Articolo metodologico

Modello tridimensionale di organoidi tumorali derivati dal paziente per lo screening in vitro dei recettori chimerici degli antigeni antigenici in vitro

DOI:

10.3791/69113

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30 dicembre 2025

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1Department of Oncology, Shenzhen Qianhai Shekou Free Trade Zone Hospital, 2Department of Pharmacology, Joint Laboratory of Guangdong-Hong Kong Universities for Vascular Homeostasis and Diseases, School of Medicine, Southern University of Science and Technology, 3Department of Digestive Disease, Shenzhen Qianhai Shekou Free Trade Zone Hospital, 4Department of Human Cell Biology and Genetics, School of Medicine, Southern University of Science and Technology, 5Department of Surgical Endoscopy, Shenzhen People's Hospital (The First Affiliated Hospital, Southern University of Science and Technology; The Second Clinical Medical College, Jinan University), 6Department of Medicine and Therapeutics, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 7Institute of Digestive Disease, State Key Laboratory of Digestive Disease, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo stabilisce un modello di co-coltura in vitro utilizzando organoidi tumorali derivati dal paziente e cellule T (CAR-T) del recettore chimerico dell'antigene (CAR-T) per valutare l'attività citotossica specifica delle cellule CAR-T contro cellule tumorali solide.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La terapia con cellule T (CAR-T) del recettore antigenico chimerico ha raggiunto un'efficacia clinica entusiasmante nelle neoplasie ematologiche, ma la terapia con cellule CAR-T per tumori solidi richiede ancora ulteriori sviluppi. Gli organoidi tumorali derivati dal paziente sono modelli di malattia in vitro che mantengono l'eterogeneità del paziente e sono stati utilizzati per testare l'efficacia e la sicurezza della chemioterapia e dei farmaci mirati. Questo metodo descrive un modello di test di efficacia in vitro che co-coltiva organoidi tumorali con cellule CAR-T. I campioni di cancro colorettale provenienti dai pazienti sono costruiti in organoidi tumorali con una struttura tridimensionale (3D) in una matrice di membrana basale. Gli organoidi tumorali possono crescere stabilmente e essere spostati continuamente. Gli organoidi tumorali maturi vengono separati dalla matrice tramite lavaggio e centrifugazione, e le cellule CAR-T vengono aggiunte a diversi rapporti effettore-bersaglio (E:T) per formare un sistema di co-coltura immuno-organoide. Dopo 6-24 ore, la morfologia e le strutture intercellulari degli organoidi vengono osservate tramite imaging in campo chiaro. Questo esperimento esegue inoltre la colorazione delle cellule morte nel sistema di co-coltura, che può riflettere la vitalità degli organoidi e valutare l'effetto citotossico delle cellule CAR-T sugli organoidi tumorali. Questo esperimento può osservare efficacemente l'interazione tra le cellule CAR-T e gli organoidi tumorali 3D, e i risultati possono essere utilizzati per valutare l'attività di uccisione tumorale delle cellule CAR-T.

Introduzione

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La terapia con cellule T (CAR-T) del recettore antigenico chimerico ha mostrato un notevole successo clinico nel trattamento delle neoplasieematologiche 1. Tuttavia, la sua applicazione nei tumori solidi rimane limitata a causa di diversi ostacoli importanti, tra cui l'eterogeneità tumorale e la perdita di antigeni, le barriere fisiche e chimiche all'interno della massa tumorale e il microambiente tumoraleimmunosoppressivo 2,3. Queste sfide contribuiscono all'efficacia limitata della terapia con cellule CAR-T in contesti tumorali solidi.

La valutazione in vitro dell'efficacia delle cellule CAR-T è un passaggio cruciale durante lo sviluppo preclinico. I modelli più comunemente utilizzati sono le linee cellulari tumorali, che possono esprimere antigeni associati al tumore specifici o essere ingegnerizzate per trasportare geni reporter come la luciferasi 4,5. Di conseguenza, i risultati degli saggi convenzionali basati su linee cellulari spesso non prevedono gli esiti clinici. I modelli tumorali derivati dal paziente offrono un'alternativa promettente per valutare con maggiore precisione la funzione del CAR-T nel contesto dei tumori solidi.

