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Articolo di ricerca

Il colesterolo e la stearamide mediano l'apoptosi linfocitaria e la secrezione di citochine nel lupus eritematoso sistemico

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DOI:

10.3791/69038

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17 ottobre 2025

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1Anhui University of Science & Technology, The First Hospital, 2Department of Rheumatism and Immunology, Peking University Shenzhen Hospital, 3School of Computer Science and Engineering, Anhui University of Science & Technology, 4Taizhou University of Medicine, 5School of Medicine, Anhui University of Science & Technology, 6Department of Radiotherapy, Shenzhen Traditional Chinese Hospital, the Fourth Clinical Medical College of Guangzhou University of Chinese Medicine, the Clinical Medical Research Center of Shenzhen People's Hospital, 7Anhui Provincial Academician Workstation of Anhui University of Science & Technology for Autoimmune Disease Diagnostic Technology, 8Departments of Nephrology, Shenzhen People's Hospital

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Sommario

Qui, presentiamo uno studio che integra la randomizzazione mendeliana su due campioni, la convalida metabolomica basata sulla cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) e saggi funzionali utilizzando linfociti derivati da pazienti con lupus eritematoso sistemico (LES) per valutare l'apoptosi e le risposte delle citochine in seguito alla stimolazione dei metaboliti, con l'obiettivo di identificare i biomarcatori correlati ai lipidi e studiare i loro ruoli immunoregolatori nel LES.

Abstract

Le alterazioni nella composizione dei metaboliti sierici sono state sempre più associate al lupus eritematoso sistemico (LES), ma gli effetti diretti di questi metaboliti sulla funzione delle cellule immunitarie rimangono poco definiti. Questo studio mirava a identificare i metaboliti del sangue periferico associati al LES e a valutare il loro impatto sull'apoptosi e sulla secrezione di citochine nei linfociti derivati da pazienti con LES.

Abbiamo eseguito un'analisi di randomizzazione mendeliana (MR) su due campioni per studiare la relazione tra 565 metaboliti sierici e LES, utilizzando il modello ponderato a varianza inversa come approccio analitico primario. I risultati significativi sono stati convalidati in modo incrociato utilizzando dati di metabolomica non mirata precedentemente pubblicati basati sulla cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS). Negli esperimenti funzionali, i linfociti isolati da pazienti con LES sono stati stimolati con metaboliti bersaglio, seguiti dalla valutazione dell'apoptosi e della secrezione di citochine.

L'analisi RM ha identificato 28 metaboliti significativamente associati al LES. Di questi, il colesterolo (OR = 1,462, IC 95%: 1,100-1,940, P = 0,008) e la stearamide (OR = 0,125, IC 95%: 0,020-0,660, P = 0,014) sono stati convalidati attraverso LC-MS e sono risultati elevati nei pazienti con LES. L'analisi delle caratteristiche operative del ricevitore ha dimostrato forti prestazioni diagnostiche (AUC = 0,999 per il colesterolo; AUC = 1,000 per la stearamide). Dal punto di vista funzionale, entrambi i metaboliti inducono un aumento dell'apoptosi e un'elevata secrezione di TNF-α, IFN-γ e TGF-β1 nei linfociti LES.

In sintesi, il nostro approccio integrato che combina l'associazione genetica, la profilazione dei metaboliti e i saggi funzionali rivela che il colesterolo può contribuire alla disregolazione immunitaria nel LES. Sebbene la stearamide abbia mostrato un'associazione negativa con il rischio di LES nell'analisi RM, i suoi effetti in vitro rispecchiavano quelli del colesterolo, suggerendo un ruolo complesso e dipendente dal contesto. Questi risultati sottolineano l'importanza del metabolismo lipidico nel LES e supportano ulteriori indagini meccanicistiche e cliniche sul suo impatto immunologico.

