR27115-64]abcamab3076011:1000
Kit per il test ROSDojindoR252
Buffer di caricamento proteico SDS-PAGE (6X)BeyotimeP0289
Latte scremato in polvereBiosharpBS102-500g
SDS solfato di dodecil sodioBiofrooxx3250GR500
STAT3 (F-2)Santa CruzSC-80191:200
TEMEDSolarbio    T8090   
TFRCInvitrogen13-68000,5 & micro; g/mL
Tween80SelleckS6702
Banco da lavoro ultra-pulitoHDLDL-CJ-2NDI
Microscopio verticaleOlympusCX 31
Elettroforesi verticaleBIO-RAD Mini tetra proteico
Serbatoio di trasferimento umidoBIO-RAD Mini Trans Blot
α-Tubulinaα-TubulinaER130905
GraphPad PrismAnalisi statistica
Software ImageJOttieni il valore di grigio del blot proteico

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