Articolo metodologico

Flusso di lavoro standardizzato SDS-PAGE per la profilazione personalizzata della corona proteica nella diagnosi precoce del cancro

DOI:

10.3791/69090

⸱

19 dicembre 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NanoDelivery Lab, Department of Molecular Medicine, Sapienza University of Rome

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo standardizza l'analisi SDS-PAGE per il profiling personalizzato della corona proteica su nanoparticelle, consentendo una rilevazione riproducibile, scalabile e a basso costo di firme specifiche per il cancro. Progettato per la diagnosi precoce dell'adenocarcinoma del pancreas duttale, offre un'alternativa pratica e ALLINEATA a REASSURED rispetto ai complessi metodi proteomici sia in ambito di ricerca che clinico.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La formazione di una corona proteica personalizzata (PC) su nanoparticelle (NP) dopo l'esposizione a fluidi biologici si è emersa come una strategia promettente e minimamente invasiva per la diagnosi precoce del cancro. Questo studio introduce un protocollo standardizzato per il profilaggio della corona proteica utilizzando elettroforesi in gel di dodecil solfato di sodio poliacrilamide (SDS-PAGE), ottimizzato per garantire robustezza, riproducibilità e automazione. Il metodo è stato rigorosamente validato su una varietà di piattaforme di nanoparticelle (NP), sorgenti di plasma e condizioni sperimentali, dimostrando profili costantemente riproducibili con una variabilità minima dipendente dall'operatore. Rispetto alle tecniche proteomica convenzionali, questo approccio offre una soluzione più rapida ed economica che soddisfa i criteri diagnostici REASSURED dell'Organizzazione Mondiale della Sanità. Quando applicato all'adenocarcinoma del pancreas del dinteto (PDAC), una malignità altamente aggressiva con biomarcatori precoci limitati, questo flusso di lavoro ha raggiunto accuratezze di classificazione fino al 90%, anche nei pazienti in stadio iniziale. Questa piattaforma standardizzata rappresenta un significativo progresso verso strumenti diagnostici scalabili, clinicamente traducibili e accessibili per lo screening del cancro.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Corona proteica nanoparticellare (NP-PC)

La caratterizzazione del PC che si forma sulla superficie degli NP dopo la loro esposizione a fluidi biologici è emersa come una strategia potente per la diagnostica delle malattie e la medicinapersonalizzata 1. Questo strato di proteine adsorbite, dinamico e specifico per la malattia nella sua composizione, trasforma l'identità sintetica delle NP e ne guida le interazionibiologiche 2. La composizione del PC non è casuale ma dipende fortemente sia dalle proprietà fisicochimiche dei NP sia dall'ambiente biologico in cui vengonointrodotti 3. Fattori come la dimensione, la forma, la carica superficiale e la composizione NP possono influenzare significativamente l'affinità, la cinetica e l'organizzazione strutturale delle proteine adsorbite. Allo stesso modo, il fluido biologico, la sua origine, complessità e stato di malattia, giocano un ruolo chiave nel determinare la composizione finale della corona 4,5,6.

La natura dinamica della corona complica ulteriormente la sua analisi, poiché la sua struttura evolve nel tempo da uno strato esterno morbido e debolmente legato a un nucleo interno più stabile e strettamenteadsorbito 7,8. Questa architettura in evoluzione, risultante da eventi di adsorbimento proteico competitivo, richiede approcci standardizzati e risolti nel tempo per essere caratterizzata in modo significativo9. Nonostante questa complessità, è ormai ampiamente riconosciuto che il PC non è un semplice artefatto, ma uno strato biologicamente informativo in grado di catturare alterazioni sistemiche della malattia in modo non invasivo. L'obiettivo del metodo descritto in questo articolo è standardizzare l'uso di SDS-PAGE per la profilazione robusta, riproducibile e accessibile del PC personalizzato, in particolare per la diagnosi precoce del cancro tramite approcci a biopsialiquida 10.