Sebbene diversi studi abbiano iniziato a utilizzare le PDTO per la valutazione delle cellule CAR-T, restano sfide nell'istituire protocolli di co-coltura standardizzati, robusti e accessibili che bilancino efficacemente la conservazione dell'architettura tumorale 3D con un'interazione efficiente cellula immunitaria-cellula tumorale. Gli organoidi tumorali derivati dal paziente (PDTO) sono modelli tridimensionali (3D) di malattia ex vivo generati dai tessuti o cellule tumorali del paziente. I PDTO sono stati sviluppati con successo per un'ampia gamma di tipi tumorali, tra cui tumori colorettali, al seno, al pancreas e ai polmoni. Queste strutture mantengono l'architettura istologica, i profili molecolari e l'eterogeneità funzionale del tumoreoriginale 6. Accanto alle cellule tumorali primarie e agli xenoinnesti derivati dal paziente (PDX), i PDTO rappresentano una piattaforma preziosa per modellare le caratteristiche specifiche della malattiadel paziente 7. Rispetto alle linee cellulari tumorali convenzionali o alle colture primarie, le PDTO riproducono più fedelmente l'ambiente tumorale in vivo, mostrando composizioni cellulari complesse e organizzazionestrutturale 8. Mantengono inoltre la stabilità genomica e preservano i modelli di espressione genica su passaggi estesi, permettendo una valutazione più accurata delle risposteterapeutiche 9,10. I PDTO sono stati impiegati con successo in studi sulla biologia tumorale, lo screening farmacologico e la medicina di precisione, e sono sempre più riconosciuti per la loro utilità nei test di immunoterapia, inclusa l'identificazione di nuovi bersagli CAR, l'ottimizzazione del design CAR e la valutazione dellacitotossicità 6,11,12,13 . Una limitazione comune della coltura organoide è la sua dipendenza da componenti della matrice extracellulare (ECM) come Matrigel (d'ora in poi chiamata matrice di membrana basale [BMM]) per il mantenimento della struttura 3D, che può ostacolare l'infiltrazione delle cellule immunitarie nei saggi di co-coltura. Per garantire coerenza e interazione cellulare ottimale nella co-coltura, si selezionano tipicamente organoidi all'interno di un intervallo di dimensioni definito (ad esempio, 100-200 μm di diametro).

Questo protocollo descrive una piattaforma di co-coltura per valutare la citotossicità delle cellule CAR-T utilizzando PDTO derivati dal cancro colorettale. I campioni tumorali dei pazienti vengono dissociati e coltivati in BMM per generare organoidi 3D. Una volta maturi ed espansi, gli organoidi di dimensioni uniformi vengono isolati e marcati con fluorescenza. Vengono seminati in piastre multi-pozzetto e co-colti con cellule CAR-T a rapporti effettore-bersaglio (E:T) variabili. Una caratteristica chiave di questo approccio è la rimozione deliberata delle PDTO dal BMM prima della co-coltura, consentendo l'accesso diretto e senza ostacoli delle cellule CAR-T agli organoidi tumorali mantenendo la loro integrità 3D in sospensione. Dopo 24 ore, la microscopia a campo chiaro rivela una progressiva disintegrazione della PDTO, caratterizzata da morfologia 3D interrotta, riduzione delle cellule tumorali e perdita di vitalità. L'imaging delle cellule vive e la microscopia a fluorescenza visualizzano ulteriormente le interazioni tra le cellule CAR-T marcate fluorescentmente e i bersagli tumorali. Vengono utilizzati sagaggi quantitativi sulla morte cellulare per valutare la citotossicità. Questa co-coltura immunitaria a base di organoidi fornisce una piattaforma robusta e specifica per il paziente per valutare l'efficacia antitumorale delle cellule CAR-T ex vivo, consentendo l'ottimizzazione terapeutica e supportando la traduzione clinica.

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Protocollo

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Sono stati utilizzati organoidi derivati da pazienti oncologici colorettali. Frammenti di tessuto tumorale sono stati raccolti da pazienti indifferenti al trattamento con adenocarcinoma colorettale primario (CRC) istologicamente confermato. Tutti i tessuti sono stati prelevati da campioni di biopsia endoscopica raccolti durante le procedure diagnostiche standard presso l'Ospedale della Zona Franca di Shenzhen Qianhai Shekou. Tutti i tessuti donatori sono stati confermati come CRC tramite esame istopatologico da parte di patologi istituzionali. Il protocollo segue le linee guida istituzionali. Sono stati ottenuti i consensi informati scritti da tutti i pazienti. Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale della Zona di Libero Scambio Qianhai Shekou di Shenzhen (2024-009-01K).

