Articolo metodologico

Un quadro genomico stratificato per la previsione del sierotipo di Salmonella : valutazione di MLST, SeqSero, SeqSero2, SeqSero2S e SISTR nel Sud-Ovest della Cina

DOI:

10.3791/69117

⸱

9 gennaio 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1West China School of Public Health and West China Fourth Hospital, Sichuan University, 2College of Pharmacy, Youjiang Medical University for Nationalities, 3Chengdu Center for Disease Control and Prevention (Chengdu Institute of Health Supervision), 4Sichuan Provincial Centre for Disease Control and Prevention, 5Department of Laboratory Medicine and Port Epidemic Disease Monitoring Key Laboratory of Sichuan Province, Sichuan International Travel and Healthcare Center (Chengdu Customs District Port Clinic), 6Health Promotion and Food Nutrition & Safety Key Laboratory of Sichuan Province, 7Innovation Center of Nursing Research and Nursing Key Laboratory of Sichuan Province, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo stabilisce un flusso di lavoro genomico stratificato per la previsione dei sierotipi da Salmonella , utilizzando MLST o SeqSero2S per la sorveglianza di routine, SISTR con nucleo genomico MLST per il rilevamento di focolai e SeqSero2S per lo screening rapido. Il protocollo è stato validato tramite un'analisi multicentrica per migliorare la sorveglianza in Cina.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Una siotipizzazione accurata della Salmonella è essenziale per una sorveglianza efficace e un'indagine sugli epidemii, poiché la diversità sierotipica impatta direttamente sulla patogenicità e sulla valutazione dei rischi per la salute pubblica. Tuttavia, i metodi convenzionali di agglutinazione con vetrine sono limitati da scarsa riproducibilità, intensità di lavoro e costi elevati, che ne ostacolano l'applicazione in programmi di monitoraggio ad alta produttività. Per affrontare queste limitazioni, abbiamo sviluppato e validato un flusso di lavoro genomico che integra il Multilocus Sequence Typing (MLST), il Salmonella In Silico Typing Resource (SISTR), SeqSero, SeqSero2 e SeqSero2S per la predizione dei sierotipi utilizzando dati di sequenziamento dell'intero genoma. Questo protocollo è stato valutato tramite un'analisi multicentrica di 315 isolati di Salmonella raccolti da fonti alimentari e umane nel sud-ovest della Cina. I risultati di questo studio hanno dimostrato una concordanza significativamente più alta tra gli approcci genomici (fino al 100%/99,1%/90,1% nel set di addestramento e 100%/97,1%/93,1% nel set di validazione per SISTR/MLST/SeqSero2S, rispettivamente) rispetto alla sierotipizzazione tradizionale. Il flusso di lavoro include raccomandazioni per la selezione di metodi di previsione appropriati basati sul contesto di sorveglianza, enfatizzando MLST e SeqSero2S per il monitoraggio di routine, SeqSero2S per lo screening rapido e SISTR con nucleo del genoma MLST per le indagini sugli epidemii. Questo approccio facilita l'integrazione della sierotipizzazione genomica nella pratica della sanità pubblica, riducendo la dipendenza dalla sierologia tradizionale e migliorando la riproducibilità e la scalabilità nei programmi di monitoraggio della Salmonella .

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La salmonella è tra i patogeni alimentari più significativi a livello globale, causando una morbilità e mortalitàsostanziali 1,2. In Cina, rimane una delle principali cause di malattie alimentari, con un numero limitato di sierotipi che rappresenta la maggior parte delleinfezioni 3. Un'identificazione accurata dei sierotipi è cruciale per la sorveglianza e le indagini sugli epidemii, poiché la diversità sierotipica è strettamente correlata con patogenicità e rischi per la salute pubblica. Questo è ben riconosciuto nei sierotipi comuni come Salmonella enteritidis e Salmonella typhimurium, ma alcuni sierotipi meno studiati, come Salmonella Panama, sono anch'essi una causa significativa di diffusione globale e di malattieinvasive 4, evidenziando la necessità generale di robuste capacità di sierotipazione. I metodi tradizionali di sierotipaggio, da tempo riconosciuti come il gold standard, sono un processo che richiede tempo e costi elevati che richiede oltre 150antisieri. Sono inoltre vincolati da scarsa riproducibilità6, flussi di lavorolaboriosi 7 e variabilità intrinseca dovuta all'interpretazione soggettiva delle reazionidi agglutinazione 8, rendendole quindi inadeguate per programmi di monitoraggio ad altorendimento 9.

