Articolo metodologico

Precondizionamento termico durante la perfusione polmonare ex-vivo per la riabilitazione di innesti polmonari danneggiati prima del trapianto

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DOI:

10.3791/69084

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31 ottobre 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Service of Thoracic Surgery, Department of Surgery and Anesthesiology Services, Lausanne University Hospital and Faculty of Biology and Medicine, Lausanne University, 2Service of Adult Intensive Care Medicine, Department of Interdisciplinary Centers and Logistics, Lausanne University Hospital and Faculty of Biology and Medicine, Lausanne University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo presenta un modello di perfusione polmonare ex-vivo di ratto che incorpora un'esposizione transitoria a uno stress termico calibrato, promuovendo meccanismi protettivi endogeni per il ricondizionamento terapeutico di innesti polmonari danneggiati. L'approccio è scalabile e riproducibile e supporta lo sviluppo di terapie non farmacologiche per migliorare il successo del trapianto di polmone.

Abstract

La perfusione polmonare ex-vivo (EVLP) è emersa come una svolta nel trapianto di polmone, consentendo sia la valutazione funzionale dei polmoni del donatore che gli interventi terapeutici per riabilitare gli innesti marginali. Le strategie di ricondizionamento includono approcci farmacologici e non farmacologici. Tra questi ultimi, abbiamo dimostrato che lo stress termico transitorio e controllato ("Thermal Preconditioning", TP) è un mezzo efficace per ripristinare i polmoni danneggiati inducendo una risposta protettiva endogena allo shock termico. Qui, presentiamo un protocollo passo-passo per un modello EVLP di ratto che incorpora TP per ricondizionare i polmoni sottoposti a ischemia calda, simulando la donazione dopo la morte circolatoria (DCD). Il protocollo descrive in dettaglio la preparazione polmonare, l'incannulamento, la perfusione e l'induzione della risposta allo shock termico. La TP consiste in un aumento di 30 minuti della temperatura del perfusato a 41,5 °C all'inizio dell'EVLP, seguito da un rapido ritorno a 37 °C per il resto della perfusione. In un modello EVLP di 6 ore, i polmoni trattati con TP (n = 30) hanno mostrato un aumento dell'espressione della proteina 70 da shock termico, una migliore compliance polmonare statica, una riduzione dell'edema, un minor rilascio del fattore di von Willebrand (un biomarcatore di lesione endoteliale) e un danno istologico attenuato rispetto ai controlli (n = 30). Il protocollo consente il monitoraggio in tempo reale della resistenza vascolare, delle pressioni delle vie aeree, della compliance polmonare e dell'ossigenazione e supporta le analisi molecolari e morfologiche sia nel perfusato che nei tessuti. Questo protocollo riproducibile e scalabile è adattabile a sistemi EVLP animali o umani più grandi, fornendo una pratica piattaforma traslazionale per lo studio di interventi non farmacologici volti a migliorare i risultati dei trapianti.

Introduzione

La perfusione polmonare ex-vivo (EVLP) ha rappresentato un importante progresso nel campo del trapianto di polmone. Il suo impatto principale risiede nell'espansione del pool di innesti polmonari da donatore disponibili, consentendo la valutazione funzionale dei polmoni marginali per consentire l'uso di organi che altrimenti verrebbero scartati per il trapianto 1,2. I polmoni del donatore marginali (o criteri estesi) si riferiscono a uno o più dei seguenti criteri: età del donatore superiore a 55 anni, PaO2/FiO2 inferiore a 300, tempo di ischemia superiore a 6 ore, microbiologia dell'espettorato positiva, radiografia anormale3. Oltre alla valutazione fisiologica, l'EVLP può fungere da piattaforma per l'applicazione di vari interventi terapeutici volti a migliorare la qualità dell'innesto prima del trapianto (concetto di ricondizionamento terapeutico)4. In quanto tale, l'EVLP offre l'opportunità unica di riabilitare i polmoni danneggiati (marginali) e ridurre il rischio di disfunzione primaria del trapianto (PGD), una complicanza importante che compromette sia gli esiti precoci che quelli a lungo termine dopo il trapianto di polmone 5,6. La PGD è l'espressione clinica del processo di danno da ischemia-riperfusione (IRI), la cui fisiopatologia si basa sullo stress ossidativo, sull'infiammazione, sull'attivazione delle cascate del complemento e della coagulazione e sull'induzione dei processi di morte cellulare 7,8,9. In definitiva, questi meccanismi contribuiscono a interrompere le normali funzioni dell'endotelio e dell'epitelio polmonare, portando a edema polmonare non cardiogeno con ridotta capacità di ossigenazione, i due tratti distintivi chiave della PGD 6,10,11,12.

Un numero crescente di studi sperimentali, sia preclinici che clinici, ha dimostrato l'efficacia di varie strategie terapeutiche ex-vivo per alleviare l'IRI durante il trapianto di polmone. Gli esempi includono agenti farmacologici che prendono di mira ossidanti e radicali liberi, vie di morte cellulare, mediatori infiammatori, nonché terapie cellulari e geniche, per citarne solo alcuni 13,14,15,16,17,18,19,20. Oltre a tali approcci terapeutici, l'EVLP può anche fungere da piattaforma per l'applicazione dello stress fisiologico direttamente al trapianto polmonare, per suscitare meccanismi protettivi intrinseci che forniscono una tolleranza adattativa ai successivi insulti fisiopatologici. Una di queste strategie prevede l'applicazione di stress termico transitorio e non letale all'innesto polmonare durante l'EVLP. Infatti, è noto da tempo che le condizioni di stress termico promuovono una risposta adattativa allo shock termico, derivante dall'espressione di una serie di proteine da shock termico (HSP) che agiscono come chaperoni molecolari e conferiscono resistenza a un'ulteriore esposizione a vari stimoli stressanti21. Oltre all'induzione dell'HSP, sono stati identificati alcuni adattamenti cellulari aggiuntivi in seguito all'esposizione al calore, tra cui (a) la via antiossidante e citoprotettiva del fattore 2 correlato a NF-E2 (NRF2), la cui attivazione in seguito a stress termico sovraregola notevolmente il gene citoprotettivo eme ossigenasi22,23; (b) la risposta proteica dispiegata (UPR), che si occupa di stress proteotossico nel reticolo endoplasmatico (ER stress), e la cui attivazione da parte del calore può essere protettiva o dannosa, a seconda dell'intensità dello stress termico 24,25,26; c) autofagia, un processo citoprotettivo che promuove la degradazione lisosomiale di organelli e macromolecole danneggiati, che può essere attivato o inibito dal calore in modo dipendente dalla temperatura e dal tempo27,28.

Abbiamo dimostrato che tale "precondizionamento termico" fornisce importanti benefici in termini di riduzione dello stress ossidativo, infiammazione, morte cellulare e disfunzione endoteliale, portando a una protezione significativa contro l'IRI polmonare. Pertanto, abbiamo proposto che il precondizionamento termico possa rappresentare un nuovo metodo non farmacologico per la riabilitazione terapeutica ex-vivo di innesti polmonari danneggiati prima del trapianto 29,30,31. Il precondizionamento termico può offrire diversi vantaggi rispetto alle strategie farmacologiche e non farmacologiche esistenti. Suscitando una risposta endogena cellulare integrata, può fornire contemporaneamente protezione contro diverse vie fisiopatologiche relative all'IRI, mentre altre strategie generalmente mirano a una singola via. Inoltre, evita il rischio di potenziali effetti collaterali associati all'uso di composti farmacologici. Lo scopo del presente articolo è quello di presentare un dettagliato protocollo passo-passo di precondizionamento termico durante la perfusione polmonare ex-vivo di polmoni di ratto danneggiati, che potrebbe essere applicato in diversi contesti, in particolare a modelli animali più grandi o polmoni umani per scopi di ricerca.

