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Articolo metodologico

I Treg CD8+CD103+ attenuano la malattia oculare secca attraverso la soppressione dell'infiammazione mediata dalle cellule T CD4+ e la protezione dell'integrità della superficie oculare nei topi

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DOI:

10.3791/69110

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21 novembre 2025

 , 
1Department of Ophthalmology, Jinan Second People's Hospital

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un protocollo che dimostra il trasferimento adottivo delle cellule T regolatorie CD8+CD103+ come intervento immunoterapeutico per migliorare la malattia secca oculare indotta dallo stress attraverso la modulazione completa delle risposte patogeniche delle cellule T CD4+.

Abstract

Le cellule T regolatorie CD8+CD103+ rappresentano una popolazione immunosoppressrice specializzata con potenziale terapeutico dimostrato nelle malattie autoimmuni; tuttavia, il loro ruolo nell'infiammazione della superficie oculare rimane inesplorato. Questo protocollo descrive un approccio sistematico per isolare le cellule T CD8+CD103+ da topi esposti allo stress disidratante e per valutare la loro efficacia terapeutica tramite trasferimento adottivo nella malattia oculare secca sperimentale. La metodologia comprende la selezione cellulare attivata magneticamente per la purificazione delle cellule T CD8+CD103+, l'induzione standardizzata dello stress dissiccante e valutazioni funzionali complete, inclusa la misurazione della produzione lacrimale, test di permeabilità della barriera corneale e analisi molecolare dei mediatori infiammatori. I risultati rappresentativi dimostrano che la terapia con cellule T CD8+CD103+ ha significativamente ripristinato la produzione di lacrime, preservato le popolazioni di cellule congiuntivali del goblet e mantenuto l'integrità della barriera epiteliale corneale. Il trattamento ha ottenuto una sostanziale soppressione dell'espressione della metalloproteinasi della matrice, una riduzione della morte cellulare apoptotica e il modulo dei profili delle citochine da modelli pro-infiammatori a quelli di protezione dei tessuti. Il protocollo riduceva efficacemente l'infiltrazione delle cellule T CD4+ nei tessuti oculari, sopprimendo contemporaneamente la produzione patogena di IL-17A e IFN-γ e aumentando i livelli protettivi di IL-13. Questo approccio fornisce un solido quadro sperimentale per l'indagine dell'immunomodulazione mediata da cellule T CD8+CD103+ nei disturbi della superficie oculare e stabilisce una metodologia fondamentale per sviluppare nuove terapie cellulari per la gestione della secchezza oculare.

Introduzione

La malattia dell'occhio secco (DED) rappresenta un disturbo diffuso e debilitante della superficie oculare che è emerso come una grave preoccupazione sanitaria globale, colpendo dal 10 al 30% della popolazione mondiale e compromettendo in modo sostanziale la qualità della vita, la produttività lavorativa e il benessere psicologico deipazienti 1,2,3. La fisiopatologia della DED coinvolge un'interazione complessa tra instabilità del film lacrimale, infiammazione della superficie oculare e anomalie neurosensoriali, che collettivamente perpetuano un circolo vizioso di danni ai tessuti e compromissionefunzionale 4. A livello molecolare, l'iperosmolarità lacrimale funge da meccanismo patogeno centrale, scatenando eventi infiammatori a cascata che attivano le vie di risposta allo stress, inducono il rilascio di mediatori proinfiammatori e, in ultima analisi, compromettono il delicato equilibrio omeostatico del microambiente della superficieoculare 5,6,7.

