Method Article

Metodo per la privazione selettiva del sonno REM utilizzando il movimento selettivo del naso per dimenticare il REM (SNiFFer)

DOI:

10.3791/69042

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April 21st, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Humanics, University of Tsukuba, 2International Institute for Integrative Sleep Medicine, Tsukuba Institute for Advanced Research (TIAR), University of Tsukuba, 3Division of Neurophysiology, Department of Physiology and Cell biology, Kobe University School of Medicine, 4Institute of Systems and Information Engineering, University of Tsukuba, 5Institute of Medicine, University of Tsukuba

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentiamo un protocollo innovativo per la privazione selettiva del sonno REM (Rapid Eye Movement) nei roditori.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il sonno è ampiamente suddiviso in stadi di movimento oculare rapido (REM) e non REM, e sono state sviluppate varie tecniche di privazione del sonno per studiarne le funzioni. I metodi tradizionali—come la stimolazione meccanica o il far cadere l'animale durante il sonno REM—spesso portano a un'abitudine rapida e a effetti indesiderati dello stress, rendendo difficile l'interpretazione. Qui introduciamo un metodo nuovo, lieve e delicato per la privazione del sonno REM nei roditori: SNiFFer. I roditori sono noti per essere altamente sensibili agli stimoli nasali. In questo metodo, un pennello morbido accarezza delicatamente il naso dell'animale durante il sonno REM, scatenando in modo affidabile l'eccitazione. Per applicare selettivamente questa tecnica durante il sonno REM, abbiamo utilizzato un sistema di classificazione degli stadi del sonno basato su Electroencefalografia (EEG) in tempo reale basato su AI. L'intervento è stato attivato solo durante gli episodi REM, e è stato incluso un gruppo di controllo con il giogo, che ha ricevuto lo stesso schema di stimolazione indipendentemente dallo stato di sonno. Abbiamo inoltre applicato SNiFFer in un paradigma di condizionamento della paura traccia per testare se la privazione del sonno REM entro 6 ore dopo l'apprendimento interferisce con la consolidazione della memoria. Rispetto ai controlli con yoked, gli animali trattati con SNiFFer hanno mostrato una significativa diminuzione della durata totale degli episodi REM e degli episodi REM, indicando la specificità e l'efficacia del metodo. In conclusione, la tecnica SNiFFer offre un approccio tattile altamente selettivo e minimamente invasivo per la privazione del sonno REM nei topi. Permette un controllo preciso delle condizioni sperimentali e apre nuove possibilità per indagare il ruolo del sonno REM nella memoria e nella cognizione—con una svolta delicata.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il sonno a movimento rapido degli occhi (REM) gioca un ruolo fondamentale nei processi cognitivi come la consolidazione della memoria 1,2. Per indagare il significato funzionale del sonno REM nel cervello, la privazione del sonno REM è comunemente impiegata come approccio sperimentale. Attualmente, quattro metodi principali sono ampiamente utilizzati per indurre la privazione del sonno REM nei roditori: il metododel disco rotante 1, il metodo del vasodi fiori 3, il metodo del soffio d'aria4 e le tecniche di stimolazionefisica 5,6. Sebbene i metodi del disco rotante e del vaso di fiori siano molto efficaci nell'eliminare il sonno REM, spesso introducono uno stress notevole all'animale, come l'esposizione all'acqua o la faticafisica 7, che possono confondere l'interpretazione degli esiti comportamentali e fisiologici. Analogamente, i metodi di soffio d'aria e quelli convenzionali di stimolazione fisica tendono a fornire stimoli ampi e non specifici al corpo, con conseguente variabilità nell'intensità dello stimolo e una scelta limitata dei gruppidi controllo 4,8.

Abbiamo condotto un confronto completo della letteratura che copre oltre sei decenni di ricerca sulla privazione del sonno REM, fornito nel Fascicolo Supplementare 1 e nella Tabella Supplementare 1. Abbiamo incorporato studi storici, meccanicistici, neurochimici, ormonali e comportamentali fondamentali delle principali linee di ricerca, tra cui Jouvet, Rechtschaffen, Bergmann, Tufik, Andersen e Borbély. La Tabella Supplementare 1 organizza i lavori chiave in ordine cronologico. Traccia l'evoluzione metodologica delle tecniche di privazione del sonno REM e ne riassume i principali risultati biologici, neurochimici, ormonali, immunitari, termoregolatori e comportamentali. Poiché il presente manoscritto è strutturato come un articolo di metodo piuttosto che come una revisione storica completa, questo è stato aggiunto come informazione supplementare.