Utilizziamo il sistema polmonare perfuso isolato di ratto IPL-2 per EVLP. La configurazione è descritta nella Figura 1 e include quanto segue: Serbatoio di perfusato (Figura 1-1); due pompe a rulli, per la circolazione del perfusato (Figura 1-2A) e il campionamento del perfusato (Figura 1-2B); un bagno d'acqua termostatico (Figura 1-3) per il mantenimento della temperatura del perfusista; uno scambiatore di gas a membrana (Figura 1-4) collegato a un serbatoio di gas (non raffigurato) contenente una miscela di 6% O2, 10% CO2 e 84% N2 per deossigenare e carbossilare il perfuso di afflusso; due sensori di pressione (Figura 1-5) per monitorare la pressione dell'atrio sinistro (LA) e dell'arteria polmonare (PA) (il sensore di pressione PA non è visibile in figura); una camera riscaldata e sigillata (Figura 1-6) che ospita il blocco cuore-polmone con connessioni dedicate per PA, LA e cannule tracheali; un ventilatore (Figura 1-7) collegato alla cannula tracheale per la ventilazione polmonare e per la misurazione della pressione delle vie aeree e della compliance polmonare statica; un termometro elettronico (Figura 1-8) per visualizzare la temperatura del perfusato a livello dell'afflusso di PA. Una piattaforma di connessione (Figura 1-9) i cui elementi sono mostrati in dettaglio nella Figura 2: Connessione per le cannule PA (Figura 2-1), LA (Figura 2-2) e tracheale (Figura 2-3); collegamento a un modulo di peso (Figura 2-4) per il monitoraggio continuo del peso del blocco cuore-polmone; Un sensore di temperatura (Figura 2-5) per il monitoraggio della temperatura del perfusato all'ingresso del PA. Una descrizione schematica dettagliata del circuito può essere trovata altrove18.

Protocollo

NOTA: Per questo studio sono stati utilizzati ratti maschi adulti di Sprague-Dawley (n = 60; età, 8-11 settimane; peso, 300-450 g). Gli animali sono stati alloggiati (2 ratti/gabbia) nella nostra struttura per animali locale, mantenuti in un ciclo di 12 ore di luce/12 ore di buio con accesso illimitato a cibo e acqua. Tutti gli animali sono stati trattati in conformità con le "Linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio" (Pubblicazione NIH n. 96-23) e tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con il protocollo sperimentale approvato dal nostro comitato locale per la cura degli animali (Direction Générale de l'Agriculture, la Viticulture et Affaires Vétérinaires de l'Etat de Vaud (autorizzazioni 3456a e 3456x1). Le dimensioni e il peso degli animali sono stati selezionati sulla base dei nostri studi precedenti nel modello EVLP di ratto e per comodità anatomica (dimensioni dei polmoni e dei vasi). Il ceppo Sprague-Dawley è stato scelto, dato che altri ceppi (in particolare i ratti Wistar) possono mostrare reazioni di ipersensibilità alla soluzione di destrano presente nella soluzione di perfusato 1,32.

1. Descrizione generale del circuito EVLP

NOTA: La configurazione è descritta nella Figura 1 e gli elementi della piattaforma di connessione (Figura 1-9) sono visualizzati in dettaglio nella Figura 2. Una descrizione schematica dettagliata del circuito è stata descritta in precedenza18.

  1. Utilizzare una soluzione extracellulare tamponata acellulare per la perfusione ex-vivo . Assicurarsi che il perfusato fluisca dal serbatoio attraverso lo scambiatore di gas e sia diretto attraverso la cannula PA per la perfusione polmonare e quindi esca attraverso la cannula LA per tornare al serbatoio. Monitora continuamente le pressioni di afflusso (PA) e di deflusso (LA).
  2. Collegare tutti i trasduttori (pressione PA, pressione LA, peso polmonare, velocità della pompa) alla scatola del convertitore analogico/digitale (Figura 3). Aprire il software di acquisizione dati di base (BDAS). Calibrare i segnali di pressione utilizzando la calibrazione a due punti (0; 10 cm H2O) utilizzando una colonna d'acqua. Calibrare il modulo pesi utilizzando la calibrazione a due punti (0 g e 1 g). Calibrare la velocità della pompa utilizzando un campionamento perfusato di 1 minuto a 10 mL/min. Controllare la qualità dei segnali applicando pressioni note e velocità della pompa e valutando l'adeguatezza dei risultati (il protocollo dettagliato e il video per la calibrazione dei segnali sono disponibili in materiali supplementari).
  3. Registra tutti i parametri chiave (PA, pressioni LA, peso polmonare e flusso) in tempo reale tramite il software del sistema e osserva la loro visualizzazione su un personal computer.
    NOTA: I segnali fisiologici registrati dal BDAS vengono esportati in un file di testo utilizzando il comando Esporta file nella barra dei menu. I dati estratti in punti temporali selezionati (ogni 60 minuti) vengono trasferiti su un foglio di calcolo e quindi copiati/incollati nel software per l'analisi statistica.
  4. Calcolare la resistenza vascolare polmonare (PVR) utilizzando l'equazione (1):
    figure-protocol-1(1)
  5. Ottenere campioni (1-2 mL) del perfusato in punti temporali dedicati per le misure di vari marcatori biologici.

2. Applicazione di precondizionamento termico

  1. Collegare un bagnomaria termostatico (Figura 4-1) per garantire una temperatura dell'acqua costante, precisa e regolabile per il riscaldamento perfusissimo. Utilizzare una motopompa integrata all'interno del bagnomaria per far circolare l'acqua riscaldata.
  2. Utilizzare un contenitore di vetro a doppia parete come serbatoio (Figura 4-2) per mantenere la temperatura del perfusato facendo circolare l'acqua riscaldata tra le pareti del contenitore.
  3. Utilizzare una serpentina di riscaldamento con tubo a serpentina all'interno di un contenitore d'acqua riscaldato (Figura 4-3) per azionare il perfusato, consentendo lo scambio di calore dall'acqua al perfusato immediatamente prima che entri nella preparazione polmonare ex-vivo.
  4. Alloggiare il blocco cuore-polmone nella camera dell'organo (Figura 4-4), un contenitore a doppia parete riempito con acqua che circola dal bagno d'acqua termostatico per mantenere un ambiente caldo.
  5. Per il sensore di temperatura e il termometro (Figura 2-5 e Figura 4-5), applicare in modo sicuro e fermo un sensore aria/superficie a microsfere di tipo K contro la cannula di afflusso per il monitoraggio continuo della temperatura effettiva del perfusato che entra nell'arteria polmonare (PA). La temperatura viene visualizzata su un termometro digitale.
  6. Per mantenere la temperatura dell'afflusso a 37 °C, impostare il bagnomaria a 38-38,5 °C.
    NOTA: Per compensare le perdite di calore dovute al perfusato lungo il suo percorso nel tubo, abbiamo determinato nelle nostre condizioni che la temperatura del bagno d'acqua doveva essere impostata a 38-38,5 °C per mantenere i 37 °C in afflusso. A seconda delle perdite di calore dovute al perfusato, potrebbe essere necessario adattare queste impostazioni per garantire la temperatura desiderata all'ingresso.
  7. Avviare il protocollo di riscaldamento ex-vivo dopo 60 minuti di EVLP aumentando la temperatura del bagno d'acqua fino a 43 °C per raggiungere una temperatura di afflusso di 41,5 °C, che si ottiene in 5 minuti e si mantiene in 30 minuti.
    NOTA: Nel nostro precedente lavoro29, abbiamo determinato la temperatura ottimale per il precondizionamento termico (TP), utilizzando un intervallo di temperature da 40 °C a 43,5 °C e un protocollo EVLP di 3 ore, come illustrato nella Figura 5. La temperatura di riscaldamento che fornisce una protezione ottimale senza effetti dannosi (come riassunto nella Figura 5B) è risultata essere di 41,5 °C. Questa temperatura è stata quindi utilizzata in tutti i nostri esperimenti successivi, con durate EVLP fino a 6 ore29,30,31.
  8. Dopo questo riscaldamento transitorio, aggiungere ghiaccio al bagnomaria per ridurre rapidamente (in 5 minuti) la temperatura del bagnomaria a 38 °C per riportare la temperatura del perfusato nella cannula di afflusso a 37 °C e mantenere questa temperatura fino alla fine del protocollo EVLP.
  9. Determinare le variabili fisiologiche (compliance polmonare), la formazione dell'edema e gli endpoint molecolari (espressione di proteine da shock termico, enzimi antiossidanti, citochine infiammatorie e biomarcatori di apoptosi, autofagia, stress del reticolo endoplasmatico e danno alle cellule endoteliali).