1. Cultura PDTO

  1. Preparazione dei tessuti
    1. Inserire frammenti di tessuto tumorale ottenuti tramite biopsia colonscopia da pazienti con adenocarcinoma colorettale primario (CRC) istologicamente confermato in un tubo sterile da 50 mL.
    2. Aggiungi 30 mL di soluzione per lavaggio a tessuto freddo composta da Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), albumina sieroica bovina all'1% (BSA), 100 U/mL di penicillina, 0,1 mg/mL di estreptomicina, 50 μg/mL di gentamicina, 5 μg/mL di anfotericina B e 10 μM inibitore della chinasi Rho-associata (Y-27632).
    3. Metti il tubo sul ghiaccio e muovi delicatamente per 5 minuti per lavare il fazzoletto.
    4. Ripeti il passo 1.1.3. Altre due volte con nuova soluzione detergente.
  2. Digestione dei tessuti
    1. Taglia via il tessuto necrotico o adiposo e taglia il tumore in frammenti di tessuto.
    2. Temperatura di 8 mL di mezzo digeritivo (mezzo DMEM, collagenasi 500 U/mL IV, 1,5 mg/mL collagenasi II, 20 μg/mL ialuronidasi, 0,1 mg/mL dispasi tipo II, 10 μM Y-27632 e siero bovino fetale all'1%) fino a 37 °C.
    3. Trasferire i frammenti nel buffer di digestione e incubare a 37 °C in un bagno d'acqua. Fai roteare delicatamente il tubo a mano per ~10 secondi ogni 5 minuti per facilitare la penetrazione degli enzimi.
      NOTA: Regola il volume del buffer di digestione in base alla dimensione del blocco tissutale. Generalmente, 8-10 mL sono sufficienti per le dimensioni delle biopsie endoscopiche.
    4. Osserva al microscopio dopo 15 minuti per controllare lo stato di dissociazione. Se rimangono frammenti di tessuto, proseguire la digestione fino a un massimo di 30 minuti.
    5. Quando i grappoli sono visibili, si pipetta delicatamente (5-10 volte) usando una pipetta da 10 mL per dissociare meccanicamente. Centrifuga a 350 × g per 5 minuti.
    6. Scartare il soprantantante; risospendere il pellet in 10 mL di soluzione di lavaggio e centrifugare a 350 × g per 5 minuti. Ripeti il lavaggio due volte.
      NOTA: I PDTO tipicamente iniziano a formare strutture sferiche compatte entro 3-5 giorni dalla coltivazione. Gli organoidi hanno mostrato una proliferazione robusta e hanno raggiunto una dimensione adatta per la sperimentazione (circa 100-200 μm di diametro) entro il giorno 10-14. Il passaggio è stato effettuato ogni 7-10 giorni per mantenere una crescita sana e prevenire sovraconfluenza o necrosi centrale. Generalmente, si utilizza un buffer di digestione di 8-10 mL per ogni biopsia (frammenti di 2 mm³), garantendo l'espressione di TrypLE a una concentrazione di lavoro finale di 1×.

2. Costruzione dei PDTO

  1. Incorporamento matriciale
    1. Mettere 200 μL di BMM (pre-raffreddati a 4 °C) in un tubo pulito e pipettare la cellula su e giù almeno 10-15 volte usando una punta di pipetta pre-raffreddata finché la sospensione appare omogenea, senza grumi visibili.
    2. Erogare circa gocce da 30 μL in ciascun pozzo di una piastra a 24 pozzi. Incubare a 37 °C per 10 minuti per solidificarsi.
    3. Aggiungi 500 μL di mezzo per colture organoidi (medium avanzato DMEM/F12, contenente 50 μg/mL R-spondin 1, 10 μg/mL Noggin, 500 μg/mL EGF, 100x HEPES, 100x Glutammax, 500x Normocin, 500x Gentamicina/anfotericina B, 50x N2, 100x B27, 500 mM n-Acetilcisteina, 1 M Niacinamide, 5 mM inibitore Alk 4/5/7, 30 M inibitore p38, 100 μM Gastrin, e 100 μM di prostaglandine E2) per pozzo.
      NOTA: Utilizzare circa 30 μL di BMM per goccia; Aggiusta in base alla densità cellulare.
  2. Mantenimento della cultura
    1. Coltura degli organoidi a 37 °C con il 5% diCO2; Cambia il medium ogni 3 giorni.
    2. Monitorare quotidianamente la formazione degli organoidi. Aspettatevi piccoli sferoidi entro il terzo giorno.
    3. Valutare l'insediamento di organoidi riuscito nei giorni 6-10. Il tempo di formazione (varia tra 3 e 14 giorni) dipende dalla vitalità e dall'attesa del tessuto.