Per affrontare queste limitazioni, abbiamo sviluppato un metodo innovativo che offre un'elevata selettività per la privazione del sonno REM. Questa tecnica è progettata per privare selettivamente i roditori del sonno REM in modo precisamente controllato. In questo approccio, limitiamo lo stimolo al naso dell'animale—una delle aree più sensibili neiroditori 9. Inoltre, utilizziamo un sistema di classificazione delle fasi del sonno in tempo reale realizzato dall'IA per rilevare e interrompere gli episodi di sonno REM con specificitàtemporale 10. Questo sistema di IA si riferisce al segnale EEG negli ultimi 4 secondi di epoca da un singolo canale e valuta gli stadi attuali del sonno del mouse. Questa configurazione consente anche l'implementazione di gruppi di controllo con gioco, consentendo interventi temporalmente abbinati. Sebbene classificato come una tecnica di privazione del sonno REM basata sulla stimolazione fisica, il nostro protocollo differisce dai metodi convenzionali. Innanzitutto, abbiamo applicato l'analisi delle fasi del sonno in tempo reale utilizzando l'IA per un intervento specifico REM accurato e coerente. In secondo luogo, limita la regione di stimolazione solo alla parte superiore del naso, che è una delle aree più sensibili neitopi 6, con una variazione minima nella durata e nella forza della stimolazione. Infine, abbiamo appena creato un gruppo di controllo con il giogo che ha ricevuto quantità identiche di stimolazione per controllare i fattori di confusione. Questo protocollo propone un metodo per indagare funzioni specifiche del sonno REM.

Per valutare l'utilità di questo metodo, lo abbiamo applicato per indagare il ruolo del sonno REM nella consolidazione della memoria di paura traccia. Studi precedenti hanno riportato che la privazione del sonno REM compromette la consolidazione della memoria della paura dipendente dall'ippocampo, inclusi i ritardi della paura11,12. Tuttavia, ci sono evidenze contrastanti riguardo all'impatto della privazione del sonno REM sui processi di memoria che coinvolgono circuiti cerebrali distribuiti e complessi 5,13. La consolidazione della memoria di paura traccia richiede l'associazione di uno shock al piede (stimolo incondizionato), un segnale uditivo (stimolo condizionato) e l'intervallo di traccia tra di essi—un processo noto per reclutare più regioni cerebrali, inclusi l'ippocampo, la corteccia prefrontale mediale el'amigdala 14. Pertanto, abbiamo privato i topi del sonno REM per 6 ore immediatamente dopo il condizionamento di paura traccia15, una finestra temporale nota per essere critica per la consolidazionedella memoria 16. Utilizzando questo protocollo, abbiamo valutato l'effetto della privazione del sonno REM sulla consolidazione delle tracce di memoria che dipendono dall'attività coordinata dei sistemi neurali distribuiti. Questo articolo presenta un metodo innovativo che descrive un protocollo sperimentale dettagliato che ne testa gli effetti.

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Protocol

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Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Tsukuba. Maschi e femmine di topi C57BL/6J (11–13 settimane, 20–35 g) sono stati utilizzati in questo studio. L'elenco completo dei materiali e degli strumenti utilizzati in questo studio è fornito nella Tabella dei Materiali.