3. Protocollo EVLP dettagliato per il precondizionamento termico

  1. Preparazione degli animali
    1. Preparare i materiali necessari, comprese le cannule e gli strumenti chirurgici (Figura 6A, B e Tabella dei materiali).
    2. Pesare l'animale per calcolare i dosaggi appropriati per tutte le sostanze somministrate, il flusso di perfusato e i parametri di ventilazione.
    3. Preparare la miscela anestetica: 80 mg/kg di ketamina e 8 mg/kg di xilazina nella stessa siringa.
      NOTA: Gli agenti anestetici devono essere conservati in un armadietto sicuro.
    4. Preparare eparina, 1,7 U/g di peso corporeo in soluzione salina isotonica (siringa da 1 ml).
    5. Anestetizzare l'animale, utilizzando isoflurano al 5% (vaporizzato in una camera di induzione dedicata), seguito da iniezione intraperitoneale della miscela anestetica preparata. Mantenere l'anestesia con isoflurano all'1-2% tramite una maschera facciale.
      NOTA: È importante mantenere un'anestesia profonda per evitare di ansimare durante il dissanguamento.
      Utilizzare una configurazione con un sistema di estrazione dell'isoflurano per proteggere l'operatore.
      Gettare tutti gli aghi e le siringhe in contenitori appropriati per rifiuti a rischio biologico e appuntiti. I contenitori sigillati per oggetti taglienti e a rischio biologico vengono quindi smaltiti attraverso i flussi di rifiuti designati.
    6. Radi l'animale dalla gola alla zona del pene e rimuovi il pelo rimasto usando carta calda e umida.
    7. Verificare la profondità dell'anestesia pizzicando la zampa posteriore; aumentare la concentrazione di isoflurano se sono presenti riflessi.
    8. Metti l'animale in posizione supina e fissa tutti e quattro gli arti con del nastro adesivo.
  2. Estrazione del blocco cuore-polmone per EVLP
    NOTA: La procedura richiede una formazione intensiva per eseguire i diversi passaggi in modo tempestivo, atraumatico e altamente riproducibile. La fase più delicata è l'incannulamento dell'arteria polmonare, che deve essere eseguita sotto ingrandimento utilizzando un microscopio operatorio speculare per ottenere i migliori risultati. L'intera procedura può essere eseguita da un singolo ricercatore ben addestrato. Per raggiungere tale indipendenza sperimentale, sono necessarie almeno 15 procedure complete sotto la supervisione di un ricercatore esperto.
    1. Sollevare delicatamente la pelle sulla linea mediana della gola e praticare un'incisione longitudinale di 5 cm lungo l'asse caudale-cefalico utilizzando piccole forbici.
    2. Separare i lobi delle ghiandole salivari e sezionare attentamente la fascia sopra i muscoli sternoioidei usando una pinza curva fino a quando la laringe e la trachea non sono chiaramente esposte.
    3. Passare una sutura di seta 4-0 sotto la trachea e preparare un nodo prelegato, lasciando la pinza in posizione sotto la trachea.
    4. Calcolare il volume corrente (Vt) per la ventilazione in vivo e l'approvvigionamento polmonare utilizzando la formula di Stahl33:
      figure-protocol-2× figure-protocol-3
    5. Impostare il ventilatore dedicato alla ventilazione in vivo e all'approvvigionamento polmonare (vedere la Tabella dei materiali) sul volume corrente calcolato con una frequenza respiratoria di 70 respiri/min, una frazione inspirata di ossigeno (FiO2) di 0,5 e una pressione positiva di fine espirazione (PEEP) di 3 cm H2O.
      NOTA: Per impostare la PEEP a 3 cm H2O, collegare il braccio espiratorio del ventilatore a un tubo in silicone polimerizzato al platino inserito 3 cm sotto la superficie di un contenitore pieno d'acqua.
    6. Creare un'incisione trasversale tra due anelli cartilaginei, inserire una cannula di 2 mm di diametro esterno (lunghezza 14 mm, cannula di ventilazione EVLP, Figura 6B) per la ventilazione e fissarla stringendo la sutura.
    7. Collegare la cannula al ventilatore e confermare l'efficacia della ventilazione grazie alla presenza di bolle nel contenitore pieno d'acqua collegato al braccio espiratorio del ventilatore.
    8. Usando le forbici a punta smussata, incidere la pelle lungo l'addome ed entrare nella cavità peritoneale, continuare incidendo i muscoli della parete addominale della linea mediana fino al diaframma.
    9. Sposta delicatamente l'intestino da parte usando dei batuffoli di cotone per esporre la vena cava inferiore.
    10. Iniettare la soluzione di eparina preparata nella vena e lasciarla circolare per 5 minuti. Quindi, sezionare la vena cava e l'aorta per il dissanguamento.
    11. Una volta che l'animale è completamente dissanguato e confermato morto, interrompere la ventilazione e scollegare il ventilatore dalla cannula tracheale per consentire ai polmoni di sgonfiarsi, segnando l'inizio dell'ischemia calda. Mantenere il tempo ischemico caldo totale (WIT) a 1 ora.
      NOTA: Sebbene il WIT mediano riportato nella donazione clinica di polmone DCD sia di 33 minuti, non sono stati riportati effetti dannosi di durate del WIT fino a 60 minuti sulla sopravvivenza a 1 anno. Pertanto, la maggior parte dei centri attualmente concorda su 60-90 minuti come limite superiore accettabile diWIT 34. Come descritto in precedenza, l'uso di 1 h WIT nel nostro modello di ratto è quindi rilevante per lo scenario clinico35.
    12. Quindici minuti prima della fine del tempo ischemico caldo totale di 1 ora (cioè dopo 45 minuti di ischemia calda), riempire una siringa da 60 ml (fissata su un supporto) con soluzione di conservazione fredda (4 °C, conservata in frigorifero) (vedere la composizione nella Tabella 1).
      NOTA: La parte inferiore della siringa è posizionata a 20 cm sopra l'animale. Collegare la siringa alla cannula PA, utilizzando un tubo in silicone immerso in acqua ghiacciata (Figura 6C).
    13. Eseguire una sternotomia mediana utilizzando le forbici Lister smussate per evitare di danneggiare il tessuto e ritrarre con cura la parete toracica utilizzando divaricatori smussati attaccati a fasce elastiche e un emostatico a microzanzara attaccato al diaframma per esporre i polmoni. Evitare qualsiasi contatto diretto con il parenchima polmonare.
      NOTA: Da questo passaggio, per prevenire l'essiccazione dei tessuti, applicare una piccola quantità di soluzione fisiologica sulla superficie del polmone quando necessario.
    14. Praticare un'incisione a "X" all'apice del ventricolo sinistro del cuore e far scorrere le forbici all'interno del cuore fino all'atrio sinistro per facilitare il successivo inserimento della cannula LA.
    15. Passare una sutura di seta 5-0 sotto il PA principale e preparare un doppio nodo pre-legato e tenere la sutura su un lato con un supporto fatto in casa (Figura 6D e Figura 7A).
    16. Preparare una sutura aggiuntiva attorno al cuore per il successivo fissaggio della cannula LA (Figura 7B).
    17. Praticare una piccola incisione nel PA principale e inserire la cannula PA, assicurandosi che non vengano introdotte bolle d'aria.
    18. Perfondere immediatamente i polmoni con 25 mL di soluzione di conservazione a freddo attraverso la cannula PA, avviando il tempo di ischemia a freddo.
      NOTA: Utilizzare una pressione passiva dall'altezza della siringa sul supporto sopra descritto per questa perfusione.
    19. Fissare la cannula in posizione con la sutura prelegata.
    20. Subito dopo l'incannulamento dell'AP, ricollegare la cannula tracheale al ventilatore e riprendere la ventilazione con le impostazioni iniziali, riducendo la frequenza respiratoria a 25 respiri/min.
    21. Inserire la cannula LA attraverso l'incisione nel ventricolo sinistro nell'atrio sinistro.
    22. Fissare la cannula con la seconda sutura pre-legata (intorno al cuore), facendo attenzione a evitare che il flusso venga ostacolato dall'atrio sinistro e lasciare passare l'intero volume di 25 ml di soluzione di conservazione a freddo (richiede ~15 min).
    23. Al termine della perfusione della soluzione di conservazione, bloccare la cannula PA con una pinza bulldog (Figura 7C, cerchio blu) e scollegarla dal tubo.
    24. Sezionare con cura la trachea e i tessuti circostanti per mobilizzare i polmoni.
    25. Bloccare la trachea utilizzando una clip per aneurisma (Figura 7C, cerchio rosso), mentre i polmoni sono completamente gonfiati (un volume corrente).