3. PDTO di passaggio

  1. Disaggregazione
    1. Preraffredda la centrifuga a 4°C. Rimuovere il medium e aggiungere 1 mL di HBSS gelato e pipetta delicatamente 3-5 volte per interrompere il BMM.
      NOTA: Gli organoidi ben cresciuti possono essere osservati a occhio nudo come piccoli puntini bianchi.
    2. Trasferire la sospensione in un tubo sterile da 15 mL e centrifugare a 350 × g per 5 minuti.
  2. Dissociazione enzimatica
    1. Scartate il sovrantante e aggiungete 1 mL di Triple. Metti in un bagno d'acqua a 37 °C per 2 minuti.
    2. Aggiungere 2 mL di HBSS per neutralizzare il TrypLE; centrifuga a 350 × g per 5 minuti.
    3. Rimuovere il sovrantantante e risospendere 2 mL di HBSS. Centrifuga di nuovo a 350 × g per 5 minuti.
  3. Riinserimento
    1. Aggiungere BMM fresco al pellet in un rapporto di 1:3-1:6 (pellet organoide: BMM, v/v); Risospendi delicatamente. Ogni goccia contiene circa 30 μL di volume finale. Inserire le gocce in una nuova piastra a 24 pozzi; Incubare a 37 °C per 10 minuti.
    2. Aggiungi 500 μL di substrato per pozzo e incuba a 37 °C con il 5% diCO2.
    3. Esaminare i pozzi quotidianamente; osserva il riassemblaggio 3D entro circa 48 ore.
    4. Dopo 3-5 passaggi, seleziona organoidi sani per saggi a valle o crioconservazione.