Il panorama immunologico della DED è dominato da risposte immunitarie adattive, con l'immunità mediata da cellule T CD4+ che svolge un ruolo fondamentale nell'orchestrare il deterioramento della superficie oculare e perpetuare l'infiammazionecronica 8. Le cellule T CD8+ costituiscono un componente essenziale della popolazione immunitaria omeostatica normale all'interno dei tessuti oculari, mantenendo la sorveglianza immunitaria e l'integrità dei tessuti in condizionifisiologiche 9. Indagini fondamentali hanno dimostrato che lo stress disidratante (DS) attiva le cellule presentanti antigene e successivamente prepara le cellule T CD4+ verso fenotipi patogenici, che possono indurre autonomamente la cheratocongiuntivite lacrimale autoimmune (KCS) quando trasferite adottivamente a topi nudi carenti di cellule T, ricapitolando così le caratteristiche chiave della DEDumana 10,11.

Dato il ruolo centrale delle risposte disregolate delle cellule T CD4+ nella patogenesi della DED, strategie terapeutiche mirate alla modulazione dell'immunità patogena delle cellule T sono emerse come approcci promettenti per la gestione di questa malattia. In questo contesto, le cellule T regolatorie CD8+ (Treg), in particolare il sottoinsieme CD8+CD103+, hanno attirato notevole attenzione grazie alle loro potenti capacità immunosoppressive e alle funzioni protettive dei tessuti in diverse condizioni autoimmuni e infiammatorie. Queste popolazioni regolatorie specializzate modulano le risposte immunitarie attraverso molteplici meccanismi, tra cui la soppressione mediata dalle citochine, l'inibizione del contatto cellulare diretto e la regolazione metabolica della funzione dei linfocitieffettori 12,13,14. L'integrina αEβ7 (CD103) funge da recettore critico di homing che facilita il posizionamento dei linfociti intraepiteliali nei tessuti mucosi, permettendo ai Treg CD8+CD103+ di esercitare effetti immunoregolatori localizzati nei siti diinfiammazione 15.

Ci sono sempre più evidenze che i Treg CD8+CD103+ abbiano un potenziale terapeutico significativo per mitigare le reazioni immunitarie dannose in una serie di condizioni mucoseautoimmuni 16,17,18. Queste cellule presentano schemi di traffico unici che permettono un accumulo preferenziale nei siti mucosi, dove possono contrastare efficacemente le risposte immunitarie distruttive dei tessuti, favorendo al contempo la guarigione e l'omeostasi. Recenti indagini hanno iniziato a chiarire il ruolo delle cellule T CD8+CD103+ nell'immunità della superficie oculare, dimostrando la loro espansione numerica nei linfonodi cervicali dopo l'esposizione alla DS e la loro capacità di migrare ai tessuticongiuntivali 19,20,21,22. Tuttavia, nonostante queste osservazioni intriganti, i contributi funzionali specifici delle cellule T CD8+CD103+ alla patogenesi dell'occhio secco e il loro potenziale terapeutico nel modulare il danno superficiale oculare mediato da cellule T CD4+ rimangono incompletamente compresi.

Il trasferimento adottivo di Tregs CD8+CD103+ rappresenta un progresso distinto rispetto agli approcci terapeutici convenzionali per la DED, inclusi lacrime artificiali, agenti antinfiammatori e farmaci immunosoppressori, mirando ai meccanismi immunitari patogeni sottostanti piuttosto che limitandosi a trattare le manifestazionisintomatiche. A differenza delle terapie immunosoppressive sistemiche che sopprimono ampiamente la funzione immunitaria, l'intervento basato su Treg CD8+CD103+ offre una modulazione mirata delle risposte patogeniche delle cellule T CD4+ preservando al contempo l'immunitàprotettiva 24. Questo approccio integra le terapie cellulari esistenti, come le applicazioni con cellule staminali mesenchimali e il trasferimento di Treg CD4+CD25+, fornendo una maggiore specificità tissutale mucosa tramite meccanismi di homing mediati daCD103 25.