    26. Sezionare l'aorta discendente e gli altri vasi di supporto per liberare il blocco cuore-polmone, sollevandolo afferrando delicatamente la trachea.
    27. Porre il blocco cuore-polmone in una capsula contenente soluzione di conservazione in posizione prona e conservare a 4 °C per un tempo totale di ischemia fredda di 1 ora.
      NOTA: Al termine dell'intervento porre i resti biologici nei sacchetti per lo smaltimento dei rifiuti per un'ulteriore eliminazione da parte del servizio dedicato.
  3. Ex-vivo Perfusione polmonare e precondizionamento termico
    NOTA: Fare riferimento al diagramma di flusso che delinea i passaggi principali per guidare la progressione attraverso le diverse fasi del protocollo (Figura 8).
    1. Mettere un secchiello per il ghiaccio nel bagnomaria termostatico per ridurre la temperatura del perfusato a 15 °C.
    2. Riempire il serbatoio con 100 ml di perfusato e lasciarlo circolare attraverso il sistema. Utilizzare la soluzione di perfusione a base di albumina umana (vedere la composizione nella Tabella 1) come soluzione extracellulare tamponata acellulare per la perfusione ex-vivo .
    3. Misurare il pH del perfusato e mantenerlo a un livello fisiologico (7,35-7,45), aggiungere di conseguenza il tampone tris(idrossimetil)amnometano (THAM).
    4. Pesare il blocco cuore-polmone e montarlo sul sistema EVLP, iniziando dalla cannula di ventilazione mantenendo la clip per aneurisma in posizione sulla trachea.
    5. Collegare la cannula PA, evitando accuratamente l'introduzione di bolle d'aria nel sistema vascolare polmonare (assicurarsi che la trappola per bolle sia riempita).
    6. Lasciare uscire alcune gocce di soluzione di perfusione e collegare la cannula LA.
    7. Impostare la pressione atriale sinistra a 3 mm Hg regolando l'altezza della linea di deflusso collegata al circuito di drenaggio.
    8. Azzerare il modulo di peso e monitorare la variazione di peso del blocco cuore-polmone durante l'EVLP.
    9. Calcola la gittata cardiaca teorica (CO) utilizzando la formula sviluppata da Lindstedt e Schaeffer:
      figure-protocol-4
    10. Avviare la perfusione (2% del CO teorico) e aumentare gradualmente il flusso di perfusato (7,5% del CO teorico) e la temperatura secondo i parametri specificati, come indicato nella Tabella 2.
      NOTA: Durante l'EVLP, il flusso di perfusato è impostato tra il 2% e il 7,5% del CO teorico calcolato. Questo basso flusso di perfusato permette di mantenere la pressione arteriosa polmonare entro intervalli normali e di ridurre il rischio di edema polmonare precoce, soprattutto nei polmoni ischemici caldi danneggiati. Ciò consente agli utenti di mantenere la preparazione per lunghi periodi di tempo. Altri ricercatori hanno utilizzato flussi comparabili per l'EVLP di ratto, mentre altri hanno utilizzato flussi fino al 20% del CO38 teorico.
    11. Regolare la temperatura del perfusato aumentando progressivamente la temperatura del bagnomaria.
      NOTA: Fare attenzione a tenere le mani lontane da tutte le apparecchiature di riscaldamento per evitare possibili lesioni.
    12. Una volta raggiunta la temperatura del perfusato a 35 °C, avviare la ventilazione meccanica rimuovendo la clip per aneurisma dalla trachea e avviando il ventilatore dedicato alla ventilazione ex-vivo (vedi Tabella dei Materiali).
      NOTA: La calibrazione della pressione viene eseguita ogni 14 giorni utilizzando la calibrazione a due punti (0 e 30 cm H2O). La calibrazione del tubo viene eseguita ad ogni utilizzo secondo un protocollo programmato, per correggere fattori esterni legati alla resistenza di tubi e cannula.
      1. Utilizzare il software di riferimento per le impostazioni del ventilatore e l'acquisizione dei dati, in quanto fornisce registrazioni continue dei segnali respiratori e della compliance polmonare in punti temporali dedicati (vedi diagramma di flusso, Figura 8), secondo un protocollo programmato di aumento graduale del volume polmonare con misurazione concomitante della pressione delle vie aeree.
      2. La conformità viene quindi calcolata automaticamente da un'equazione adattata al lembo di sgonfiaggio del circuito pressione-volume (equazione di Salazar-Knowles).
      3. Visualizza tutti i dati ventilatori, archiviali su un personal computer dedicato ed esportali in un foglio di calcolo. Estrai i dati in punti temporali selezionati, trasferiscili su un altro foglio di calcolo e quindi copiali/incollali nel software di analisi statistica.
    13. Impostare la frequenza respiratoria e il volume corrente rispettivamente a 7 corse/min e 3 ml/kg per 10 minuti, quindi aumentare a 15 corse/min e 6 ml/kg per 10 minuti e, infine, 30 corse/min e 6 ml/kg fino alla fine dell'EVLP. Impostare la pressione positiva di fine espirazione (PEEP) a 3 cm H2O per tutta la durata dell'EVLP (Tabella 2).
    14. Applicare una manovra di reclutamento ogni 30 minuti di EVLP per prevenire l'atelettasia impostando la pressione delle vie aeree a 15 cm H2O per 6 s.
    15. A 1 ora, 2 ore, 3 ore, 4,5 ore e 6 ore EVLP, applicare un gonfiaggio polmonare graduale fino a un volume polmonare totale di 10 ml/kg di peso corporeo per determinare la compliance polmonare e la pressione inspiratoria di picco (Pmax).
      NOTA: Le misurazioni di conformità vengono eseguite a seguito di una manovra di reclutamento descritta sopra.
    16. Aumentare la temperatura del perfusato fino a raggiungere i 37 °C alla cannula PA in ingresso dopo 60 minuti EVLP.
    17. Avviare il protocollo di riscaldamento ex-vivo dopo 60 minuti di EVLP.
    18. Aumentare la temperatura del bagno d'acqua fino a 43 °C per raggiungere i 41,5 °C alla cannula PA in ingresso (questo richiede ~ 5 min), come mostrato nella Figura 2, Figura 3 e Figura 4-5.
    19. Mantenere questa temperatura da 60 minuti a 90 minuti EVLP (totale di 30 minuti).
      NOTA: Nel nostro lavoro precedente, abbiamo dimostrato che 41,5 °C per 30 minuti non hanno promosso il danno termico a livello dell'intero polmone29. Non abbiamo eseguito saggi specifici di vitalità cellulare in vitro per testare il danno termico in tali condizioni.
    20. Dopo 30 minuti di riscaldamento, aggiungere ghiaccio al bagnomaria per riportare rapidamente (5 minuti) la temperatura della cannula di afflusso a 37 °C.
      NOTA: Nel gruppo di controllo, la temperatura del perfusato viene mantenuta a 37 °C per tutta la durata dell'EVLP, senza applicazione di precondizionamento termico (vedere la Tabella 2). Non incorporiamo un gruppo di "riscaldamento fittizio" (ad esempio, mediante regolazione del calore a bagno d'acqua senza aumento della temperatura).
    21. Mantenere la temperatura del perfusato a 37 °C sulla cannula PA in ingresso fino alla fine dell'EVLP.
    22. Raccogliere campioni di soluzione di perfusato a 1 ora, 2 ore, 3 ore, 4,5 ore (1-2 ml in ogni punto temporale) e 6 ore (10 ml) di EVLP, da una delle porte di campionamento collegate al circuito (a monte o a valle della preparazione polmonare), come mostrato nella Figura 1-2B. Utilizzare immediatamente i campioni per le analisi dei gas (misurazione di pH, PCO2 e PO2, utilizzando la cartuccia CG4+). Per ulteriori misurazioni biochimiche, centrifugare i campioni (500 × g, 10 min a 4 °C) e mantenere il surnatante limpido a -80 °C fino al momento dell'uso.
    23. Dopo 6 ore di EVLP, riapplicare la clip per aneurisma sulla trachea (una volta che il polmone è completamente gonfiato) e bloccare la cannula PA con una pinza per bulldog.
    24. Pesare il blocco cuore-polmone per ottenere il suo peso finale.
      NOTA: l'aumento di peso durante l'EVLP può essere valutato come la differenza tra il peso finale e quello iniziale o può essere monitorato continuamente durante l'EVLP con il modulo di peso sopra descritto.
    25. Sezionare attentamente i polmoni, separando i singoli lobi.
    26. Conservare il tessuto per le applicazioni a valle: congelare a scatto in azoto liquido e conservare a -80 °C per analisi biochimiche o fissare in paraformaldeide (PFA) per la valutazione istologica. Il polmone sinistro può essere conservato e preparato per il trapianto di polmone.