4. Co-coltura di cellule CAR-T e PDTO

  1. Preparazione del mezzo di cocoltura
    1. Integrare il mezzo di coltura organoide in base con 10 ng/L di IL-2 e 0,05 mM β-mercaptoetanolo per supportare la vitalità del CAR-T.
      NOTA: Il mezzo base supporta la struttura 3D e la vitalità dei PDTO.
  2. Preparazione PDTO
    1. Rimuovere le gocce di BMM contenenti PDTO mature (ad esempio, giorno 4-6) dalla piastra di coltura utilizzando uno raschietto a cellule sterile o una punta di pipetta.
    2. Trasferire la miscela BMM/PDTO su una valvoletta conica da 15 mL.
    3. Aggiungere 5-10 mL di HBBS ghiacciato o soluzione detergente (come descritto nel passo 1.1.2) al tube. Inverti delicatamente 5-10 volte per spostare gli organoidi dal BMM.
    4. Lascia riposare il composto sul ghiaccio per 5 minuti. Il BMM diventerà liquido, mentre i PDTO dissociati rimarranno in sospeso.
    5. Aspirare con attenzione il surnatante contenente il BMM, lasciando il pellet PDTO indietro. Evita di disturbare il pellet.
    6. Ripeti i passaggi da 4.2.3 a 4.2.5 altre due volte per garantire la completa rimozione del BMM.
    7. Dopo il lavaggio finale, raccogliere il sovrantantante contenente PDTO e centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
    8. Aspirare il sovrantantante e risospendere il pellet PDTO in 1-2 mL di mezzo organoide o mezzo di cocoltura.
    9. (Opzionale per il conto) Preparate una sospensione a singola cella.
      1. Se è necessario un conteggio preciso, trasferire gli organoidi sospesosi in un nuovo tubo e incubare con TrypLE Express preriscaldato a 37 °C per 3-5 minuti, seguito da una pipettura delicata per ottenere una sospensione a singola cellula. Procedere con il conteggio delle cellule (ad esempio, usando un emocitometro o un contatore cellulare automatico).
        NOTA: Questo passaggio dissocia gli organoidi ed è solo a scopo di conteggio prima della riplaccazione.
    10. Selezione della dimensione e standardizzazione: Per garantire una dimensione organoide costante per la co-coltura, si fanno passare i PDTO sospesosi (dal passo 4.2.8) attraverso un colone cellulare da 70 μm posizionato sopra un tubo conico da 50 mL. Questo passaggio rimuove grandi aggregati organoidi e detriti, rappresentando una frazione di dimensioni standardizzata adatta alla co-coltura uniforme.
    11. Centrifugare la sospensione organoide standardizzata a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
    12. Aspirare il sovrandanante e risospendere i PDTO standardizzati in un volume appropriato di mezzo di co-coltura preriscaldato.
    13. Contare i PDTO standardizzati (ad esempio, usando un emocitometro al microscopio, contando il numero di organoidi per campo).
      NOTA: Il conteggio si basa sul numero di organoidi, non sul numero cellulare.
    14. Semina i PDTO standardizzati nella piastra multi-pozzetto desiderata (ad esempio, piastra a U a 96 pozzi) al numero target per pozzo.
    15. Aggiungere le cellule CAR-T ai pozzi ai rapporti effettore-bersaglio desiderati (E:T).
  3. Etichettatura dei PDTO
    1. Preraffredda la centrifuga a 4 °C. Aspirare il mezzo; Aggiungi 1 mL di HBSS per spostare le gocce.
    2. Trasferisci in un tubo centrifuga da 15 mL, aggiungi 4 mL di HBSS e pipetta delicatamente. Centrifuga a 350 × g per 5 minuti.
    3. Scarta il sovrantante, aggiungi 5 mL di HBSS e pipetta delicatamente. Centrifuga di nuovo a 350 × g per 5 minuti.
    4. Prepara la soluzione funzionante Hoechst 33342.
    5. Risospendere pellet in 1 mL di soluzione Hoechst 33342 (concentrazione finale 5 μg/mL). Mescola delicatamente per inversione 3-5 volte per garantire una penetrazione uniforme del colorante. Proteggi dalla luce avvolgendo il tubo in carta stagnola. Incubare a 37 °C per 10 minuti. Dopo la macchia, lava due volte con HBSS per rimuovere il colorante in eccesso.
  4. Impiatti PDTO
    1. Stima della densità organoide con un rapporto gocce di gel a pozzo di 1:5; risospendere in mezzo di cocoltura a circa 1 × 103 organoidi/mL.
    2. Aggiungere 100 μL per pozzo in una piastra da 96 pozzi; includere almeno triplicati per condizione.
      NOTA: Non effettuare il conteggio delle cellule in questa fase; gli organoidi rimangono intatti.
  5. Co-cultura CAR-T
    NOTA: Questo protocollo si concentra sulla co-coltura e sulla valutazione dell'efficacia delle cellule CAR-T con PDTO. La generazione e la caratterizzazione delle cellule CAR-T utilizzate in questo studio sono descritte nella Sezione 8.
    1. Prelevare le cellule CAR-T in fase logaritmica. Tingere con Trippan Blue per confermare la fattibilità >95%.
    2. Centrifuga a 350 × g per 5 minuti; Risospendere nel mezzo di co-cultura.
    3. Regolare le concentrazioni a 4 × 106/mL, 2 × 106/mL e 1 × 106/mL.
    4. Aggiungere 100 μL di sospensione CAR-T per pozzo secondo il progetto sperimentale. Aggiungere 100 μL di mezzo di co-coltura per controllare i pozzi.
    5. Incubare la piastra a 37 °C, 5% di CO2 per 6-24 ore.

5. Colorazione delle cellule morte

  1. Macchiatura verde SYTOX
    1. Per ogni 1 × 105 celle, preparare 100 μL di soluzione di colorazione Nuclear Green diluendo 1 μL di SYTOX Green (1000x) in 1 mL di tampone per il saggio.
    2. Nei momenti di co-coltura di 6 e 24 ore, aggiungere 100 μL di soluzione di colorazione SYTOX Green per pozzo. Incubare a 37 °C per 20 minuti al buio.

6. Acquisizione dell'immagine

  1. Aspira il soprantantante e aggiungi 100 μL di DMEM/F12.
  2. Cattura immagini in campo chiaro e fluorescente usando un microscopio (ad esempio, confocale):
    Hoechst 33342 (PDTO): eccitazione (Ex)/emissione (Em) = 350 nm/461 nm
    mCherry (CAR-T): Ex/Em = 587 nm/610 nm
    SYTOX Green (cellule morte): Ex/Em = 504 nm/528 nm
  3. Cattura almeno immagini triplicate per pozzo, concentrandosi sul campo centrale.