Il PC personalizzato e la sua rilevanza nella rilevazione del cancro

La base scientifica di questo metodo risiede nel concetto di PC personalizzato. All'incubazione con plasma del paziente, gli NP adsorbiscono un'impronta digitale unica di proteine che riflette lo stato fisiologico o patologicodell'individuo 11,12. Questo concetto è stato confermato da studi che mostrano significative alterazioni nella composizione del PC in presenza di malattie, tra cui adenocarcinoma del pancreas dettale (PDAC), cancropolmonare 13, meningioma14 e glioblastoma multiforme15. In particolare, nel PDAC, i PC derivati dal plasma del paziente differiscono sostanzialmente da quelli dei donatori sani. Queste differenze sono state sfruttate in modelli di classificatori che raggiungono fino al 90% di accuratezza diagnostica. Il PC funge quindi da concentratore su scala nanometrica di segnali specifici per lamalattia 16.

Studi recenti hanno dimostrato che i PC di pazienti oncologici sono arricchiti di proteine coinvolte in infiammazione, coagulazione, attivazione del complemento e trasporto delle vescicole extracellulari, vie biologiche note per essere disregolate nellamalignità 17. Questi modelli proteici sono altamente riproducibili all'interno delle singole classi di pazienti, ma chiaramente distinti tra i diversi stati patologici, suggerendo che la corona possa funzionare non solo come sensore generale della malattia, ma anche come classificatore specifico per la malattia. Nel contesto della PDAC, una delle malignità più letali e insidiose, il nostro gruppo ha introdotto test del sangue abilitati NP (NEB) basati sulla caratterizzazionePC 18,19,20. Questo approccio minimamente invasivo sfrutta la capacità degli NP di arricchire selettivamente proteine plasmatiche a bassa abbondanza e alterate dalla malattia, rendendole rilevabili tramite semplice separazione elettroforetica da banco in simulazione.

Vantaggi rispetto alle tecniche proteomiche convenzionali

La motivazione per lo sviluppo di questo approccio deriva dai limiti delle tecniche proteomica convenzionali come la spettrometria di massa (MS), che, pur offrendo una copertura proteoma profonda, sono costose, richiedono tempo e non sono adatte allo screening ad alto rendimento o alla diagnostica al punto di cura21. Un'altra sfida chiave risiede nella complessità intrinseca della SM, dove variazioni nella preparazione del campione, nella calibrazione degli strumenti, nei parametri di acquisizione e nei flussi di lavoro di analisi dei dati contribuiscono a differenze significative tra i laboratori nella composizione del PCriportata 22. Al contrario, l'analisi SDS-PAGE del PC offre un mezzo rapido ed economico per catturare i pattern proteomici correlati alle malattie. Fondamentalmente, la lettura SDS-PAGE non si basa sull'identificazione assoluta dei singoli biomarcatori, ma sulla rilevazione di cambiamenti sistematici nel profilo proteico globale, che possono essere analizzati tramite densitometria e statistiche multivariate.

A differenza degli saggi basati su anticorpi, limitati a bersagli noti e soggetti a reattività incrociata, SDS-PAGE offre una visione imparziale del paesaggio proteico, preservando l'integrità del campione originale e permettendo l'integrazione a valle con piattaforme complementari come LC-MS/MS per l'identificazione delle proteine. Inoltre, poiché SDS-PAGE non richiede fasi di frazionamento o deplezione del campione, è particolarmente adatto per l'analisi di campioni biologici a basso volume, una caratteristica essenziale per applicazioni che coinvolgono la diagnosi precoce o lo screening di popolazionifragili 23. Per tutti questi motivi, questo protocollo è coerente con diversi criteri ASSICURATI dell'OMS (Connettività in tempo reale, Facilità di raccolta dei campioni, Accessibile, Sensibile, Specifico, User-friendly, Robusto, Senza attrezzature e Consegnabile), rendendolo uno strumento pratico per diagnostichescalabili 24. Sulla base di queste evidenze, è stata ipotizzata che gli NP incubati con plasma del paziente adsorbano un PC riproducibile e specifico per la malattia, che può essere profilato sistematicamente tramite SDS-PAGE. Proponiamo inoltre che un'analisi elettroforetica standardizzata di queste corona personalizzate possa distinguere i pazienti oncologici dagli individui sani, fornendo così uno strumento diagnostico robusto e clinicamente traducibile.