4. Statistiche

  1. Assegnare gli animali a gruppi di trattamento specifici (controllo rispetto al precondizionamento termico, n = 5/gruppo per ogni endpoint sperimentale).
    NOTA: Non assegniamo gli animali in modo casuale all'uno o all'altro gruppo, ma i gruppi si alternano ogni giorno. Il protocollo (calore vs controllo) non può essere eseguito in cieco, a causa della necessità di conoscere rigorosamente la temperatura del perfusato durante gli esperimenti. Al contrario, le analisi biologiche e istologiche vengono eseguite in cieco, senza l'identificazione del gruppo di trattamento assegnato.
  2. Analizza i dati.
  3. Esprimi i risultati come mezzi ± SEM.
  4. Verificare la normale distribuzione dei dati utilizzando il test di Kolmogorov-Smirnov.
  5. Per gli esperimenti con punti temporali, valutare gli effetti dell'allocazione del tempo e del gruppo utilizzando l'ANOVA a due vie, seguito dal test post-hoc di Sidak per gli effetti di gruppo e dalla correzione di Bonferroni per gli effetti temporali, utilizzando 1 h come riferimento. Considera un valore p < 0,05 come statisticamente significativo. Prendere in considerazione la trasformazione dei log dei dati in caso di distribuzione non normale prima di applicare ANOVA.
  6. Per le analisi istologiche, determinare (in cieco) il punteggio di lesione polmonare di ciascun campione, quantificando l'edema perivascolare in 10 campi/sezione.
    1. Utilizzare il numero relativo di vasi con edema perivascolare (A): 0: assente; 1: lieve (<25%); 2: moderato (25-50%); 3: grave (>50%).
    2. Utilizzare lo spessore dell'edema perivascolare (B), calcolato come percentuale dei diametri dei vasi interni (0: nessun edema; 1: <25%; 2: 25-50%; 3: >50%).
    3. Usa la somma di A + B nelle 10 sezioni esaminate per calcolare il punteggio31.
    4. Effettuare confronti statistici utilizzando il test di Mann-Whitney non parametrico (a causa di una distribuzione non normale dei dati), con significatività assegnata a p < 0,05.

Risultati

Le variabili fisiologiche polmonari sono continuamente monitorate durante tutta la procedura, tra cui la pressione arteriosa polmonare (PAP), la resistenza vascolare polmonare calcolata e i parametri ventilatori, tra cui la compliance polmonare statica (SPC) e la pressione di picco delle vie aeree (Pmax). Inoltre, il modulo di peso consente di valutare la formazione di edema fornendo una misura indiretta dell'accumulo di liquidi nel polmone. I vantaggi del precondizionamento termico (TP) rispetto ai polmoni di controllo (Ctrl) includono un miglioramento dell'SPC (Figura 9A, espresso come rapporto tra l'SPC in ogni momento e il valore SPC iniziale, n = 5/gruppo) e una riduzione dell'aumento di peso polmonare (Figura 9B, n = 5/gruppo) durante l'EVLP. I dati sono presentati come mezzi ± SEM.

Il fluido perfusato può essere analizzato per vari biomarcatori. Ad esempio, il precondizionamento termico è associato a un rilascio significativamente ridotto di von Willebrand (vWF), un biomarcatore delle cellule endoteliali alla fine dell'EVLP (Figura 9C, n = 5/gruppo, significa ± SEM).

Le analisi morfologiche del tessuto polmonare ottenute al termine dell'EVLP comprendono l'istologia e l'immunoistochimica. Esempi di sezioni colorate con ematossilina ed eosina (H ed E) sono mostrate nella Figura 9D, che mostrano un ridotto danno istologico nei polmoni esposti al precondizionamento termico, espresso come punteggio di lesione polmonare (Figura 9E, n = 5/gruppo). Il punteggio è stato stabilito quantificando l'edema perivascolare in 10 campi/sezione (vedere le fasi del protocollo 4.6.1 e 4.6.2). La somma di A + B nelle 10 sezioni esaminate è stata utilizzata per calcolare il punteggio31.

Le analisi molecolari nel tessuto polmonare alla fine dell'EVLP includono il profilo di espressione dell'RNA o della proteina. Ad esempio, i livelli di espressione proteica della proteina da shock termico inducibile HSP70 possono essere misurati mediante ELISA, per mostrare lo sviluppo della risposta allo shock termico nei polmoni esposti al precondizionamento termico (Figura 9F, che mostra un esperimento con diverse durate di EVLP, n = 5/gruppo in ogni punto temporale). L'espressione di HSP70 nel gruppo TP ha raggiunto il picco dopo 3 ore di EVLP, cioè 90 minuti dopo la fine di TP, ed è rimasta stabile successivamente fino alla fine di EVLP. I dati sono presentati come mezzi ± SEM.