1. Impianto chirurgico di elettrodi EEG17

  1. Anestesia e preparazione dell'animale
    1. Indurre anestesia con isoflurano al 4% miscelato con aria in 3 minuti. L'adeguata anestesia è stata confermata dall'assenza del riflesso di ritiro dei pedali e del tono muscolare, insieme a schemi respiratori stabili.
    2. Rasi la testa dorsale e la regione del collo dalla nuca fino all'area tra gli occhi usando un rasorio elettrico. Quando un topo indica veglia, come il movimento dei baffi, indurre nuovamente l'anestesia.
  2. Fissazione della testa ed esposizione del cranio
    1. Fissa l'animale in un telaio stereotaxico, assicurando l'allineamento nasale e cranico. Da quel momento fino alla fine dell'intera procedura chirurgica, l'anestesia è stata mantenuta continuamente tramite un sistema di pompa vaporizzatore di isoflurano.
    2. Applica unguenti oftalmici su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza corneale. Rimuovi eventuali peli residui con una crema depilatoria.
    3. Effettuare un'incisione al cuoio capelluto nella linea mediana e ritraire delicatamente la pelle per esporre il cranio dalla linea posteriore dell'orecchio alla linea anteriore degli occhi. Rimuovere il tessuto mucoso con un cotton fibb.
  3. Identificazione e livellamento dei punti di riferimento
    1. Identificare bregma e lambda; Regola il braccio stereotassico in modo che questi punti siano in linea entro ±0,05 mm. Verifica che le coordinate laterali ±3,0 mm dalla bregma siano anch'esse in linea (±0,05 mm).
  4. Trapano e posizionamento delle viti
    1. Segna le seguenti coordinate rispetto al bregma. Forate quattro fori pilota come queste coordinate. Anteriore–Posteriore / Mediale–Laterale: +1,5 mm / ±1,5 mm, –3,0 mm / ±1,7 mm.
    2. Impianta le viti di registrazione EEG in ogni foro e fissarle con una colla gel a base di cianoacrilato. Fascia e copri il cranio e i cavi esposti con uno strato sottile di cemento dentale.
  5. Assistenza postoperatoria
    1. Somministrare 0,5 mL di soluzione di glucosio al 5% e 0,13 mL di ibuprofene (o analgesico equivalente).
    2. Riportare il topo nella sua gabbia di casa, una gabbia cilindrica in Plexiglas (21,9 cm di diametro, 31,6 cm di altezza) posta all'interno di una camera isolata (45,7 x 50,8 x 85,4 cm). La camera è mantenuta a una temperatura di 23,5 ± 2,0 °C, un'umidità relativa del 50,0% ± 10,0% e un ciclo luce/buio di 12 ore (fase luminosa: 9:00 alle 21:00).
    3. Metti l'animale in una gabbia riscaldata per il recupero. Aspetta davanti alla gabbia finché un topo non si sveglia. Dopo l'intervento, gli animali sono stati mantenuti in alloggio individuale e non sono stati restituiti all'alloggio di gruppo per tutta la durata dell'esperimento.

2. Gestione e abituazione

  1. Programma per la sperimentazione
    1. Iniziare la maneggiatura durante la fase luminosa 24–48 ore dopo l'intervento. Continua per quattro giorni consecutivi.
  2. Procedura operativa
    1. Il primo giorno, metti un mouse a portata di mano per 2 minuti e 2 volte. Posiziona il topo sul palmo aperto dell'espertore con le dita estese e il palmo rivolto verso l'alto. Posiziona il palmo leggermente più in alto rispetto all'avambraccio, poiché i topi tendono naturalmente a salire su superfici elevate. Permette al mouse di muoversi liberamente senza restrizioni; Se il topo tenta di salire sull'avambraccio, riportalo delicatamente sul palmo tenendo leggermente la base della coda. Ogni intervallo dura più di 20 minuti. Questo dovrebbe avvenire durante la fase luminosa.
      NOTA: Se un topo salta dalla mano o la morde, usa un panno o carta velina per coprire la mano solo nel primo giorno. I vestiti possono essere riutilizzati e dovrebbero essere puliti ogni due settimane.
    2. Dal giorno 2 al 4, metti un topo a portata di mano per 2 minuti per 3 volte. Ogni intervallo e il periodo condotto sono gli stessi del giorno 1. Valuta l'abituazione comportamentale: i topi non abituati di solito tentano di fuggire saltando o mordendo con forza, mentre quelli abituati esplorano attivamente il palmo con tentativi di fuga minimi e pochi o nessun morso forzato.
    3. Al termine della sessione finale di manipolazione, collega il mouse al cavo di registrazione EEG.
      NOTA: Quando il materiale per la biancheria è eccessivo da ostacolare il muso del topo, raccogline alcuni manualmente e rimuoverli durante la maneggiazione o al momento della connessione.

3. Registrazione EEG di base

  1. Inizia dai giorni 5 e 6 postoperatori. Registra EEG continuo dalle 11:00 alle 17:00 ogni giorno. Se il materiale della lettiera ostacola l'accesso al naso del topo, rimuovere gradualmente l'eccesso di lettiere per garantire un accesso nasale chiaro, minimizzando il disturbo all'animale per ulteriori processi.

4. Condizionamento della paura 18,19

  1. Inizia il giorno postoperatorio 7 (o 8) tra le 10:00 e le 11:00. Come preparazione, spruzzare il 70% di etanolo nella camera di condizionamento (30 x 25 x 24 cm), che consiste in pareti in acrilico trasparente e un pavimento a griglia in acciaio inossidabile (barre di diametro 2,0 mm distanziate 6,0 mm tra loro).
  2. Protocollo di addestramento (sessione totale 1.100 s)
    1. Eroga cinque segnali uditivi (suono ascendente di 20 s, 5–20 kHz a 1,25 Hz, durata di 0,8 s) a 180 s, 400 s, 620 s, 840 s e 1060 s. Abbina ogni segnale sonoro con l'ammortizzatore del piede (1,0 mA, 2 s) erogato a 218 s, 438 s, 658 s, 878 s e 1098 s.