Flusso di lavoro e applicabilità clinica

Il protocollo di profilazione corona basato su SDS-PAGE sistematizza ogni fase: dalla preparazione e incubazione delle NP con plasma diluito, all'isolamento della corona, elettroforesi su gel e analisi densitometrica quantitativa (Figura 1). Parametri chiave come il tempo di incubazione, la diluizione del plasma e il tipo NP25 sono finemente regolati per garantire la cattura ottimale delle proteine e la risoluzione delle immagini in gel. Il protocollo affronta anche questioni pratiche come la capacità di trasmissione del campione, la stabilità dello storage e la consistenza batcha batch 26. Inoltre, essendo una tecnica non distruttiva, SDS-PAGE può essere combinata senza soluzione di continuità con approcci proteomici complementari come la MS per identificare la composizione molecolare delle singole bandeproteiche 15. Il flusso di lavoro è stato ottimizzato per un'elevata riproducibilità interoperatorio, inclusa la compatibilità con piattaforme di pipetaggio manuali e automatizzate, ed è robusto in diverse chimiche NP e concentrazioni di plasma. Queste caratteristiche garantiscono che il metodo possa essere applicato in diversi contesti di laboratorio, rendendolo adatto sia a hub diagnostici centralizzati sia a laboratori di ricerca decentralizzati. Pertanto, questa tecnica è particolarmente adatta a ricercatori e clinici coinvolti nella diagnostica precoce, nella scoperta di biomarcatori e nella nanomedicina traslazionale. È applicabile a un'ampia gamma di patologie e adattabile a fluidi biologici diversi oltre al plasma, inclusi saliva o urina. La flessibilità e la robustezza di questo protocollo lo rendono un candidato forte per l'integrazione nelle pipeline di validazione clinica, negli studi di screening su larga scala e nelle piattaforme di punto di cura.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro dettagliato e standardizzato per la preparazione, incubazione con plasma umano (HP), isolamento e analisi del PC formato su vari tipi di NP. La Figura 2 è una rappresentazione grafica dell'intero protocollo, che delinea i passaggi sperimentali sequenziali dalla sintesi NP all'analisi multivariata SDS-PAGE dei profili proteici. È importante sottolineare che la metodologia è stata standardizzata dal nostro gruppo, come dimostrato nei lavoriprecedenti 18,26, garantendo riproducibilità e affidabilità dei risultati. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione e caratterizzazione dei NP

  1. Nanofogli GO nano
    1. Diluire una soluzione di macchino da 4 mg/mL in acqua ultrapura alla concentrazione desiderata. Sonicare per 2 minuti a un'ampiezza del 28% (impulso: 0,8/0,6 s) per garantire una corretta dispersione.
    2. Quantificare la concentrazione usando spettroscopia UV-Vis
    3. Misurare la dimensione idrodinamica e il potenziale zeta tramite scattering dinamico della luce (DLS) utilizzando un laser He-Ne da 633 nm. Prepara i campioni per diluizione in acqua ultrapura in base ai limiti di rilevamento delle cuvette (ad esempio, diluizione 1:100 per cuvette da 1 mL). Record media ± deviazione standard (SD) da tre repliche.
  2. Centri Nazionale Oro
    1. Utilizzare NP d'oro da 100 nm stabilizzati con citrato (concentrazione dallo stock: 3,8E+9 particelle/mL) senza ulteriori modifiche.
    2. Misurare la dimensione idrodinamica e il potenziale zeta tramite scattering dinamico della luce (DLS) utilizzando un laser He-Ne da 633 nm. Prepara i campioni per diluizione in acqua ultrapura in base ai limiti di rilevamento delle cuvette (ad esempio, diluizione 1:100 per cuvette da 1 mL). La media dei record ± SD da tre repliche.
  3. Liposomi DOTAP
    1. Sciogliere la polvere 1,2-dioleoyl-3-trimetilammonio-propano (DOTAP) in cloroformio all'interno di una cappa chimica certificata indossando DPI appropriati (camice da laboratorio, guanti, occhiali). Evaporare sotto vuoto per 2 ore, risospendere il film lipidico con acqua ultrapura per raggiungere una concentrazione finale di 1 mg/mL, e idratare durante la notte a 4 °C. Infine, estrussi la soluzione liposomica 20 volte attraverso un filtro a policarbonato da 0,1 μm.
    2. Misurare la dimensione idrodinamica e il potenziale zeta tramite scattering dinamico della luce (DLS) utilizzando un laser He-Ne da 633 nm. Prepara i campioni per diluizione in acqua ultrapura in base ai limiti di rilevamento delle cuvette (ad esempio, diluizione 1:100 per cuvette da 1 mL). La media dei record ± SD da tre repliche.
      ATTENZIONE: Maneggiare il cloroformio in una cappa con DPI completo. Smaltire i rifiuti dei solventi organici in conformità con le procedure istituzionali di sicurezza chimica.
      NOTA: Per GO con distribuzioni di dimensioni centrate approssimativamente a 300 nm, sonicare per 10 minuti a 125 W, centrifugare a 7.700 x g per 30 minuti a 4 °C, raccogliere il soprandante, centrifugare di nuovo a 18.620 x g per 30 minuti e risospendere il pellet. Per GO con distribuzioni di dimensioni centrate approssimativamente a 100 nm, sonicare 3 × 180 min a 4 °C, centrifugare a 10.000 x g per 30 minuti, a 4 °C dopo ogni round e raccogliere il supernatante finale.