7. Analisi dei dati

  1. Launch ImageJ (versione 1.54, NIH, https://imagej.nih.gov/ij/); importare immagini del canale SYTOX Green. Imposta manualmente la soglia per distinguere i segnali di fluorescenza dallo sfondo (Immagine > Regola > Soglia).
  2. Usa la funzione Analizza > Misura per calcolare la densità integrata. Esporta i dati come .csv per l'analisi statistica successiva in un software di analisi statistica appropriato (ad esempio, GraphPad Prism).
  3. Imposta la soglia per separare i segnali di fluorescenza dal fondo.
  4. Seleziona l'intero campo; esegui Analizza > Misura per calcolare l'intensità sommata del segnale di fluorescenza.
  5. Esportare dati ed eseguire analisi statistiche per confrontare il trattamento con il controllo a 24 ore.

8. Generazione e caratterizzazione delle cellule CAR-T

  1. Progettazione costruttiva CAR
    NOTA: Le cellule CAR-T utilizzate in questo studio mirano a B7-H3 (codificata dal gene CD276), un antigene frequentemente sovraespresso nel cancrocolorettale 14. La struttura CAR consiste in:
    Dominio extracellulare: Un frammento variabile a catena singola (scFv) derivato da un anticorpo monoclonale contro il clone B7-H3 376.96.
    Dominio di cerniera e transmembrana: dominio di cerniera CD8α e dominio transmembrana.
    Dominio co-stimolante: umano CD28.
    Dominio di segnalazione: CD3ζ umano.
  2. Generazione di celle CAR-T
    1. Isolamento: Isolare cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) da mantelli buffy sani di donatore utilizzando centrifugazione14 con gradiente di densità di Ficoll-Paque.
    2. Attivazione: Attivare PBMC umani con anticorpi anti-CD3/CD28 a piastra per 48 ore in substrati a cellule T integrati con 10 ng/mL di IL-7 e 5 ng/mL di IL-15. Preparare il substrato a cellule T mescolando volumi uguali (250 mL ciascuno) di RPMI 1640 e Click's Media, e integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS), 1x GlutaMAX e 1% di penicillina-streptomicina (Pen/Streptocococcico).
    3. Trasduzione: Trasduci le cellule T attivate con sovrantantante retrovirale utilizzando una piastra rivestita di retronectina come descrittoin precedenza, 15.
    4. Espansione: Prelevare e coltivare le cellule T 3 giorni dopo la trasduzione in un mezzo completo umano contenente IL-7 e IL-15 per ulteriori 7-9 giorni prima della caratterizzazione e dei test funzionali.
  3. Caratterizzazione delle cellule CAR-T
    1. Espressione CAR: Valutare l'espressione CAR 5-7 giorni dopo la trasduzione tramite citometria di flusso utilizzando una proteina ricombinante B7-H3-Fc, seguita da un anticorpo secondario marcato fluorescente contro Fc14 umano. L'efficienza tipica di trasduzione (celle CAR+) varia dall'80% al 90%.
    2. Fenotipo: Caratterizzare i sottoinsiemi delle cellule T (ad esempio, CD4+, CD8+, ecc.) tramite citometria di flusso utilizzando anticorpi contro CD3, CD4, CD8, CD45RA, CCR7, ecc.14.
    3. Validazione funzionale (pre-co-coltura opzionale): Prima degli esperimenti di co-coltura, si convalidano funzionalmente le cellule CAR-T co-colcoltendo con linee cellulari bersaglio B7-H3-positive e B7-H3-negative e misurando il rilascio di citochine (ad esempio, IFN-γ tramite ELISA) o citotossicità (ad esempio, usando la citometria a flusso15).
  4. Preparazione per la co-cultura (Assay PDTO)
    1. Utilizzare le cellule CAR-T per la co-coltura durante la loro espansione log-phase (tipicamente tra i giorni 10-14 dopo l'attivazione). Prima dell'uso, lavare le cellule due volte con HBSS per rimuovere IL-7/IL-15 e risospenderle nel mezzo di cocoltura descritto nel passo 4.1.
    2. Conferma la vitalità al >95% usando la colorazione con Trypan Blue.
    3. Punti di controllo visivi: Controlla la presenza di piccoli gruppi sferici (50-100 μm) ai giorni 3-5 e sferoidi maturi (100-200 μm) ai giorni 10-14.