5. Privazione del sonno REM

  1. Gruppo di privazione del sonno REM (gruppo RSD)
    1. Immediatamente dopo il condizionamento della paura (ZT2-ZT8), monitorare l'EEG in tempo reale attivando il sistema di classificazione degli stadi del sonno basato su IA per consentire la rilevazione in tempo reale del sonno REM. Al momento della rilevazione del sonno REM, solleticare delicatamente il naso dell'animale con un pennello morbido finché non si risveglia, con una latenza media dall'inizio dello stimolo all'eccitazione di 0,89 ± 0,063 s (media ± SEM).
    2. Durante l'esperimento, l'eccitazione è stata definita come una risposta comportamentale allo stimolo tattile, in particolare al movimento dei baffi dopo la stimolazione. Annota il timestamp di ogni solletico per un'analisi successiva.
      NOTA: Il movimento di solletico è stato eseguito senza un schema direzionale fisso (ad esempio, avanti e indietro, verso l'alto o circolare), mantenendo però una stimolazione tattile leggera e costante limitata alla parte superiore del naso. Se il naso è ostruito, la stimolazione diretta verso la regione vibrissale (baffi), che di solito è esposta. Se il topo è rivolto lontano dal pennello, ruota la gabbia secondo necessità per garantire un accesso libero alla zona nasale. Quando si utilizza una gabbia con la parte superiore aperta, può essere applicata anche stimolazione dall'alto per garantire un accesso nasale o vibrissale costante.
  2. Gruppo di controllo con gioco (gruppo con gioco)
    1. Accoppia ogni topo con yoked a un corrispettivo privo di REM. Applica il solletico nasale al topo incastrato in sincronia con gli episodi REM del partner, corrispondendo sia all'inizio che alla durata. Ogni topo utilizza lo stesso pennello dedicato durante tutto l'esperimento di privazione del sonno REM. Dopo ogni utilizzo, spruzza il pennello con acqua leggermente acida e asciuga con un fazzoletto incalzabile. Lascia almeno 24 ore tra un utilizzo e l'altro per assicurarti che il pennello pulito sia completamente asciutto.

6. Test di richiamo della memoria

  1. Test di richiamo contestuale (Test A)
    1. Inizia da 24 ore (±3 ore) dopo la privazione del sonno. Riporta il topo nella camera di condizionamento originale (con odore di etanolo al 70%). Registra il comportamento di congelamento per 5 minuti.
  2. Test di richiamo con segnale sonoro (Test B)
    1. Svolgi la sessione 3 ore dopo il Test A.
    2. Preparazione del contesto: Spruzzare acqua nel contesto B (prisma triangolare (30 cm di altezza) composto da tre pareti con lati lunghi 31 cm, 24 cm e 24 cm. Due delle pareti sono rivestite con carta bianca, e la terza è fatta di acrilico trasparente attraverso cui si vede un rettangolo blu sullo sfondo. La struttura ha un pavimento in plastica e un soffitto in acrilico trasparente).
    3. Registra il comportamento di congelamento per 6 minuti. Esegui un unico segnale uditivo a 180 secondi identico all'allenamento a 180 secondi.