2. Preparazione del plasma umano

  1. Plasma umano commerciale (HP)
    1. Diluire plasma liofilizzato commerciale con acqua ultrapura secondo necessità.
    2. Centrifugare il plasma ricostituito a 18620 x g per 15 minuti a 4 °C, raccogliere il sovrantantante e conservarlo a -80 °C fino all'uso.
  2. HP derivata dal paziente
    1. Centrifugare campioni di sangue a 1216 x g per 10 minuti a 4 °C e raccogliere il soprantantante per la separazione del plasma.
    2. Campioni di plasma di 450 μL in tubi a basso legame proteico da 0,5 mL e conservati a -80 °C fino all'uso.
      NOTA: Tutti i campioni di plasma umano vengono raccolti secondo le linee guida etiche istituzionali e il consenso informato è stato ottenuto da tutti i partecipanti.
      ATTENZIONE: Il plasma umano è biopericoloso. Maneggiare all'interno di un armadietto di biosicurezza (BSC) usando guanti, camice da laboratorio e occhiali protettivi. Smaltire tutti i materiali contenenti plasma secondo le normative istituzionali sulla biosicurezza e lo smaltimento dei rifiuti.

3. Formazione del PC

  1. Manipolazione manuale dei liquidi
    1. Determinare il rapporto NP:plasma ottimale quantificando la concentrazione proteica tramite un saggio sull'acido bicincininico (BCA) per regolare la diluizione plasmatica.
    2. Aggiungere 100 μL di sospensione NP a 100 μL di plasma per raggiungere le concentrazioni di plasma desiderate.
    3. Incubare a 37 °C per 1 ora.
      NOTA: Per il test BCA, miscelare i reagenti A e B (50:1), preparare diluizioni standard BSA, aggiungere 10-25 μL campione/reagente standard + 200 μL, incubare 30 minuti a 37 °C e misurare l'assorbenza a 562 nm. Le concentrazioni plasmatiche vengono tipicamente regolate tra lo 0,5% e il 50% v/v rispetto al volume NP, a seconda del tipo di NP. Per la GO, usare concentrazioni più basse (consigliate dallo 0,5% al 5%); per i NP DOTAP/oro, usare concentrazioni più alte (fino al 50%). Usa tubi proteici da 1,5 mL a basso legame.
  2. Protocollo di incubazione automatizzato
    1. Carica il protocollo software di gestione dei liquidi sulla piattaforma automatica di pipetting (testine da 20 μL + 200 μL)
    2. Distribuire 100 μL di ciascun tipo di NP in tubi a basso legame da 1,5 mL.
    3. Aggiungere plasma ricostituito preparato come in 2.1 e 2.2, secondo la seguente formula:
      dove VNP è il volume di sospensione NP. Per 100 μL di NP:
      figure-protocol-1
      5%: 5,3 μL HP
      20%: 25 μL HP
      50%: 100 μL HP
    4. Aggiungi acqua ultrapura per raggiungere 200 μL:
      5%: 94,7 μL
      20%: 75 μL
      50%: nessuna
    5. Campioni di mix:
      5%: cicli da 15 μL
      20%: cicli da 50 μL
      50%: cicli da 100 μL 3,2,6. Incubare a 37 °C per 1 ora
      NOTA: La Figura Supplementare 1 illustra l'interfaccia grafica della configurazione automatizzata utilizzata per preparare miscele NP-HP a tre concentrazioni finali di plasma (5%, 20% e 50% v/v), ciascuna in triplice. La disposizione del ponte include rack con punte, un serbatoio di rifiuti e un rack a tubi a basso legaggio 3 × 4 contenente sospensioni NP (GO, nanosfere d'oro e liposoma DOTAP) (NP), HP e acqua ultrapura (H2O). Usa tubi a basso legame proteico.