La lacuna cruciale di conoscenza riguardo ai meccanismi regolatori con cui le cellule T CD8+CD103+ potrebbero influenzare la patogenesi dell'occhio secco rappresenta un ostacolo significativo allo sviluppo di interventi immunoterapeutici mirati per questa condizione debilitante. Inoltre, la complessa interazione tra le popolazioni di cellule T regolatorie ed effettrici nell'infiammazione della superficie oculare richiede indagini sistematiche per identificare nuovi bersagli terapeutici e ottimizzare le strategie terapeutiche. Questo studio mira a caratterizzare in modo completo la regolazione mediata dalle cellule T CD8+CD103+ dei processi patogenici guidati dalle cellule T CD4+ in un modello murino ben consolidato di malattia dell'occhio secco. L'innovazione metodologica principale prevede l'isolamento sequenziale delle cellule regolatorie CD8+CD103+, seguito da un trasferimento adottivo e una valutazione completa delle letture funzionali, istologiche e molecolari per stabilire l'efficacia terapeutica e chiarire i meccanismi sottostanti. L'obiettivo finale era migliorare la nostra comprensione delle risposte immunitarie sulla superficie oculare e scoprire potenziali strategie di trattamento per la gestione della DED negli esseri umani.

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Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sugli animali sono state condotte in stretta conformità con la Dichiarazione ARVO sull'Uso degli Animali nella Ricerca Oftalmica e sulla Vista e sono state approvate dal Comitato Etico degli Animali Sperimentali del Secondo Ospedale Popolare di Jinan. Sono stati fatti tutti gli sforzi per minimizzare la sofferenza animale e ridurre il numero di animali utilizzati in conformità con il principio delle 3R (Sostituzione, Riduzione e Raffinamento).

1. Preparazione animale e progettazione sperimentale

  1. Ottenere femmine di topi C57BL/6 di età compresa tra 6 e 8 settimane da una struttura approvata per animali da laboratorio (codice ceppo: 027) con uno stato di salute specifico e privo di patogeni.
  2. Gli animali domestici in un ambiente controllato, mantenendo cicli chiaro-buio di 12 ore (luci accese 06:00-18:00), temperatura tra 22 ± 2 °C e umidità relativa del 50-60% utilizzando sistemi di monitoraggio ambientale.
  3. Permettere agli animali di acclimatarsi per 1 settimana prima delle procedure sperimentali, fornendo al contempo cibo e acqua standard in laboratorio.
  4. Randomizzare 32 topi in quattro gruppi sperimentali (n = 8 per gruppo) utilizzando randomizzazione generata al computer: controlli non stressati (NS), stress disidratante da solo (DS), stress disidratante con controllo veicolo (DS + VC) e stress disidratante con trattamento con cellule T CD8+CD103+ (DS + CD8+CD103+).
    NOTA: Monitorare quotidianamente gli animali per segni di disagio, come riduzione dell'attività o perdita di peso superiore al 10%.

2. Induzione di stress disidratante

  1. Prepara la soluzione di scopolamina idrobromuro sciogliendo 0,5 mg in 0,2 mL di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) immediatamente prima dell'uso, ottenendo una concentrazione finale di 2,5 mg/mL.
  2. Somministrare scopolamina sottocutaneamente a una dose di 0,5 mg/kg di peso corporeo (circa 0,04 mL per topo da 20 g) quattro volte al giorno alle 8:00, 12:00, 15:00 e 18:00 per cinque giorni consecutivi utilizzando aghi da 27-G.
  3. Posizionare ventole a velocità variabile per generare un tiraggio d'aria continuo con una velocità standardizzata di 15 m/s misurata a livello di gabbia tramite calibrazione di un anemometro digitale.
  4. Mantieni l'umidità ambientale sotto il 40% utilizzando camere disidratanti contenenti gel di silice attivato (mesh di grado 40, 6-12) mentre monitora continuamente le condizioni ambientali con igrometri digitali (accuratezza ±2% di umidità relativa).
  5. Mantieni la temperatura a 22 ± 1 °C per tutto il periodo di esposizione utilizzando sistemi di controllo ambientale di precisione con monitoraggio continuo.
  6. Monitorare gli animali due volte al giorno per segni di disidratazione, perdita di peso (>15% richiede esclusione) o comportamenti di disagio, tra cui toelettatura eccessiva o ridotta attività.