L'avvento del sequenziamento dell'intero genoma (WGS) ha trasformato la caratterizzazione dei patogeni consentendo una rapida e ad alta risoluzione di predittione deisierotipi 10,11,12. Sono stati sviluppati diversi strumenti in silico, tra cui Multilocus Sequence Typing (MLST), SeqSero13, SeqSero214, SeqSero2S15 e la Salmonella In Silico Typing Resource (SISTR)7,15. Mentre MLST offre un monitoraggio epidemiologico standardizzatoe a lungo termine 16, SeqSero2 e SeqSero2S permettono analisi dirette da letture grezze e facilitano uno screening ad alto rendimento dei sierotipicomuni 14,15. Al contrario, SISTR richiede genomi assemblati ma integra la rilevazione dei geni antigenici con la tipizzazione multilocus genomica core (cgMLST), fornendo una risoluzione completa per le indagini sugliepidemii 17. Sebbene la caratterizzazione di Salmonella basata su WGS sia sempre più adottata come evidenza primaria nella ricerca 16,18,19, la sua applicazione nella sorveglianza su larga scala rimane limitata, una lacuna in parte attribuita a considerazioni pratiche non affrontate che influenzano l'idoneità del metodo. Un sondaggio globale ha rivelato che solo l'8% dei laboratori partecipanti utilizza WGS per la sorveglianza di routine, con la complessità analitica che rappresenta un ostacoloprincipale 20. Ad esempio, una previsione sierotipica affidabile si basa su una profondità di sequenziamento adeguata (tipicamente >75× per la costo-efficacia, idealmente ~200× per un'analisi di alta qualità) e assemblaggi genomici di alta qualità (N50 di contigi > 30 kbp come minimo conveniente, preferibilmente >100 kbp), in particolare per strumenti dipendenti dall'assemblaggio comeSISTR 21,22,23 . Inoltre, la selezione degli strumenti deve essere in linea con le risorse computazionali e le competenze del laboratorio: strumenti open source come SeqSero2S offrono alternative più rapide per uno screening rapido analizzando le letture grezze e bypassando l'assemblaggio15, che richiede un consumo computazionale intensivo, mentre i laboratori con capacità bioinformatica limitate potrebbero avere difficoltà nell'analisi e nell'archiviazione dei dati. Di conseguenza, esistono dati insufficienti per determinare se i test sierologici possano essere ridotti nella sorveglianza su largascala 20,24, evidenziando così la necessità di approcci adattivi alle risorse. In particolare, dopo la pandemia di COVID-19, c'è una notevole quantità di strumenti di sequenziamento inattivo e qPCR a vari livelli di istituzioni sanitarie, offrendo un'opportunità per riutilizzare questa capacità per la sorveglianza genomica.

Per colmare questa lacuna, abbiamo condotto una valutazione multicentrica degli strumenti di sierotipazione genomica sopra menzionati utilizzando 315 isolati di Salmonella raccolti da fonti alimentari e umane nel Sud-Ovestdella Cina 25,26. Sulla base di questi risultati, abbiamo sviluppato un flusso di lavoro stratificato che tiene conto delle diverse risorse di laboratorio e delle esigenze di sorveglianza, fornendo criteri chiari per la selezione degli strumenti in diversi contesti. Questo quadro dà priorità a SeqSero2S per lo screening rapido e a SISTR combinato con cgMLST per le indagini sugli epidemii, facilitando così l'adozione di approcci genomici e riducendo la dipendenza dai metodi tradizionali di sierotipizzazione. Qui descriviamo in dettaglio ogni fase del flusso di lavoro, inclusa l'identificazione degli isolati, il sequenziamento, l'analisi dei dati e i criteri per la selezione degli strumenti di previsione in diversi contesti di sorveglianza.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La raccolta e la gestione dei campioni fecali umani sono state condotte con l'approvazione del Comitato Etico del Quarto Ospedale della Cina Occidentale, Università del Sichuan (Numero di protocollo: HXSY-EC-2022093), in conformità con la Dichiarazione di Helsinki e le Buone Pratiche Cliniche. Il consenso informato è stato rinunciato in conformità con le normative nazionali di sanità pubblica.