4. Analisi PC a cura di SDS-PAGE

  1. Isolamento PC
    1. Centrifugare i campioni NP-HP a 18.620 x g, 4 °C, per 15 minuti. Un pellet visibile dovrebbe essere presente sul fondo del tubo. Scartare con attenzione il soprantantante, che dovrebbe apparire chiaro prima di procedere (vedi Figura Supplementare 2).
    2. Lava il pellet con acqua ultrapura da 200 μL, risospendilo e centrifugalo di nuovo. Ripeti questo passaggio due volte. Dopo il lavaggio finale, un pellet compatto dovrebbe ancora essere visibile, confermando il successo dell'isolamento dei complessi NP-proteici (vedi Figura Supplementare 2).
    3. Preparare il buffer di carico (LB):
    4. Calcola il volume totale LB basandosi sulla condizione plasmatica e sull'agente riduttore di miscela (1:10), sul campione SDS, sulle proteine di denatura del tampone (1:2) e sull'acqua.
    5. Sospendi il pellet nel volume appropriato di 1x LB e fai bollire a 100 °C per 10 minuti.
    6. Centrifuga a 18.620 x g, 4 °C, per 15 minuti. Raccogli il soprandante.
  2. Caricamento di esempio SDS-PAGE
    1. Prepara la scala diluendo lo standard del peso molare (MW) con il tampone di carico.
    2. Diluire 10x Tris/Glicina/SDS con il buffer di passaggio a 1x.
    3. Assemblare la camera di elettroforesi con un gel a gradiente privo di macchie dal 4%-20% e aggiungere il tampone di scorrimento fino a raggiungere il livello raccomandato dal produttore.
    4. Carica campioni da 10 μL e scala da 7 μL in ciascun pozzo. Fai funzionare il gel a 150 V per ~90 minuti a temperatura ambiente.
      NOTA: Il volume di LB deve essere calcolato sulla base della concentrazione plasmatica selezionata in 3.1.1 per garantire una visualizzazione ottimale delle proteine nell'immagine del gel (tipicamente 10 μg di proteine in 20 μL LB).
      ATTENZIONE: Per una riproducibilità ottimale, eseguire l'analisi SDS-PAGE utilizzando campioni di NP-plasma appena preparati. La conservazione dei pellet lavati a -80 °C per 24 ore ha portato a alterazioni rilevabili sia delle proprietà fisicochimiche (dopo la risospensione e delle misurazioni del potenziale DLS/zeta) sia delle impronte digitali della corona proteica (quando i pellet sono stati processati a partire dallo Passo 4.3.1 del protocollo; vedi Figura Supplementare 3).