3. Isolamento e purificazione delle cellule T CD8+CD103+

  1. Sacrificare topi donatori precedentemente esposti a stress disidratante tramite asfissia da CO₂, seguita da lussazione cervicale, secondo i protocolli di eutanasia approvati.
  2. Prelevare milza e linfonodi cervicali superficiali in condizioni sterili utilizzando strumenti sterili in un armadietto di sicurezza biologica, inserendo i tessuti in mezzo RPMI-1640 gelato integrato con siero bovino fetale al 10%.
  3. Preparare le sospensioni a singola interrompendo meccanicamente i tessuti tramite filtri cellulari da 70 μm utilizzando sturalavandini sterili, lavando due volte le cellule con PBS contenente FBS al 2% e 1 mM di acido etilendediaminatetraacetico (EDTA).
  4. Isolare le cellule T CD8+ utilizzando la selezione cellulare attivata magneticamente con microsfere magnetiche anti-CD8 coniugate con anticorpi secondo le istruzioni del produttore.
  5. Valutare la vitalità cellulare utilizzando il test di esclusione del trypan blue (soluzione 0,4%), contando cellule vitali e non vitali tramite un contatore cellulare automatico, procedendo solo con preparati che superano il 95% di vitalità.
  6. Arricchire per l'espressione del CD103+ tramite incubazione sequenziale con anticorpo anti-CD103-APC a diluizione 1:100 per 30 minuti a 4 °C al buio.
  7. Eseguire la separazione magnetica secondaria utilizzando microsfere anti-alloficocyanina (anti-APC) con colonne LS per ottenere cellule CD8+CD103+ doppiamente positive seguendo i protocolli del produttore.
  8. Validare la purezza cellulare utilizzando la citometria a flusso colorando le aliquote con anticorpi anti-CD8-FITC e anti-CD103-APC, assicurando una popolazione di >90% di cellule CD8+CD103+ doppiamente positive prima di procedere.

4. Protocollo di trasferimento adottivo

  1. Prepara sospensioni di cellule T CD8+CD103+ a una concentrazione di 5 × 106 cellule/mL in soluzione salina sterile tamponata con fosfato, centrifugando le cellule a 300 × g per 5 minuti e risospendendole in un volume appropriato.
  2. Iniettare 1 × 106 cellule in 200 μL di PBS sterile intraperitonealmente nei giorni -2, 0 e +2 rispetto all'inizio dello stress disidratante, assicurando una miscelazione delicata prima di ogni iniezione.
  3. Somministrare volumi equivalenti di PBS sterile ai gruppi di controllo del veicolo utilizzando un programma e una tecnica di iniezione identici per mantenere la coerenza sperimentale.
  4. Mantenere le preparazioni cellulari sul ghiaccio e completare i trasferimenti entro 2 ore dall'isolamento per preservare la vitalità e la funzione ottimale.
  5. Ruotare i punti di iniezione tra la parte bassa dell'addome sinistro e destro per minimizzare l'infiammazione locale e monitorare gli animali per 24 ore dopo l'iniezione per eventuali reazioni avverse.