Introduzione

Il Lupus Eritematoso Sistemico (LES) è una malattia autoimmune cronica, caratterizzata da una patogenesi complessa e da diverse manifestazioni cliniche, che colpisce milioni di persone in tutto il mondo1. L'eterogeneità del LES, in cui i sintomi differiscono ampiamente tra gli individui e si evolvono nel tempo, crea sfide significative nella diagnosi, nel monitoraggio dell'attività della malattia e nella personalizzazione dei piani di trattamento personalizzati 2,3. Sebbene i criteri di classificazione delle cellule SLE della European League Against Rheumatism and American College of Rheumatology (EULAR/ACR) del 2019 abbiano migliorato l'accuratezza diagnostica4, questi criteri non catturano tutte le manifestazioni della malattia e spesso dipendono da procedure invasive come la biopsia renale, che possono essere poco pratiche e onerose per i pazienti.

Negli ultimi anni, la ricerca sui metaboliti come biomarcatori nel LES è aumentata, dimostrando il loro enorme potenziale nella diagnosi precoce della malattia, nella tipizzazione e nella valutazione prognostica 5,6,7. Tuttavia, il potenziale traslazionale della ricerca basata sui metaboliti nel LES rimane limitato da diverse sfide chiave. In primo luogo, le piccole dimensioni del campione sono un vincolo importante8. La maggior parte degli studi metabolomici fino ad oggi ha coinvolto relativamente pochi partecipanti, il che limita la loro capacità di catturare l'intera eterogeneità clinica del LES. Dato che il LES può variare da un lieve coinvolgimento cutaneo a gravi manifestazioni renali o neurologiche, gli studi con un'insufficiente diversità del campione possono soffrire di scarsa riproducibilità e limitata generalizzabilità9. In secondo luogo, la profondità meccanicistica rimane carente. Sebbene studi precedenti abbiano dimostrato associazioni tra metaboliti specifici e attività della malattia, danno d'organo o particolari caratteristiche cliniche, la maggior parte dei risultati rimane di natura descrittiva10. Queste indagini si sono in gran parte concentrate sulle differenze quantitative nei livelli di metaboliti e sulle loro correlazioni statistiche con gli indicatori clinici, senza esplorare i ruoli causali dei metaboliti nell'immunopatologia del LES. Poiché la disregolazione immunitaria, tra cui l'apoptosi aberrante dei linfociti e lo squilibrio della secrezione di citochine, è fondamentale per la patogenesi del LES, è fondamentale capire come i metaboliti influenzano questi processi11. Attualmente, pochi studi hanno indagato direttamente come specifici metaboliti modulano l'apoptosi delle cellule immunitarie o la produzione di citochine nel contesto del LES.

Qui, questo studio mira a identificare i biomarcatori metabolici associati al LES attraverso l'integrazione della randomizzazione mendeliana (MR) e delle analisi metabolomiche non mirate di LC-MS e a chiarire i ruoli funzionali di questi metaboliti candidati nella modulazione dell'apoptosi linfocitaria e della produzione di citochine infiammatorie utilizzando saggi cellulari mirati, come mostrato nella Figura 1.

Questo è il primo studio che integra la risonanza magnetica, la convalida metabolomica e i saggi funzionali in vitro per indagare i ruoli causali e meccanicistici dei metaboliti lipidici, in particolare colesterolo e stearamide, nella patogenesi del LES. Combinando prove genetiche, metaboliche e sperimentali, questo lavoro fornisce una visione completa e stratificata di come specifiche alterazioni lipidiche possano influenzare la disregolazione immunitaria nel LES. Questo approccio integrativo offre un nuovo quadro per l'identificazione di potenziali biomarcatori metabolici e bersagli terapeutici nelle malattie autoimmuni12.

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Protocollo

Questo studio è stato condotto secondo i criteri di classificazione EULAR/ACR 2019. Questo studio è stato approvato dall'Ospedale del Popolo di Shenzhen (Numero di approvazione del Comitato Etico LL-KY-2019514).