5. Analisi dei pattern proteici

  1. Elaborazione immagini
    1. Gel di immagine utilizzando un imager di chemiluminescenza.
    2. Elabora l'immagine del gel come segue:
      1. Importare l'immagine gel e salvarla come file TIFF, correggila per eventuali effetti indesiderati, ad esempio distorsioni oblique delle corsie che influenzano particolarmente le corsie periferiche. Rileva tutte le corsie di gel. Sottrai il segnale di fondo dall'immagine.
      2. Calibrare gli spostamenti verticali convertendo unità di pixel in unità di peso molecolare, basandosi su un adattamento esponenziale a doppio termine della corsia del marcatore. Genera output grafici per visualizzare i profili di intensità e le distribuzioni dei segnali specifiche per corsia.
    3. Esporta i dati elaborati, cioè i profili unidimensionali calcolati.
    4. Calcolare le distribuzioni del peso molecolare normalizzando i profili e calcolare le aree intere nei range desiderati di MW per ogni corsia.
    5. Esporta i dati di output, cioè le aree integrali all'interno delle fasce di peso molecolare specificate.
  2. Analisi multivariata per la diagnosi
    1. Applicare l'analisi discriminante lineare (LDA) o altri metodi multivariati per l'analisi della classificazione.
    2. Calcola accuratezza, sensibilità, specificità ed esegui analisi ROC.
      NOTA: Gli script impiegati per l'elaborazione delle immagini, la normalizzazione dei profili, l'adattamento e la classificazione sono disponibili dal27, dove è fornito anche il relativo manuale utente.
      ATTENZIONE: Segui i protocolli di biosicurezza quando manipoli plasma umano.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Una delle principali sfide nella standardizzazione degli esperimenti PC risiede nel minimizzare la variabilità tecnica e dipendente dall'operatore, come già evidenziato da questo studio26. Persistono ancora domande aperte riguardo all'influenza di variabili sperimentali come il bias dell'operatore e l'impatto degli strumenti automatizzati sulla riproducibilità18,28.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Versatilità e riproducibilità del metodo tra i tipi di NP

Il protocollo qui presentato fornisce un flusso di lavoro standardizzato e riproducibile per isolare e caratterizzare il PC formato su NP durante l'incubazione con HP. Come dimostrato negli studi precedenti eattuali, il metodo consente la generazione di impronte digitali molecolari basate su SDS-PAGE che catturano caratteristiche biologicamente e diagnosticamente...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La ricerca è stata parzialmente finanziata dal MUR, Piano Nazionale per gli Investimenti Complementari al NRRP, finanziato dall'Unione Europea - NextGenerationEU, Progetto "D3 4 HEALTH - Diagnostica Digitale, prognostici e terapie per un'assistenza sanitaria sostenibile". PNC0000001, Spoke 3 Linea tematica 2, missione 4, componente 2 CUP: B53C22006120001. Questo lavoro è stato inoltre supportato dalla AIRC Foundation nell'ambito del progetto IG 2020-ID. 24521, P.I. Pozzi Daniela.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