5. Procedura di valutazione funzionale

  1. Misurazione della produzione di lacrime
    1. Esegui misurazioni costanti alle 20:00 per tenere conto delle variazioni circadiane nella produzione di lacrime.
    2. Trattieni delicatamente il topo utilizzando dispositivi di contenimento appropriati senza anestesia per evitare interferenze con i meccanismi naturali di produzione delle lacrime.
    3. Inserire filo di cotone impregnato di rosso di fenolo nel fornice congiuntivale inferiore per esattamente 15 secondi usando pinze a punta fine.
    4. Misurare immediatamente la lunghezza della filettatura bagnata utilizzando pinze digitali di precisione (precisione ± 0,01 mm) in condizioni di illuminazione fluorescente standardizzata.
  2. Valutazione della funzione della barrieracorneale 26
    1. Anestesiare brevemente il topo con un'inalazione di isoflurano al 2% durante l'applicazione del tracciante per garantire un'instillazione precisa.
    2. Iniettare 0,5 μL di soluzione di 50 mg/mL di verde-dextrano Oregon sulla superficie corneale centrale utilizzando una micropipetta di precisione con punte a spostamento positivo.
    3. Risciacquo accuratamente le cornee con soluzione salina sterile cinque volte dopo 1 minuto di incubazione per rimuovere l'eccesso di tracciante, assicurando la completa rimozione della fluorescenza superficiale.
    4. Fotografare immediatamente le cornee utilizzando microscopia a fluorescenza con un set di filtri a fluoresceina isotiocianato (FITC) (eccitazione 490 nm, emissione 525 nm) e parametri di esposizione standardizzati.
    5. Quantificare l'intensità della fluorescenza utilizzando il software ImageJ con protocolli coerenti di selezione della regione di interesse e sottrazione di fondo.
      1. Converti le immagini in scala di grigi a 8 bit, definisci una regione circolare di interesse (ROI) standardizzata che copre il diametro centrale di 3 mm della cornea.
      2. Misurare il valore medio di grigio, sottrarre la fluorescenza di fondo misurata da una regione non corneale adiacente ed esprimere i risultati come fluorescenza totale corretta (CTF) calcolata come: CTF = Densità Integrata - (Area di ROI × Fluorescenza di fondo media)22.

6. Elaborazione e analisi istologica

  1. Rimuovere gli occhi e le strutture circostanti immediatamente dopo l'eutanasia, poi fissare il paraformaldeide al 4% per 24 ore oppure immergere in un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) per le sezioni congelate, assicurando una corretta orientazione per la sezionazione sagittale.
  2. Preparare sezioni sagittali seriali (6 μm per congelato, 5 μm per paraffina) utilizzando punti di riferimento anatomici standardizzati (nervo ottico come punto di riferimento) per una sezionazione coerente di piani su tutti gli esemplari.
  3. Eseguire periodicamente la colorazione acido-Schiff (PAS) per la quantificazione delle cellule goblet utilizzando protocolli standardizzati con controlli positivi e negativi appropriati.
  4. Eseguire la colorazione immunofluorescenza utilizzando anticorpi primari: anti-MMP-3 (1:200), anti-MMP-9 (1:100), caspasi-3 antiattivata (1:300), caspasi-8 antiattivata (1:200) e anti-CD4 (1:100) con incubazione notturna a 4 °C.
  5. Quantificare le celle del calice per millimetro di lunghezza congiuntivale utilizzando metodi di campionamento sistematico, contando le celle in cinque campi ad alta potenza non sovrapposti per sezione e facendo la media dei risultati.