NOTA: Tutte le procedure che coinvolgono colture vive di Salmonella e campioni di feci umane devono essere condotte in un laboratorio di Biosicurezza di Livello 2 (BSL-2) da personale formato nelle pratiche microbiologiche standard e nelle procedure di biosicurezza. Indossa sempre l'attrezzatura di protezione individuale (DPI) appropriata, inclusi camice da laboratorio, guanti e occhiali di sicurezza. Disinfetta e cambia regolarmente i guanti contaminati. Decontamina tutte le superfici di lavoro prima e dopo gli esperimenti con un disinfettante appropriato (ad esempio, etanolo al 70%, ipoclorito di sodio all'1%). Decontaminare tutti i rifiuti liquidi e solidi contenenti materiali biologici tramite autoclavaggio (ad esempio, a 121 °C per almeno 30 minuti) prima dello smaltimento. Evita la formazione di aerosol e schizzi. Esegui tutte le procedure che possono generare aerosol (ad esempio, centrifugazione, scuotimento vigoroso) all'interno di un armadietto di sicurezza biologica certificato.

1. Raccolta di campioni alimentari e identificazione dei ceppi

  1. Raccogli campioni di cibo dai mercati al dettaglio o dagli impianti di lavorazione. Isolare la Salmonella dai campioni alimentari secondo lo standard nazionale di sicurezza alimentare GB 4789.4 e i protocolli di riservatezza del Foodborne Disease Surveillance Program.
  2. Pre-arricchimento:
    1. Pesa esattamente 25 g di ogni campione di cibo. Aggiungere 225 mL di Acqua Peptonica Tampata (BPW) al campione (rapporto di diluizione 1:10) e un vortice per 30 secondi per garantire la completa omogeneizzazione e immersione.
    2. Incubare il campione in BPW a 36°C ± 1°C per 8-18 ore in un incubatore a scuotimento impostato a 150 giri/min.
      NOTA: Il pre-arricchimento in brodo non selettivo aumenta significativamente il carico patogeno. Maneggia tutti i materiali successivi (contenitori, pipette, ecc.) come altamente contagiosi.
  3. Arricchimento selettivo: Dopo il pre-arricchimento, trasferire 1 mL del campione al Brodo Tetrationato (TTB). Incubare il TTB a 42 °C per 18-24 ore senza scuotere.
  4. Isolamento: Dopo l'incubazione, si estende la coltura arricchita sulle seguenti piastre agar selettive: agar Hektoen Enteric (HE), Xylose Lysine Deoxycolate (XLD) agar e CHROMagar Salmonella. Incubare le placche a 36 °C per 18-24 ore.
    NOTA: Quando si fanno striature di piastre, fai attenzione a evitare la formazione di aerosol e contaminazioni incrociate. Sull'agar HE, le presunte colonie di Salmonella appaiono tipicamente di colore blu-verde a blu, con o senza centri neri. L'agar circostante può assumere una tonalità verdastra simile. Sull'agar XLD, le presunte colonie di Salmonella sono tipicamente rosse con centri neri. Su CHROMagar, le colonie presuntive di Salmonella sono caratterizzate dal colore da magenta a malva, come specificato dal produttore. Su ciascuna lastra selettiva, si aspettano colonie ben isolate dopo 18-24 ore di incubazione. Le piastre troppo cresciute (>300 colonie) possono richiedere diluizione e ri-striatura.
  5. Identificazione: Esaminare le lastre per presunte colonie di Salmonella . Identificare i ceppi sospetti utilizzando un sistema di identificazione automatico con una carta di identificazione Gram-negativo (GN), seguendo le istruzioni del produttore per l'analisi.
    NOTA: Assicurarsi che i numeri di lotto delle carte GN siano validi e rientrino nella data di scadenza.
    1. Prepara una sospensione batterica da una colonia pura alla torbidità specificata (0,50-0,63 secondo lo standard McFarland) utilizzando soluzione salina allo 0,45%.
    2. Carica la sospensione nella scheda GN e fai il test. Assicurati che il sistema sia impostato per incubare automaticamente la scheda a 35,0 °C ± 2,0 °C e monitorare le reazioni biochimiche per un massimo di 8 ore.
    3. Accetta un risultato di Salmonella enterica ssp. enterica con una probabilità ≥ del 95% e un alto indice di fiducia.
  6. Serotipazione: Prendere singole colonie dalla piastra di agar dello sciame dopo un'incubazione notturna a 37 °C. Eseguire test di agglutinazione con vetri per rilevare gli antigeni O e gli antigeni H. Utilizzare kit antisiero per la salmonella disponibili in commercio (vedi Tabella dei materiali) per i test.