Analisi della randomizzazione mendeliana (RM)

Fonti di dati GWAS
I dati di associazione genetica per il LES e 565 metaboliti sono stati ottenuti dal database OpenGWAS (https://gwas.mrcieu.ac.uk/). I set di dati GWAS della malattia sono riassunti nella Tabella 1, mentre le fonti e le dimensioni del campione per i dati GWAS del metabolita sono dettagliate nella Tabella 2. Questi set di dati hanno fornito le basi per l'analisi RM per esplorare le relazioni causali tra metaboliti e LES 13,14,15,16.

Selezione delle variabili strumentali
Le varianti genetiche associate ai metaboliti del sangue e al LES sono state selezionate come variabili strumentali (IV) per l'analisi RM. Gli IV sono stati scelti sulla base dei tre presupposti fondamentali della MR: pertinenza, indipendenza e restrizione di esclusione17. In particolare, sono stati selezionati polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) associati a metaboliti a una soglia di significatività dell'intero genoma di P < 5 × 10-8 18 18. Per garantire l'indipendenza tra gli IV, è stato eseguito l'aggregazione del linkage disequilibrium (LD) con una soglia di r2 < 0,001 e una distanza fisica di 10.000 kb utilizzando la popolazione europea come pannello di riferimento19. Questo processo ha ridotto al minimo la ridondanza e ha garantito che ogni IV fornisse informazioni univoche per l'analisi RM.

Analisi statistiche
L'approccio statistico primario per l'analisi RM è stato il metodo ponderato per varianza inversa (IVW), che combina gli effetti di più IV per stimare l'effetto causale dei metaboliti sul LES20. Per tenere conto della potenziale pleiotropia, sono state condotte analisi di sensibilità utilizzando la regressione MR-Egger21. La forza di ciascun IV è stata valutata utilizzando la statistica F, con solo gli SNP che mostravano F > 10 mantenuti per garantire una robusta forza strumentale22. Gli SNP con statistiche F più basse sono stati esclusi per evitare una debole distorsione dello strumento. Le analisi RM finali sono state eseguite solo quando non è stata rilevata alcuna eterogeneità o pleiotropia significativa, garantendo l'affidabilità delle stime causali23.

Analisi di sensibilità
Sono state impiegate diverse analisi di sensibilità per valutare la robustezza dei risultati della risonanza magnetica. L'eterogeneità tra le IV è stata valutata utilizzando il test Q di Cochran, mentre la pleiotropia è stata valutata tramite la regressione MR-Egger24. Inoltre, è stata condotta un'analisi leave-one-out per determinare se i risultati della RM fossero influenzati in modo sproporzionato da un singolo SNP25. Sono stati generati appezzamenti forestali per visualizzare gli effetti individuali e combinati delle IV. Queste analisi hanno assicurato collettivamente che i risultati della RM non fossero influenzati da effetti pleiotropici o SNP anomali.

Fonte dei dati Metabolomics
I dati di metabolomica utilizzati in questo studio sono stati derivati da uno studio precedentemente pubblicato dal nostro gruppo di ricerca10. In quello studio, abbiamo eseguito analisi metabolomiche su campioni di siero di 121 pazienti con LES e 106 individui sani. La profilazione metabolomica non mirata è stata condotta utilizzando la cromatografia liquida ad altissime prestazioni accoppiata alla spettrometria di massa (UHPLC-MS). I dati sono stati elaborati utilizzando flussi di lavoro metabolomici standard, tra cui il rilevamento, l'allineamento e la normalizzazione dei picchi, per identificare i metaboliti significativamente associati al LES. Questi metaboliti sono stati quindi incrociati con i risultati dell'analisi RM per identificare i metaboliti sovrapposti. Informazioni più dettagliate sono disponibili nella precedente pubblicazione10. I metaboliti significativamente associati nell'analisi metabolomica e quelli con associazioni causali significative nell'analisi RM sono stati mappati ai rispettivi ID HMDB utilizzando la piattaforma MetaboAnalyst. I metaboliti comuni sono stati quindi identificati intersecando i due set di ID HMDB.