7. Analisi molecolare

  1. Estrarre l'RNA totale da tessuti congiuntivali e corneali aggregati utilizzando protocolli di estrazionevalidati 27.
  2. Sintesi del cDNA e PCR28 in tempo reale quantitativo
    1. Prepara miscele di reazione di trascrizione inversa contenenti 1 μg di RNA totale, primer oligo-dT (50 μM), primer esameri casuali (100 μM), enzima trascridasi inversa, buffer di reazione e acqua priva di nucleasi in un volume finale di 20 μL.
    2. Incubare le miscele di reazione in un termociclatore a 37 °C per 15 minuti per consentire la sintesi del cDNA del primo filamento.
    3. Inattivare l'enzima trascridasi inversa riscaldando a 85 °C per 5 secondi, poi raffreddare a 4 °C e conservare il cDNA a -20 °C fino all'uso.
    4. CDNA sintetizzato diluito 1:10 con acqua priva di nucleasi da utilizzare come modello nelle successive reazioni PCR.
    5. Preparare miscele di reazione PCR in tempo reale (volume finale da 20 μL) contenenti 1 μL di modello di cDNA diluito, innesco diretto e indietro (concentrazione finale di 0,2 μM ciascuno), miscela master SYBR Green e acqua priva di nucleasi.
    6. Carica i campioni in triplicata in piastre di reazione ottiche da 96 pozzi, inclusi controlli senza template per ogni coppia di primer.
    7. Programmare il termociclatore con le seguenti condizioni: denaturazione iniziale a 95 °C per 10 minuti, seguita da 40 cicli di denaturazione (95 °C per 15 secondi), ricottura (60 °C per 30 secondi) ed estensione (72 °C per 30 secondi).
    8. Includere una fase della curva di dissociazione immediatamente dopo l'amplificazione: 95 °C per 15 secondi, 60 °C per 1 minuto, poi aumento graduale della temperatura a 95 °C a una velocità di 0,3 °C/s per verificare l'amplificazione a prodotto singolo.
    9. Analizza le curve di amplificazione e i valori della soglia di ciclo (Ct) utilizzando il software dello strumento, garantendo un'efficienza di amplificazione tra il 90 e il 110% per tutte le coppie di innesco.
    10. Normalizzare l'espressione genica bersaglio (IL-17A, IFN-γ, IL-13, MMP-3 e MMP-9) al gene di gestione GAPDH utilizzando il metodo 2-ΔΔCt .
    11. Utilizzare le sequenze di primer come specificato nella Tabella 1 per tutti i geni target e di riferimento.
  3. Quantificare i livelli di proteine delle citochine negli estratti tissutali utilizzando kit ELISA disponibili in commercio con curve standard appropriate e controlli di qualità.

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Risultati

L'implementazione con successo di questo protocollo porta a un miglioramento completo della patologia della superficie oculare indotta da stress disidratante tramite immunomodulazione mediata da cellule T CD8+CD103+. I risultati positivi dimostrano un significativo ripristino della produzione di lacrime, ottenendo tipicamente un recupero del 60-80% rispetto ai controlli non stressati, mentre gli animali trattati con veicoli mostrano deficit persistenti di...

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Discussione

Questa indagine stabilisce che le cellule T regolatorie CD8+CD103+ sono potenti agenti terapeutici che disidratano la malattia oculare secca indotta dallo stress attraverso la modulazione completa delle risposte patogeniche mediate dalle cellule T CD4+. I risultati rivelano che il trasferimento adottivo delle cellule T CD8+CD103+ raggiunge una protezione multifaccettata dell'integrità della superficie oculare, comprendendo il ripristino funzionale della produzione lacrimale, la conservaz...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti, finanziari o di altro tipo, che possano influenzare in modo inappropriato l'opera descritta in questo manoscritto.

Ringraziamenti

Riconosciamo il supporto tecnico fornito dal personale di laboratorio del Jinan 2nd People's Hospital e dal personale delle strutture di cura animale che ha mantenuto condizioni abitative ottimali durante tutto il periodo sperimentale.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anticorpo anti-CD103-APCBiolegendClone 2E7Citometria di flusso e ordinamento cellulare
Microsfere magnetiche anti-CD8Miltenyi Biotec-Separazione a celle magnetiche
Corneae Oregon green-dextranoInvitrogenD7172Peso molecolare 70.000
Kit ELISA IFN-& GAMMA;eBioscienzaBMS606Quantificazione delle citochine
ELISA kit IL-13eBioscienzaBMS6015Quantificazione delle citochine
ELISA kit IL-17AeBioscienzaBMS6001Quantificazione delle citochine
ImageJIstituti Nazionali di SaluteVersione 1.53k
Fili di cotone rosso fenoloZona-Veloce, Yokota-Misurazione della produzione di lacrime
Scopolamina idrobromuroMelonepharmaMB5860Antagonista muscarinico

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