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Figura 1: Descrizione della piattaforma EVLP. (1) Serbatoio a doppia parete per la perfusizione. (2A) Pompa a rulli per la circolazione del perfusato. (2B) Pompa a rulli per il campionamento del perfusato (misure biochimiche e analisi dei gas). (3) Bagnomaria termostatico. (4) Scambiatore di gas a membrana collegato a un serbatoio di gas (non mostrato). (5) Sensore di pressione atriale sinistra. (6) Camera riscaldata e sigillata. (7) Ventilatore EVLP. (8) Sonda di temperatura e termometro. (9) Piattaforma di connessione per il blocco cuore-polmone, i cui elementi sono dettagliati in Figura 2. (Nota: il sensore di pressione PA non è visibile). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Piattaforma di connessione per il blocco cuore-polmone. (1) Cannula di afflusso all'arteria polmonare. (2) Cannula di deflusso dall'atrio sinistro. (3) Connessione per la cannula tracheale. (4) Modulo di peso. (5) Sonda di temperatura progettata internamente saldamente fissata contro la cannula di afflusso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Trasduttori/amplificatori di segnale e convertitore analogico/digitale. (A). Trasduttore/amplificatore di pressione dell'arteria polmonare. (B). Regolatore di flusso della velocità della pompa. (C). Trasduttore/amplificatore di pressione atriale sinistra. (D). Modulo di peso polmonare. (E). Convertitore analogico/digitale. (F). Personal computer per la visualizzazione e la registrazione dei dati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Mantenimento della temperatura del perfusato durante l'EVLP. (1) Bagnomaria termostatico. (2) Serbatoio in perfusato con contenitore in vetro a doppia parete dove circola l'acqua del bagnomaria termostatico. (3) Tubo della serpentina di riscaldamento all'interno di un contenitore dell'acqua riscaldata collegato al bagnomaria termostatico. (4) Camera dell'organo con contenitore in vetro a doppia parete per la circolazione dell'acqua calda dal bagnomaria. (5) Termometro elettronico e sonda di temperatura progettata internamente saldamente fissati alla cannula di afflusso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Identificazione della temperatura ottimale per il precondizionamento termico. (A) Protocollo EVLP per la valutazione delle diverse temperature di riscaldamento. Da 60 minuti a 90 minuti di EVLP, la temperatura del perfusato è stata aumentata alle temperature indicate. A 90 minuti di EVLP, la temperatura è stata riportata a 37 °C per 90 minuti fino alla fine dell'EVLP, dove sono state eseguite varie misurazioni fisiologiche e molecolari. (B) Riepilogo dei risultati degli effetti delle diverse temperature di riscaldamento sui parametri fisiologici e molecolari (il verde indica gli effetti favorevoli, il rosso gli effetti sfavorevoli e l'arancione gli effetti misti). La temperatura di riscaldamento di 41,5 °C ha fornito gli effetti più protettivi. Abbreviazioni: EVLP = perfusione polmonare ex-vivo ; TP = precondizionamento termico. Questa cifra è stata modificata da Ojanguren et al.21. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Materiale chirurgico. (A) Strumenti per l'estrazione del blocco cuore-polmone: Porta clip per aneurisma e microclip per aneurisma (sistema Yasargil), pinza bulldog, forbici, microforbici, divaricatori attaccati ad elastici. (B) Cannule EVLP per l'arteria polmonare (PA), l'atrio sinistro (LA) e la trachea. (C) Sistema di perfusione fatto in casa per il lavaggio a freddo dei polmoni con perfusi. La distanza tra il livello del PA nell'animale e il fondo della siringa è fissata a 20 cm. (C) Supporto fatto in casa. (Non mostrato: microscopio operatorio, ventilatore e impianto di anestesia). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: Immagini rappresentative della preparazione chirurgica (A) Nodo pre-legato attorno all'arteria polmonare. (B) Nodo pre-legato attorno alla punta del cuore. (C) Morsetto Bulldog (cerchio blu) sulla cannula PA e clip per aneurisma (cerchio rosso) sulla trachea. Abbreviazione: PA = arteria polmonare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 8: Diagramma di flusso. Passaggi principali per guidare la progressione attraverso le diverse fasi del protocollo. Il periodo compreso tra 1 h e 1,5 h EVLP viene ingrandito per indicare il protocollo di trattamento in base all'assegnazione del gruppo (controllo vs precondizionamento termico). Abbreviazioni: CI = ischemia fredda; EVLP = perfusione polmonare ex-vivo ; PA = arteria polmonare; SPC = compliance polmonare statica; TP = precondizionamento termico; WI = ischemia calda. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 9: Risultati rappresentativi degli effetti del precondizionamento termico nei polmoni di ratto danneggiati. I polmoni danneggiati da 1 ora di ischemia calda sono stati perfusi in un sistema EVLP per 6 ore. Da 60 a 90 minuti di EVLP, un gruppo di polmoni è stato sottoposto a precondizionamento termico a 41,5 °C (gruppo TP). Un gruppo di controllo dei polmoni è stato mantenuto a 37 °C per tutta la durata dell'EVLP. (A) Compliance polmonare statica (SPC), espressa come rapporto tra il valore iniziale, nei polmoni di controllo (Ctrl, n = 5) e TP (n = 5). L'SPC era meglio conservato nei polmoni TP. (B) Aumento di peso dei polmoni durante EVLP in controllo (n = 5) e polmoni TP (n = 5). C'è stata una significativa riduzione della formazione di edema nel gruppo TP. (C) Il rilascio nel perfusato del biomarcatore delle cellule endoteliali von Willebrand Factor è stato soppresso nel gruppo TP (n = 5) rispetto ai controlli (n = 5). (D) Aspetto macroscopico e microscopico del polmone (colorazione ematossilina-eosina) alla fine dell'EVLP nei polmoni di controllo (n = 5) e TP (n = 5). (E) Il punteggio del danno polmonare (per la quantificazione del danno istologico) era più basso nel gruppo TP (n = 5) rispetto al gruppo di controllo (n = 5). (F) Livelli proteici della proteina da shock termico inducibile HSP70 negli estratti di tessuto polmonare misurati dopo 1, 2, 3, 4,5 e 6 ore EVLP nei gruppi di controllo e TP (n = 5/gruppo in ogni punto temporale), mostrando una marcata risposta allo shock termico nel gruppo TP. L'espressione di HSP70 nel gruppo TP ha raggiunto il picco dopo 3 ore di EVLP (90 minuti dopo la fine della TP) ed è rimasta stabile fino alla fine dell'EVLP.
Tutti i grafici mostrano le medie ± SEM. Per gli esperimenti sull'andamento del tempo (A-C,F), sono stati eseguiti confronti statistici utilizzando l'ANOVA a due vie seguita dal test di Sidak per l'effetto di gruppo e dagli aggiustamenti di Bonferroni per l'effetto del tempo (con il tempo 1 h come riferimento). Per il punteggio di lesione polmonare (E), i confronti statistici sono stati effettuati utilizzando il test di Mann-Whitney. * p < 0,05 (differenze tra gruppi), † p < 0,05 vs 1 h EVLP. Abbreviazioni: Ctrl = controllo; EVLP = perfusione polmonare ex-vivo; HSP70 = proteina da shock termico 70; SPC = compliance polmonare statica; TP = precondizionamento termico. Modificato da Parapanov et al.23. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Composizione delle soluzioni utilizzate nel protocollo. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Impostazioni EVLP per il flusso di perfusione, la temperatura di afflusso (a livello della cannula dell'arteria polmonare) e la ventilazione nel tempo. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Risoluzione dei problemi. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Materiali supplementari. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Lo sviluppo di un modello EVLP di ratto riproducibile e fisiologicamente rilevante rappresenta un significativo passo avanti nella ricerca sul trapianto di polmone. Nonostante le significative differenze di specie tra il polmone di ratto e quello umano (recentemente riviste in1), in particolare la maggiore vulnerabilità del polmone di ratto, il modello EVLP di ratto offre interventi farmacologici e non farmacologici con elevata riproducibilità e basso costo. EVLP offre una piattaforma unica per valutare la funzione polmonare del donatore, simulare scenari di lesioni cliniche come il danno da ischemia-riperfusione e implementare interventi terapeutici prima del trapianto 2,39,40. In questo contesto, il modello EVLP del ratto consente indagini meccanicistiche ad alto rendimento in condizioni strettamente controllate33. Negli ultimi anni, diversi gruppi hanno contribuito al perfezionamento delle tecniche EVLP del ratto. Nelson et al. hanno fornito una guida procedurale fondamentale39. Wang et al. hanno proposto una configurazione modulare EVLP su misura per imitare la donazione dopo la morte circolatoria (DCD)simulazione 41. Gouchoe et al. hanno esplorato nuove formulazioni di perfusato utilizzando vettori artificiali di ossigeno42 e Oliveira et al. si sono concentrati sull'infiammazione dopo una lunga conservazione dell'ischemia fredda38. Sulla base di queste conoscenze esistenti, il nostro attuale protocollo introduce una nuova strategia non farmacologica, vale a dire il precondizionamento termico, progettata per attivare meccanismi protettivi endogeni per il ricondizionamento di innesti polmonari di ratto danneggiati da ischemia calda. Il nostro modello di polmone danneggiato, che simula le condizioni di DCD, è stato eseguito su ratti maschi di Sprague-Dawley33.