Misure di citochine e saggio dell'apoptosi
Sono stati arruolati un totale di 3 pazienti con LES (Tabella 3), in conformità con i criteri di classificazione EULAR/ACR 2019.

Raccolta di campioni di sangue periferico e isolamento dei linfociti
Campioni di sangue periferico (3-6 ml) sono stati raccolti dai partecipanti utilizzando provette a vuoto contenenti eparina sodica come anticoagulante. Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state isolate mediante centrifugazione a gradiente di densità di Ficoll-Paque (400-800 × g per 20-30 minuti). Le cellule isolate sono state lavate due volte con soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS, HyClone) tramite centrifugazione a bassa velocità (250 × g per 10 minuti) e risospese in terreno RPMI-1640 completo integrato con siero fetale bovino al 10%. La densità cellulare è stata regolata a 1 × 106 cellule/mL, come verificato da un contatore automatico di cellule. La sospensione cellulare è stata seminata in piastre di coltura e pre-incubata per 2 ore a 37°C in un'atmosfera di CO2 al 5% per favorire l'aderenza. Dopo la pre-incubazione, le cellule non aderenti nel surnatante di coltura sono state accuratamente raccolte e sottoposte a isolamento linfocitario. La sospensione raccolta è stata delicatamente stratificata su Ficoll-Paque e centrifugata nuovamente a 400 × g per 20 minuti senza freno. Lo strato di cellule mononucleate all'interfaccia plasma-Ficoll è stato accuratamente aspirato, lavato due volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e risospeso in terreno RPMI-1640 contenente il 10% di siero fetale bovino. La vitalità e la concentrazione cellulare sono state valutate utilizzando il contatore automatico di cellule e i linfociti sono stati successivamente utilizzati per applicazioni a valle.

Trattamento e coltura cellulare
Le cellule sono state divise in cinque gruppi per il trattamento: Gruppo di controllo: trattati con un volume uguale di DMSO. Gruppo di trattamento del colesterolo: Trattato con colesterolo a una concentrazione di 1,5 mmol/L. La concentrazione di 1,5 mmol/L di colesterolo libero utilizzata in questo studio è stata selezionata per simulare un microambiente ricco di lipidi oltre i livelli fisiologici. Il colesterolo libero circolante negli individui sani varia in genere da 0,9 a 1,3 mmol/L. La concentrazione leggermente elevata utilizzata in questi esperimenti aveva lo scopo di imitare l'accumulo patologico di lipidi che può verificarsi nei tessuti infiammati o metabolicamente disturbati nel LES. Gruppi di trattamento con stearamide: trattati con stearamide a concentrazioni di 5 μmol/L e 10 μmol/L. Le concentrazioni di stearamide (5 e 10 μmol/L) sono state selezionate sulla base di un precedente rapporto26, che suggeriva che i livelli di stearamide nell'intervallo di 5-10 μmol/L possono imitare l'elevato accumulo di lipidi in condizioni patologiche. L'intento qui era quello di esplorare gli effetti pro-apoptotici e immunomodulatori dell'esposizione ad alta concentrazione ai lipidi sui linfociti LES, simulando stati infiammatori o metabolicamente disregolati. Il colesterolo e la stearamide sono stati prima disciolti in DMSO per preparare soluzioni madre ad alta concentrazione, che sono state poi diluite in terreno di coltura per raggiungere le concentrazioni target. La concentrazione finale di DMSO in tutti i gruppi non ha superato lo 0,1% (v/v). Dopo aver aggiunto i rispettivi trattamenti, le piastre sono state agitate delicatamente per garantire una distribuzione uniforme e incubate per 48 ore a 37 °C in un ambiente con CO2 al 5%.