TUBO DI LEGAME PROTEICO da 1,5 mleppendorf22431081
10x Tris/Glicina/SDSBiorad1610732
CentrifugaLabortechnikZ 216 MK HermleUtilizzato a 18.620 RCF per 20 minuti a 4 °C; C
Sistema di imaging ChemiDocBio-Rad12003153Utilizzato per l'acquisizione di immagini in gel
CloroformioSigma AldrichC2432-1LSolvente per DOTAP
Corning 1-200 & micro; Punte per pipette L Universal Fit Bulk PackCorning4845
Criterion TGX Gel prefabbricati senza macchieBiorad5678095
Acqua distillata 6 x 1LThermo Fisher15230001
DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilammonio-propano)Lipidi polari Avanti890890P-200mgUsati per preparare liposomi cationici; disciolto nel cloroformio, evaporato, idratato ed estruso
Alimentazione Enduro 300V Labnet E0303-230V
Lettore di microplacche GloMax DiscoverPromegaGM3000
Nanoparticelle d'oro (stabilizzati con citrato)Sigma-Aldrich742031-25MLUsati come nanomateriali; Usato senza ulteriore purificazione
Gel di poliacrilammide gradiente (4– 20% TGX)Bio-Rad5678095Usata per SDS e ndash; PAGE
Strumento di sovvenzione  Thermoshaker HC24N (24 microtubi da 1,5 mL)Fisher scientificoPHMT-PSC24N
Soluzione di ossido di grafene (GO)GrafeneaGO-4-1000Usati come nanomateriali; diluito a 0,25 mg/mL e sonicizzato
Plasma umano (HP)Sigma-AldrichP9523-5MLUtilizzato per l'incubazione di nanoparticelle
ImageLab SoftwareBio-Rad. Versione 6.1.0.07/Utilizzato per l'esportazione di immagini gel come file tiff
Buffer di caricamento di Laemmli 2xBiorad1610737Utilizzato per la risospensione dei pellet
MATLABMathWorks. Versione R2022a/Utilizzato per l'elaborazione di immagini, l'analisi dei dati e il calcolo dei profili
Mini-estrusoreLipidi polari Avanti610020Utilizzato per la preparazione dei liposomi
Agente Riduttore di Campioni NuPAGE (10X)Thermo ScientificNP004
Tampone di soluzione salina fosfaticaCorning 21-031-cmUtilizzato per i campioni DOTAP-HP
Kit per il test proteico Pierce BCA, 1 kit (1 L)ThermoFisher23225
Punte del pipette 0,5-10ul di chiarezzaAssigenoT-300-STK
PIPETMAN L P10L, 0.5-10 & micro; L, Espulsore MetallicoGilsonFA10002M
PIPETMAN P20, 2-20 & micro; L, Espulsore MetallicoGilsonF144056M
PIPETMAN P200, 20-200 & micro; L, Espulsore MetallicoGilsonF144058M
Sistema di pipetting automatizzato PIPETMAXGilsonGSYS0021Utilizzato per la gestione automatica dei campioni
Filtro in policarbonato (0.1 & micro; m)Lipidi polari Avanti610005-1EAUtilizzato per l'estrusione di liposomi
Standard proteici Precision Plus Protein All Blue PrestainedBiorad1610373
Standard Precision Plus Protein Non Colorati  Biorad1610363EDU
Sonicatore a celle vibra VC505Sonics and Materials inc.VC505
ZetaSizerMalvernZS90Utilizzato per misurazioni di scattering dinamico della luce (DLS) e microelettroforesi (ME)