L'istituzione di questo protocollo ha richiesto un'attenta attenzione a diversi passaggi tecnicamente impegnativi che influenzano in modo critico la vitalità e la riproducibilità polmonare. Il prelievo polmonare deve essere eseguito con una manipolazione minima per evitare lesioni parenchimali. La profondità dell'anestesia è fondamentale per prevenire la congestione polmonare indotta dal respiro affannoso e lo scarso dissanguamento. È essenziale evitare rigorosamente le bolle d'aria durante l'incannulamento e l'adescamento del circuito, poiché anche piccoli emboli possono precipitare l'edema43. Nella Tabella 3 sono indicati consigli specifici per la risoluzione dei problemi di protocollo più comuni. Mentre le impostazioni di ventilazione e perfusione possono essere regolate entro limiti di sicurezza, le strategie di protezione polmonare devono essere mantenute per prevenire il barotrauma o il volutrauma44. Il flusso di perfusato può essere aumentato fino al 20% della gittata cardiaca stimata nei ratti, rispetto al 40% nei modelli più grandi come i suini e gli esseri umani, ma deve essere accuratamente titolato45. Nel nostro protocollo, utilizziamo un flusso di perfusato inferiore (7,5% della gittata cardiaca teorica), per prevenire picchi di pressione arteriosa polmonare e lo sviluppo di edema polmonare precoce nei polmoni caldi ischemici danneggiati, consentendo così una preparazione prolungata. Sebbene alcuni laboratori somministrino corticosteroidi durante la perfusione per ridurre l'infiammazione46,47, i loro noti effetti antinfiammatori potrebbero confondere alcuni risultati sperimentali, e quindi non li usiamo nel nostro modello per preservare la capacità di studiare il danno polmonare e i processi infiammatori.

Il precondizionamento termico richiede un controllo preciso della temperatura. Poiché il calore viene disperso lungo il tubo dal serbatoio al polmone, la temperatura del perfusato deve essere monitorata sulla cannula di afflusso e l'impostazione del bagno d'acqua deve essere mantenuta leggermente al di sopra della temperatura di afflusso desiderata per raggiungere l'obiettivo all'interno della preparazione. I sensori vengono calibrati annualmente utilizzando un termometro digitale PCE-T 1200 multicanale per garantire la precisione.

I nostri risultati affrontano anche i limiti chiave della terapia del calore convenzionale. L'applicazione sistemica del calore è limitata da una regolazione imprecisa della temperatura, dagli effetti collaterali sistemici e dalla mancanza di specificità d'organo. L'EVLP elude queste barriere fornendo un ambiente controllato e localizzato, consentendo un'erogazione precisa dello stress termico direttamente al tessuto polmonare29. Questo metodo consente una modulazione rigorosa sia dell'entità che della durata dello stress termico, due parametri critici per ottimizzare la risposta cellulare protettiva senza innescare lesioni termiche. Inoltre, la nostra piattaforma EVLP consente molteplici valutazioni a valle, tra cui analisi molecolari, istologiche e funzionali. È importante sottolineare che anche i polmoni sottoposti a EVLP possono essere trapiantati, consentendo la valutazione diretta della funzione del trapianto post-EVLP in vivo29. Pertanto, il modello supporta la valutazione sia a livello di organo isolato che post-trapianto. In questo contesto, l'integrazione del precondizionamento termico, un'esposizione transitoria a 41,5 °C durante l'EVLP, emerge come un intervento promettente. Stimolando una risposta allo shock termico e altri percorsi di adattamento allo stress, questo metodo migliora la resilienza dell'innesto senza confondenti farmacologici. I nostri risultati mostrano che il precondizionamento termico migliora la fisiologia del trapianto polmonare, riduce la formazione di edema e il rilascio di mediatori infiammatori e biomarcatori di danno cellulare (come esemplificato dai livelli ridotti del fattore di von Willebrand nel perfusato EVLP dei polmoni trattati termicamente). Le analisi morfologiche supportano ulteriormente l'effetto protettivo di questo intervento, con un ridotto danno strutturale e una preservazione dell'integrità dei tessuti. La maggior parte dei dati sperimentali EVLP sui ratti sono stati generati nei maschi, limitando l'intuizione specifica del sesso; Due studi hanno riportato esiti divergenti nelle femmine: riduzione del danno da riperfusione in uno e aumento dell'infiammazione in un altro48,49. Sebbene il nostro studio abbia utilizzato maschi, abbiamo precedentemente osservato benefici di TP in un modello EVLP suino utilizzando femmine29, suggerendo una rilevanza tra i sessi.

Importanti vincoli e svantaggi del nostro metodo devono essere sottolineati. Innanzitutto, per garantire che i polmoni siano perfusi con l'effettiva temperatura desiderata, quest'ultima deve essere monitorata sulla cannula di afflusso applicando con decisione il sensore di temperatura. In secondo luogo, è obbligatorio che le variazioni di temperatura siano ottenute in periodi di tempo molto brevi, il che richiede l'uso di un bagno d'acqua termale a risposta rapida per il riscaldamento e l'aggiunta di ghiaccio al bagno d'acqua per un raffreddamento rapido. In terzo luogo, la risposta fisiologica allo stress da calore può differire a seconda delle specie utilizzate ed è fortemente dipendente dal livello e dalla durata dello stress. Pertanto, è obbligatorio eseguire esperimenti pilota utilizzando varie temperature di riscaldamento per varie durate nel caso in cui questo protocollo venga applicato a diverse specie animali o polmoni umani e valutare endpoint specifici relativi sia agli effetti protettivi che a quelli potenzialmente dannosi dello stress termico applicato. In quarto luogo, a causa dell'espressione cinetica dei geni sensibili al calore, gli effetti del precondizionamento termico dipendono dal tempo di recupero dopo l'applicazione dello stress termico. Sono necessari esperimenti che utilizzano diverse durate dello stress post-calore (cioè con diverse durate dell'EVLP) per valutare tali effetti dipendenti dal tempo dell'applicazione del calore, come mostrato nella nostra recente pubblicazione su questo argomento30.