Dosaggio dell'apoptosi
Per gli esperimenti di apoptosi, sono state raccolte da 1 × 106 a 3 × 106 cellule e lavate due volte con PBS pre-raffreddato. Un gruppo di controllo positivo è stato preparato risospendendo le cellule in 500 μL di soluzione di controllo positivo per l'apoptosi pre-raffreddata e incubando su ghiaccio per 30 minuti, seguito da un altro lavaggio PBS. I gruppi sperimentali sono stati trattati come descritto nel paragrafo 1.7, con trattamenti di controllo, colesterolo (1,5 mmol/L) e stearamide (10 μmol/L). Dopo il trattamento, sono state raccolte 1-10 × 105 cellule (comprese quelle del surnatante di coltura) e risospese in 500 μl di tampone legante 1× (preparato diluendo la soluzione madre al 5× con acqua distillata doppia). Ogni campione è stato miscelato con un numero uguale di cellule vive non trattate e il volume è stato regolato a 1,5 mL con tampone legante 1× pre-raffreddato. La sospensione è stata quindi suddivisa in tre tubi: uno per il controllo in bianco e due per la compensazione della singola macchia (Annexin V-FITC e PI). A ciascuna provetta sperimentale sono stati aggiunti 5 μL di Annessina V-FITC e 10 μL di soluzione colorante PI, seguiti da vorticing e incubazione a temperatura ambiente al buio per 5 minuti. La citometria a flusso è stata eseguita utilizzando un laser di eccitazione a 488 nm per rilevare l'annessina V-FITC (emissione a 530 nm) e PI (emissione a 615 nm). Il tubo di controllo vuoto è stato utilizzato per impostare le tensioni del canale di diffusione diretta (FSC), laterale (SSC) e del canale di fluorescenza, mentre i tubi a colorazione singola sono stati utilizzati per la compensazione della fluorescenza. L'apoptosi è stata analizzata utilizzando grafici di dispersione a doppio parametro per valutare la proporzione di cellule apoptotiche27,28.

Rilevamento del fattore immunitario
Dopo l'incubazione di 48 ore, le sospensioni cellulari sono state centrifugate (250 × g per 5 minuti) per raccogliere i surnatanti di coltura, che sono stati conservati a -80 °C fino all'analisi. La quantificazione delle citochine è stata eseguita utilizzando un pannello commerciale di risposta immunitaria essenziale per lo spettro, seguendo le istruzioni del produttore con ottimizzazioni per lo strumento. In breve, 25 μL di tampone per il saggio e 25 μL di standard (che vanno da 2,4 a 10.000 pg/mL) o campioni sono stati aggiunti a ciascun pozzetto di una micropiastra. La miscela di perle è stata agitata per 30 s e aggiunta ai pozzetti, portando il volume totale di reazione a 75 μl. La piastra è stata incubata con agitazione (800 giri/min) a temperatura ambiente per 2 ore al buio. Dopo due lavaggi automatizzati (1× tampone di lavaggio, 250 × g per 5 minuti), 25 μL di anticorpo di rilevazione biotinilato sono stati aggiunti a ciascun pozzetto e incubati per 1 ora. Successivamente, sono stati aggiunti 25 μL di streptavidina-ficoeritrina (SA-PE) per 30 minuti per amplificare il segnale.

L'acquisizione dei dati è stata eseguita utilizzando un citometro a flusso dotato di un laser di eccitazione a 488 nm e di un filtro a 575/26 nm per il rilevamento di PE. Prima di ogni esperimento, sono state utilizzate perle di calibrazione per ottimizzare le tensioni del tubo fotomoltiplicatore e la compensazione spettrale. I dati sono stati analizzati utilizzando il software LEGENDplex v8.0, con concentrazioni di citochine determinate tramite l'adattamento della curva logistica a cinque parametri (5PL). I limiti di rilevamento per ciascuna citochina variavano da 0,68 pg/mL a 1,97 pg/mL e gli esperimenti sono stati condotti in duplicato per garantire la precisione (coefficiente di variazione tra pozzetti <10%). I risultati sono stati espressi come media ±± deviazione standard e le differenze statistiche tra i gruppi sono state valutate utilizzando l'ANOVA unidirezionale seguita dal test post-hoc di Tukey in un software di analisi statistica appropriato. Il periodo di incubazione di 48 ore è stato selezionato in base ai cambiamenti dinamici nella secrezione di citochine per catturare la risposta immunitaria in modo completo. La calibrazione giornaliera dello strumento e il controllo della concentrazione di DMSO (≤0,1%) hanno garantito l'affidabilità e la riproducibilità dei risultati 29,30,31.