7. Analisi dei dati

  1. Punteggio della fase del sonno (Figura 1C-G)17
    1. Per ogni veglia/NREM/REM, calcola la quantità totale, il numero di episodi, la durata media degli episodi e il numero di transizione del sonno basandosi sui dati valutati da esperti umani. Criteri di ciascuna fase seguente.
      Scia di scia: bassa ampiezza, alta frequenza (β/γ)
      NREM: Alta ampiezza, bassa frequenza (δ)
      REM: A bassa ampiezza, dominante theta
  2. Qualità della privazione (Figura 1B)
    1. Valuta la fase del sonno durante la quale ogni stimolo del solletico viene applicato confrontando il suo timestamp con i dati EEG annotati da un esperto umano.
  3. Comportamento di congelamento (Figura 1H,J-K)
    1. Usa FreezeFrame4 (Actimetrics) per quantificare l'immobilità (esclusa la respirazione) durante i test di condizionamento della paura e di richiamo.
      1. Avvia il software FreezeFrame 4 e seleziona modalità Registratore . Dal menu File (angolo in alto a sinistra), specifica la cartella di destinazione per salvare i file di registrazione. Nei quattro campi di input bianchi sul pannello sinistro, inserisci identificatori unici corrispondenti a ciascun mouse, assicurandoti l'allineamento con le quattro finestre di visualizzazione dei file sul lato destro dello schermo.
      2. Clicca sul pannello Protocollo in basso nell'interfaccia e definisci i parametri di registrazione, inclusa la durata totale della registrazione e il tempismo dei segnali uditivi e delle scosse ai piedi secondo il disegno sperimentale.
      3. Clicca su Riferimento al centro dello schermo per acquisire l'immagine di riferimento sullo sfondo. Metti il mouse nella camera di condizionamento, poi clicca su Start per iniziare la registrazione.
  4. Analisi dell'indice di discriminazione (Figura 1L)
    1. Calcola l'indice di discriminazione con la seguente formula:
      Congelamento in media di 5 minuti nel test A - Congelamento nei primi 3 minuti media nel test B) / Congelamento massimo in 5 minuti media nel test A, congelamento nei primi 3 minuti di media nel test B.
  5. Analisi dell'indice di reattività da shock (Figura 1I)
    1. Usa la traccia a mano per misurare il movimento bidimensionale degli animali 2 prima e dopo lo shock nel punto di partenza della sessione di condizionamento della paura. Calcola l'indice di reattività da shock con la seguente formula:
      Movimento durante lo shock - movimento preshock / movimento durante shock + movimento preshock

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Results

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Impianto chirurgico di elettrodi EEG
I topi dovrebbero essere completamente anestetizzati durante l'intervento. Se mostrano segni di fallimento dell'anestesia, come difficoltà, dovrebbero essere rimossi dal protocollo. Allo stesso modo, se il sanguinamento dura più di 10 secondi, può causare gravi danni al cervello del topo, e si raccomanda la rimozione tramite sperimentazione. Dopo l'intervento, la maggior parte dei topi si sveglia tipicamente entro 1 ora. Il loro mo...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo consente la privazione selettiva del sonno REM nei topi con topi di controllo con il gioco. A differenza dei metodi tradizionali come il vaso fioriare e le tecniche del disco rotante, questo sistema consente l'implementazione di gruppi di controllo finemente abbinati, in cui gli animali ricevono una stimolazione identica nello stesso momento circadiano. Inoltre, questo approccio riduce la variabilità nella posizione della stimolazione, una limitazione comune dei metodi ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere interessi in conflitto.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo Y. Nakata per la classificazione dello stadio del sonno. Ringraziamo tutti i membri dell'IIIS. Questo lavoro è sostenuto da sovvenzioni di AMED JP21zf0127005, JP21km0908001, JP23wm0525003, Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (26H02428, 24H00894, 23H02784, 22H00469, 16H06280 a M.S., 23K19393 e 24K18212 a I.K., 25KJ0664 a C.K., 24H00893 a T.N.) e Takeda Science Foundation.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
5% glucosioOtsukba35061410
Header a 6 pinHirose172-0989
AdesivoKonishi16351
Macchina anesteticaShinano SeisakushoSN-487-0T
Involucro a crimpaturaHirose688-9095
Presa a crimpHirose688-8982
Freezeflame4Associati MediciRRID:SCR_014429Versione 4.104
GraphPad PrismGraphPadRRID:SCR_002798Versione 10.5.0
IbuprofeneIndustria chimica di TokyoI0415
IsofluranoViatris901036504
Loctite454HenkelUFI:  MAK2-7WRP-G202-F235
Mouse (C57BL/6J)Il Laboratorio JacksonRRID: IMSR_JAX:00066411,0 - 13,0 settimane di età durante una sessione di condizionamento della paura
PennelloNamurataiseidou4943668000448SDflat n.8, lunghezza della punta: 8,2 mm; larghezza: 18,8 mm
Liquido ProviniceShofu21400BZZ00451000250 mL
Polvere ProviniceShofu21400BZZ00451000250 g
SleepSignRecorderKISSEI COMTECRRID:SCR_018200Versione 1.2.10
Vite in acciaio inoxYamazakiN/Aφ 1.0 e tempi; 2.0
Strumenti stereotassici standardALA Scientific68038
Olio di girasoleSigma-AldrichS5007-250ML
Petrolato biancoTaiyo PharmaceuticalK09-TS

References

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REM Sleep DeprivationSelective REM DeprivationSNiFFer MethodRodent SleepSleep Stage ClassificationEEG MonitoringYoked ControlTrace Fear ConditioningMemory ConsolidationTactile Stimulation

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