Nel complesso, il nostro attuale studio stabilisce un protocollo EVLP dettagliato e riproducibile per il ratto che incorpora il precondizionamento termico come strategia praticabile per migliorare la qualità del polmone marginale del donatore. Il protocollo è scalabile e adattabile a sistemi EVLP animali o umani più grandi, rafforzando la sua rilevanza traslazionale. Fornendo sia rigore metodologico che fedeltà fisiologica, questo modello apre nuove strade per esplorare interventi non farmacologici volti a ridurre il danno da ischemia-riperfusione e a migliorare gli esiti del trapianto polmonare dopo il trapianto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Sostenuto da una sovvenzione del Fondo nazionale svizzero per la ricerca scientifica (Nr 310030_212252) a TK e LL).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Equipaggiamento generale
Clip per aneurisma  B. BraunFE762K
Sensore termico a sfera aria/superficieTES Electrical Electronic Corp/Distrelec AGTP01/176-67-162
Trasportatori SmussatiStrumenti scientifici di qualità18200-09
Serafine BulldogStrumento Scientifico Raffinato18051-50
Compresse dello sguardo Promedico25404
Kit di collegamento per anestesiaHugo Sachs Elektronik - Apparato di Harvard73-3076
Cotton SwabApprovato SA6001109
Forbici DissezionatriciB. Braun BC165R
Maschera facciale per rattoTem SegaPFM0006
Eparina 5000 U/mLB. Braun3522430
Camera di induzione per anestesiaHugo Sachs Elektronik - Apparato di Harvard50-0116
Pinza disezionante dell'iride completamente curvaEsculap  OC022R
IsofluranProvet AG2222
Vapore isofluran 19.3Rothacher medicoCV30-310 O2/Air
Cartuccia iSTAT4Axon lab AG03P85-25
Ketasol 100 (100 mg/mL)Dr. E. Graeub AGQN01AX03
Forbici Lister B. BraunBC876R
Micro Forbici, Smussa/Smussata CurvaEsculap FM011R
Pinze Micro-AdsonStrumento Scientifico Raffinato11018-12
Micro-Emostati delle ZanzareStrumento Scientifico Raffinato13011-12
Microscopio OPMI MDUZeiss267067
NaCl 0,9 % B. Braun534534
Ago 23 G x 25 mmBD Microlance 4300800
Ago 25 G x 25 mmBD Microlance 3300400
Perfadex (soluzione di conservazione)Perfusione AB di Xvivo19811
Siringa a perfusione 60 ml luer lockBD plastik300865
RasorEsculap GT-421
ScalaMettler ToledoPB602-L
Sutura di seta 4-0B. BraunF1134035
Sutura di seta 5-0B. BraunF1134027
Steen (soluzione per perfusione)Perfusione AB di Xvivo19004
Guanti chirurgiciAnsell93-843
Siringa 1 mL, Omnifix-FB. Braun9161406V
NastroLeukofix02136-00
TermometroTES Electrical Electronic Corp1303
Tubi contenenti Formol Biosystems Switzerland AG87-0960-00-10113
Ventilatore (EVLP) (Imposta il volume di marea secondo il protocollo EVLP)FlexiventFX3
Ventilatore (procuramento polmonare) & nbsp; (Imposta il volume di marea come: 7,69*(peso corporeo (kg))^1,04)Hugo Sachs Elektronik - Apparato di Harvard683
Trattore WEITLANERB. BraunBV073R
Xylasol (1 mg/mL)Dr. E. Graeub AGQN05CM92
Yasargil applierB. BraunFE502T
IPL-2 forte
Adattatore per pressione positivaHugo Sachs Elektronik - Apparato di Harvard73-3635
AME 14 - SC0062 tubo pompa (tygon) con collare a 3 stop, pacchetto da 12Hugo Sachs Elektronik - Apparato di Harvard73-0126
AME 24 - SC0072 tubo della pompa (tygon) con collare a 3 stop, pacchetto da 12Hugo Sachs Elektronik - Apparato di Harvard73-0155
Unità base per il polmone perfuso isolato di dimensione 2 (IPL-2) tipo 829/2Hugo Sachs Elektronik - Apparato di Harvard73-2266
Kit di collegamento per ossigenatore in fibra D150Hugo Sachs Elektronik - Apparato di Harvard73-3765
Modulo di bilanciamento dell'edema EBM (EBM) con sensoreHugo Sachs Elektronik - Apparato di Harvard73-4626
Ossigenatore a fibra tipo D150, pacchetto da 5Hugo Sachs Elektronik - Apparato di Harvard73-3762
Supporto per clampaggio della cannula aortica o tracheale per tavoli OP dimensione 5Hugo Sachs Elektronik - Apparato di Harvard73-3855
Supporto per ossigenatoriHugo Sachs Elektronik - Apparato di Harvard73-3061
Sistema di misurazione del peso HSEHugo Sachs Elektronik - Apparato di Harvard73-4604
Software base di acquisizione dati HSE-BDAS per windows 2000, XP, windows 7Hugo Sachs Elektronik - Apparato di Harvard73-1712
Hardware di acquisizione dati HSE-USB, decoda USB autonoma per Windows 10 o 11Hugo Sachs Elektronik - Apparato di Harvard73-3330
ISM 827/230 V pompa a rulli analogica reglo, 4 canali, 0,003-35 ml/min (2 x)Hugo Sachs Elektronik - Apparato di Harvard73-0114
Cannula dell'atrio sinistro (DD 4,0 mm)Hugo Sachs Elektronik - Apparato di Harvard73-0712
Elettrodo di ossigeno a flusso attraverso mini con raccordi da 1/16" (Opzionale)Hugo Sachs Elektronik - Apparato di Harvard73-4189
Kit di montaggio per ossigenatore a fibra tipo D150 su supportiHugo Sachs Elektronik - Apparato di Harvard73-3759
Rubinetto di fermata a senso unico tipo 9500 (uno per la PA, uno per LA)Hugo Sachs Elektronik - Apparato di Harvard73-0097
OPPM plugsys modulo di pressione parziale di ossigeno tipo 697  (Opzionale)Hugo Sachs Elektronik - Apparato di Harvard73-0210
Tipo di cassa di sistema base Plugsys 603Hugo Sachs Elektronik - Apparato di Harvard73-0045
pO2 soluzione zero 20 pacchetti da 20 ml  (Opzionale)Hugo Sachs Elektronik - Apparato di Harvard73-3812
Trasduttore di pressione P75 tipo 379/HSE, intervallo -75-+75 mm Hg (PA, LA)Hugo Sachs Elektronik - Apparato di Harvard73-0020
Cannula dell'arteria polmonare (diametro diametrale 2,0 mm, diametro della testa, 2,5 mm)Hugo Sachs Elektronik - Apparato di Harvard73-0711
Serbatoio (con guaina protetta) per la soluzione tamponeHugo Sachs Elektronik - Apparato di Harvard73-3496
Controller servo SCP plugsys per perfusione tipo 704Hugo Sachs Elektronik - Apparato di Harvard73-2806
Custodia di schermatura per un sensore pO2 o pCO2 mini sensore  (Opzionale)Hugo Sachs Elektronik - Apparato di Harvard73-4196
Piccola piastra di montaggio per un singolo sensore O2 o CO2 sensore  (Opzionale)Hugo Sachs Elektronik - Apparato di Harvard73-3000
Modulo amplificatore trasduttore plugsys TAM-A tipo 705/1 (uno per PA, uno per LA)Hugo Sachs Elektronik - Apparato di Harvard73-0065
Circolatore termostatico E 103 (3 L)Hugo Sachs Elektronik - Apparato di Harvard73-0125
Rubinetto di fermata a tre vie tipo 9560 R (uno per PA, uno per LA)Hugo Sachs Elektronik - Apparato di Harvard73-0096
Set di tubi per serbatoio tampone con sollevamento con valvole di chiusura per la linea del fluidoHugo Sachs Elektronik - Apparato di Harvard73-3456
Cannula di ventilazione (traqueica) diametro diametro 2,0 mm, L 14 mmHugo Sachs Elektronik - Apparato di Harvard73-3384
Software informatici
Software base di acquisizione dati HSE-BDAS per windows 2000, XP, windows 7Hugo Sachs Elektronik - Apparato di HarvardV2.0
ExcelMicrosoft2502, Microsoft 365
FlexiwareScireq8
GraphPad PrismGraphPad Software inc.10.0.1
Ratti Sprague-Dawley Charles River Laboratories (Saint-Germain-Nuelles, Francia) & nbsp;

Riferimenti

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