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Risultati

Associazione tra metaboliti chiave e manifestazioni cliniche nel LES

In questo studio, l'analisi RM di 565 metaboliti con LES ha identificato associazioni causali significative. Come mostrato nella Figura 2, sono stati identificati un totale di 28 metaboliti significativamente associati al LES, che comprendono categorie come peptidi, aminoacidi, energia, lipidi, carboidrati e acidi grassi. Peptidi come la gamma-glutamilfenilalanina e il pro-idross...

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Discussione

Il nostro studio dimostra che 1,5 mmol/L di colesterolo, 5 μmol/L di stearamide e 10 μmol/L di stearamide inducono modelli simili di apoptosi e secrezione di citochine nei linfociti di pazienti con LES, sebbene siano state osservate variazioni di entità. In particolare, sia il colesterolo 1,5 mmol/L che la stearamide 5 μmol/L hanno aumentato significativamente l'apoptosi nei linfociti LES. Inoltre, il trattamento con colesterolo 1,5 mmol/L in combinazione con 5 μmol/L o 10 μmol/L di stea...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata supportata dal Graduate Innovation Fund Project dell'Anhui University of Science & Technology (n. 2024cx2204), dall'Anhui Provincial Academician Workstationthe (Anhui Provincial Academician Workstation(Diagnostic Techniques for Autoimmune Disorders), Anhui University of Science & Technology, Huainan, Anhui 232001, Cina) (Documento n. 317 [2023], emesso dal Dipartimento di Scienza e Tecnologia della Provincia di Anhui), Fondo per la ricerca di base e applicata della provincia del Guangdong (n. 2021A1515110250), Fondazione nazionale per le scienze naturali della Cina (n. 82271824).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Kit di apoptosi Annexin V-FITC/PIMulti ScienzeAP101Per la rilevazione dell'apoptosi tramite citometria di flusso
ColesteroloShanghai Jinpan Biotech Co., Ltd.JP1210051Utilizzato per esperimenti di stimolazione nei PBMC (10 g)
Inserto a bancoCorningCBG10001Utilizzato per separare fisicamente le cellule in esperimenti di cocoltura
Citometro di flussoBeckman CoulterCytoFLEXAnalisi citometrica a flusso
GraphPad Prism SoftwareGraphPadAnalisi statistica e grafica
LEGENDplex Panel della Risposta Immunitaria Essenziale UmanaBioLegend740390Rilevamento multiplex di citochine immuno-correlate
Set di micropipette EppendorfDiversoGestione dei liquidi e trasferimento di volume (0.1– 10 & mu; L, 10 e n; 100 & mu; L, 100 e sigillo segnale; 1000 & mu; L)
Mezzo di separazione dei linfociti del sangue perifericoProduttore nazionaleB1.1420AUtilizzato per l'isolamento PBMC (200 mL)
RPMI-1640 MediumGibcoC22400500BTMezzo di coltura per i PBMC
StearamideShanghai Jinpan Biotech Co., Ltd.1267285Utilizzato per la stimolazione lipidica dei PBMC (100 g)
Piastra sterile a 24 pozziProduttore nazionaleBLJ182APer la coltura cellulare
CountStarShanghai Ruiyu BiotechnologyCS200Contatore automatico delle celle
PBSHyclone10010023Lavaggio delle celle
Ficoll-Paque Cytiva17-5442-03Isolamento delle cellule sinoviali
LEGENDplex software BioLegendVersione 8Analisi dei dati della citometria a flusso
GraphPad Prism 9.0GraphPad SoftwareVersione 9Analisi statistica

Riferimenti

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Formal Correction: Erratum: Cholesterol and Stearamide Mediate Lymphocyte Apoptosis and Cytokine Secretion in Systemic Lupus Erythematosus
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