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Risultati

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Gli organoidi del cancro colorettale sono stati ricavati con successo da campioni di biopsia endoscopica (Figura 1), con l'identità tumorale confermata da diagnosi patologica (Figura 2). I frammenti tumorali coltivati nel BMM hanno iniziato a formare strutture 3D entro 24 ore. Gli organoidi di prima generazione (P0) sono stati spostati tra i giorni 7 e 14. Gli organoidi presentavano morfologie diverse, tra cui strutture sferiche...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo articolo presenta un metodo per valutare l'effetto citotossico delle cellule CAR-T sulle PDTO, combinando imaging in campo chiaro e colorazione fluorescente per valutare la vitalità organoide. Questo approccio duale consente una visualizzazione robusta della morte cellulare tumorale in un sistema modello 3D e fornisce una valutazione semi-quantitativa della citotossicità CAR-T.

Un componente fondamentale di questo protocollo è il mezzo di coltura. Poich...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program della Cina (2022YFC2304400, 2022YFC2304401), dal Progetto Scienza e Tecnologia del Sistema Medico e Sanitario Nanshan (NSZD2024046, NS2024105) e dal Shenzhen Medical Research Fund (D2401023).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tubo da 15 mLSAINING3030100
Piastra a 24 pozziCORNING3524
Tubo da 50 mLSAINING3030000
Piastra a 96 pozziCORNING3599
DMEM/F12 avanzatoGibcoC11330500BT
Inibitore Alk 4/5/7MCEHY-10432 
B27Gibco17504044
Armadio di biosicurezza (Classe II)Thermo FisherN/A
Albumina Sirica BovinaSigma AldrichA9056
Piatto per colture cellulariBIOFILTCD010060
CentrifugaEppendorf5810R
Il Medium di ClickFUJI FILM9195
Incubatore CO2YamataIP610
Collagenasi IISolarbioC8150
Collagenasi IVSigma AldrichC9407
Microscopio laser confocaleZeissLSM900
Mezzo crioconservativoZENOAQCELLBANKERTM2
Buffer di digestioneReagenti preparati internamenteN/AComposizione fornita nel manoscritto
Digital ShakerMIULABHS-25
Dispasi tipo IISigma-aldrichD4693
DMEMGibcoC11995500BT
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28Thermo Fisher11131D
EGFPeproTechAF-100-15-500UG
Siero bovino fetaleGibco1631389
GastrinGlpBioGA20228
Gentamicina/amphoteritina BGibcoR0151
GlutamaxGibco35050061
Soluzione salina bilanciata di HanksGibcoC14175500BT
HEPESGibco15630080
Hoechst 33342 BeyotimeC1027
HialuronidasiSolarbioH8030
IL-15Peprotech200-15-10UG
IL-2NovoproteinaCK24-10
IL-7Peprotech200-07-10UG
ImageJNIH (open source)https://imagej.nih.gov/ij/
Inverted  Microscopio fluorescenteMshotMF52-N
MatrigelCorning356231
N2Gibco17502048
n-AcetilcisteinaSigma AldrichA7250-5G
NiacinamideSigma AldrichN0636-100G
NogginPeproTech120-10C-20
NormocinaInvivoGenANT-NR-1
Mezzo di coltura organoideReagenti preparati internamenteN/AComposizione fornita nel manoscritto
Inibitore P38MCEHY-10295 
Penicillina-StreptomiaGibco15140122
Prostaglandina E2MCEHY-101952 
Inibitore della chinasi associata alla Rho  Cellule staminali72304
RPMI 1640HyCloneSH30809.01B
R-spondin 1PeproTech120-38-20UG
Riempitivi per pipette S1Thermo Scientific9501
Pipetta sierologicaBIOFILGSP-010-050
Micropipetta a canale singoloEppendorf3123000063
Micropipetta a canale singoloEppendorf3123000055
Micropipetta a canale singoloEppendorf3123000098
Micropipetta a canale singoloEppendorf3123000022
Bisturi sterili e usa e gettaTech-SSSD10
SYTOX GreenBeyotimeC1181S
TexMACS MediumMiltenyi Biotec130-097-196
Serbatoio dell'acqua del termostatoBluepardBWS-10
Trippan BluePhygenePH0519
TrypLE ExpressGibco12605028
β-mercaptoetanoloGibco21985023

Riferimenti

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