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Articolo metodologico
Qui presentiamo un protocollo che dimostra il trasferimento adottivo delle cellule T regolatorie CD8+CD103+ come intervento immunoterapeutico per migliorare la malattia secca oculare indotta dallo stress attraverso la modulazione completa delle risposte patogeniche delle cellule T CD4+.
Le cellule T regolatorie CD8+CD103+ rappresentano una popolazione immunosoppressrice specializzata con potenziale terapeutico dimostrato nelle malattie autoimmuni; tuttavia, il loro ruolo nell'infiammazione della superficie oculare rimane inesplorato. Questo protocollo descrive un approccio sistematico per isolare le cellule T CD8+CD103+ da topi esposti allo stress disidratante e per valutare la loro efficacia terapeutica tramite trasferimento adottivo nella malattia oculare secca sperimentale. La metodologia comprende la selezione cellulare attivata magneticamente per la purificazione delle cellule T CD8+CD103+, l'induzione standardizzata dello stress dissiccante e valutazioni funzionali complete, inclusa la misurazione della produzione lacrimale, test di permeabilità della barriera corneale e analisi molecolare dei mediatori infiammatori. I risultati rappresentativi dimostrano che la terapia con cellule T CD8+CD103+ ha significativamente ripristinato la produzione di lacrime, preservato le popolazioni di cellule congiuntivali del goblet e mantenuto l'integrità della barriera epiteliale corneale. Il trattamento ha ottenuto una sostanziale soppressione dell'espressione della metalloproteinasi della matrice, una riduzione della morte cellulare apoptotica e il modulo dei profili delle citochine da modelli pro-infiammatori a quelli di protezione dei tessuti. Il protocollo riduceva efficacemente l'infiltrazione delle cellule T CD4+ nei tessuti oculari, sopprimendo contemporaneamente la produzione patogena di IL-17A e IFN-γ e aumentando i livelli protettivi di IL-13. Questo approccio fornisce un solido quadro sperimentale per l'indagine dell'immunomodulazione mediata da cellule T CD8+CD103+ nei disturbi della superficie oculare e stabilisce una metodologia fondamentale per sviluppare nuove terapie cellulari per la gestione della secchezza oculare.
La malattia dell'occhio secco (DED) rappresenta un disturbo diffuso e debilitante della superficie oculare che è emerso come una grave preoccupazione sanitaria globale, colpendo dal 10 al 30% della popolazione mondiale e compromettendo in modo sostanziale la qualità della vita, la produttività lavorativa e il benessere psicologico deipazienti 1,2,3. La fisiopatologia della DED coinvolge un'interazione complessa tra instabilità del film lacrimale, infiammazione della superficie oculare e anomalie neurosensoriali, che collettivamente perpetuano....
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Tutte le procedure sperimentali sugli animali sono state condotte in stretta conformità con la Dichiarazione ARVO sull'Uso degli Animali nella Ricerca Oftalmica e sulla Vista e sono state approvate dal Comitato Etico degli Animali Sperimentali del Secondo Ospedale Popolare di Jinan. Sono stati fatti tutti gli sforzi per minimizzare la sofferenza animale e ridurre il numero di animali utilizzati in conformità con il principio delle 3R (Sostituzione, Riduzione e Raffinamento).
1. Preparazione animale e progettazione sperimentale
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L'implementazione con successo di questo protocollo porta a un miglioramento completo della patologia della superficie oculare indotta da stress disidratante tramite immunomodulazione mediata da cellule T CD8+CD103+. I risultati positivi dimostrano un significativo ripristino della produzione di lacrime, ottenendo tipicamente un recupero del 60-80% rispetto ai controlli non stressati, mentre gli animali trattati con veicoli mostrano deficit persistenti di.......
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Questa indagine stabilisce che le cellule T regolatorie CD8+CD103+ sono potenti agenti terapeutici che disidratano la malattia oculare secca indotta dallo stress attraverso la modulazione completa delle risposte patogeniche mediate dalle cellule T CD4+. I risultati rivelano che il trasferimento adottivo delle cellule T CD8+CD103+ raggiunge una protezione multifaccettata dell'integrità della superficie oculare, comprendendo il ripristino funzionale della produzione lacrimale, la conservaz.......
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Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti, finanziari o di altro tipo, che possano influenzare in modo inappropriato l'opera descritta in questo manoscritto.
Riconosciamo il supporto tecnico fornito dal personale di laboratorio del Jinan 2nd People's Hospital e dal personale delle strutture di cura animale che ha mantenuto condizioni abitative ottimali durante tutto il periodo sperimentale.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Anticorpo anti-CD103-APC | Biolegend | Clone 2E7 | Citometria di flusso e ordinamento cellulare |
| Microsfere magnetiche anti-CD8 | Miltenyi Biotec | - | Separazione a celle magnetiche |
| Corneae Oregon green-dextrano | Invitrogen | D7172 | Peso molecolare 70.000 |
| Kit ELISA IFN-& GAMMA; | eBioscienza | BMS606 | Quantificazione delle citochine |
| ELISA kit IL-13 | eBioscienza | BMS6015 | Quantificazione delle citochine |
| ELISA kit IL-17A | eBioscienza | BMS6001 | Quantificazione delle citochine |
| ImageJ | Istituti Nazionali di Salute | Versione 1.53k | |
| Fili di cotone rosso fenolo | Zona-Veloce, Yokota | - | Misurazione della produzione di lacrime |
| Scopolamina idrobromuro | Melonepharma | MB5860 | Antagonista muscarinico |
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