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cai, R., Chen, C. The crown and the scepter: Roles of the protein corona in nanomedicine. Adv Mater. 31 (45), 1805740(2019).
  2. Caputo, D., et al. Nanotechnology meets oncology: A perspective on the role of the personalized nanoparticle-protein corona in the development of technologies for pancreatic cancer detection. Int J Mol Sci. 23 (18), 10591(2022).
  3. Lundqvist, M., et al. The evolution of the protein corona around nanoparticles: A test study. ACS Nano. 5 (9), 7503-7509 (2011).
  4. Hajipour, M. J., et al. Personalized protein coronas: A "key" factor at the nanobiointerface. Biomater Sci. 2 (9), 1210-1221 (2014).
  5. Quagliarini, E., et al. Protein corona-enabled serological tests for early-stage cancer detection. Sens Int. 1, 100025(2020).
  6. Caracciolo, G., et al. Size and charge of nanoparticles following incubation with human plasma of healthy and pancreatic cancer patients. Colloids Surf B Biointerfaces. 123, 673-678 (2014).
  7. Barrán-Berdón, A. L., et al. Time evolution of nanoparticle-protein corona in human plasma: Relevance for targeted drug delivery. Langmuir. 29 (21), 6485-6494 (2013).
  8. Yu, Y., Luan, Y., Dai, W. Dynamic process, mechanisms, influencing factors, and study methods of protein corona formation. Int J Biol Macromol. 205, 731-739 (2022).
  9. Hadjidemetriou, M., Kostarelos, K. Evolution of the nanoparticle corona. Nat Nanotechnol. 12 (4), 288-290 (2017).
  10. Caputo, D., et al. A protein corona-enabled blood test for early cancer detection. Nanoscale. 9 (1), 349-354 (2017).
  11. Pozzi, D., Caracciolo, G. Exploiting differences in personal nanoparticle corona profiles for cancer diagnostics. , Taylor & Francis. 431-433 (2025).
  12. Vence, M. G., et al. Potential clinical applications of the personalized, disease-specific protein corona on nanoparticles. Clin Chim Acta. 501, 102-111 (2020).
  13. Di Domenico, M., et al. Nanoparticle-biomolecular corona: A new approach for the early detection of non-small-cell lung cancer. J Cell Physiol. 234 (6), 9378-9386 (2019).
  14. Papi, M., et al. Exploitation of nanoparticle-protein interactions for early disease detection. Appl Phys Lett. 114 (16), 163702(2019).
  15. Di Santo, R., et al. Protein corona profile of graphene oxide allows detection of glioblastoma multiforme using a simple one-dimensional gel electrophoresis technique: A proof-of-concept study. Biomater Sci. 9 (13), 4671-4678 (2021).
  16. Caputo, D., et al. Synergistic analysis of protein corona and haemoglobin levels detects pancreatic cancer. Cancers. 13 (1), 93(2020).
  17. Colapicchioni, V., et al. Personalized liposome-protein corona in the blood of breast, gastric and pancreatic cancer patients. Int J Biochem Cell Biol. 75, 180-187 (2016).
  18. Di Santo, R., et al. Personalized graphene oxide-protein corona in the human plasma of pancreatic cancer patients. Front Bioeng Biotechnol. 8, 491(2020).
  19. Digiacomo, L., et al. Efficient pancreatic cancer detection through personalized protein corona of gold nanoparticles. Biointerphases. 16 (1), 011010(2021).
  20. Caputo, D., Caracciolo, G. Nanoparticle-enabled blood tests for early detection of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Lett. 470, 191-196 (2020).
  21. Caracciolo, G., et al. Challenges in molecular diagnostic research in cancer nanotechnology. Nano Today. 27, 6-10 (2019).
  22. Ashkarran, A. A., et al. Measurements of heterogeneity in proteomics analysis of the nanoparticle protein corona across core facilities. Nat Commun. 13 (1), 6610(2022).
  23. Pederzoli, F., et al. Protein corona and nanoparticles: How can we investigate on. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 9 (6), e1467(2017).
  24. Otoo, J. A., Schlappi, T. S. REASSURED multiplex diagnostics: A critical review and forecast. Biosensors. 12 (2), 124(2022).
  25. Papi, M., Caracciolo, G. Principal component analysis of personalized biomolecular corona data for early disease detection. Nano Today. 21, 14-17 (2018).
  26. Giulimondi, F., et al. Reproducibility of biomolecular corona experiments: A primer for reliable results. Part Part Syst Charact. 40 (2), 2200169(2023).
  27. Renzi, S., et al. Structuring lipid nanoparticles, DNA, and protein corona into stealth bionanoarchitectures for in vivo gene delivery. Nat Commun. 15 (1), 9119(2024).
  28. Van Dorpe, S., et al. Integrating automated liquid handling in the separation workflow of extracellular vesicles enhances specificity and reproducibility. J Nanobiotechnology. 21 (1), 157(2023).
  29. Quagliarini, E., et al. The influence of protein corona on graphene oxide: Implications for biomedical theranostics. J Nanobiotechnology. 21 (1), 267(2023).
  30. Jiříčková, A., et al. Synthesis and applications of graphene oxide. Materials. 15 (3), 920(2022).
  31. Saorin, A., et al. A redefined protocol for protein corona analysis on graphene oxide. ACS Nanosci Au. , (2025).
  32. Digiacomo, L., et al. Nanoparticle-protein corona enhances accuracy of Ca-19.9-based pancreatic cancer classification. Nanoscale. 17 (12), 7066-7075 (2025).
  33. Caputo, D., et al. Improving the accuracy of pancreatic cancer clinical staging by exploitation of nanoparticle-blood interactions: A pilot study. Pancreatology. 18 (6), 661-665 (2018).
  34. Quagliarini, E., et al. A decade of the liposome-protein corona: Lessons learned and future breakthroughs in theranostics. Nano Today. 47, 101657(2022).
  35. Wu, S. Y., An, S. S. A., Hulme, J. Current applications of graphene oxide in nanomedicine. Int J Nanomedicine. 10 Suppl 1, 9-24 (2015).
  36. Caputo, D., et al. Multiplexed detection of pancreatic cancer by combining a nanoparticle-enabled blood test and plasma levels of acute-phase proteins. Cancers. 14 (19), 4658(2022).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Interazione tra nanoparticelle e plasmananoparticelle di ossido di grafenedynamic light scatteringsaggio BCAprofili elettroforeticibiomarcatori del cancro al pancreas

Articoli correlati