2. Raccolta di campioni umani e identificazione del ceppo

NOTA: Per l'isolamento di Salmonella da campioni fecali umani, si segue i protocolli di riservatezza del Foodborne Disease Surveillance Program.

  1. Raccolta: Raccogliere circa 2 g di campioni fecali umani appena espulsi. Posiziona i campioni fecali in contenitori puliti, asciutti e a bocca larga. Trasportare i campioni fecali al laboratorio entro 1 ora utilizzando scatole di trasporto isolate per mantenere l'integrità del campione.
    ATTENZIONE: I campioni fecali umani possono contenere diversi patogeni oltre alla Salmonella. Maneggiare tutti i campioni come potenzialmente infettivi e rispettare le precauzioni standard per la gestione di materiali a rischio biologico.
  2. Inoculazione: Inoculare i campioni fecali raccolti direttamente sulle seguenti placche agar selettive: CHROMagar Salmonella, agar Salmonella-XLD e agar Shigella (SS).
    NOTA: Fare riferimento al passo 1.4 per la morfologia caratteristica della colonia su CHROMagar Salmonella e XLD agar. Sull'agar SS, le presunte colonie di Salmonella appaiono tipicamente incolori, opachi o color beige con centri neri. L'agar stesso rimane relativamente invariato.
  3. Identificazione: Identificare le sospette colonie di Salmonella come descritto nel passaggio 1.5.
  4. Serotipazione: eseguire la siotipazione tramite agglutinazione con vetri come descritto nel passo 1.6.

3. Preparazione della libreria e sequenziamento dell'intero genoma

  1. Coltura batterica: striscia Salmonella su lagar LB, incubare a 37 °C per 12 ore. Scegli una colonia, inocula in brodo da 200 mL LB e agita a 150 giri/min (37 °C, 12 ore). Centrifuga a 12.000 × g per 10 minuti per prelevare le cellule.
    NOTA: Eseguire tutti i passaggi di centrifugazione con rotori sigillati o coppe di sicurezza per prevenire la generazione di aerosol.
  2. Estrazione del DNA: Estrarre il DNA genomico utilizzando un kit di estrazione del DNA commerciale (vedi Tabella dei Materiali), seguendo il protocollo del produttore.
    ATTENZIONE: I reagenti nei kit di estrazione del DNA commerciali (ad esempio, tamponi di lisi, proteinasi K) possono essere dannosi se inalati o al contatto con pelle e occhi. Effettuare l'estrazione in una cappa o in un armadietto di sicurezza biologica se si usano reagenti volatili e indossare i DPI appropriati.
  3. Valutazione della qualità del DNA: Purificare il DNA genomico e quantificare utilizzando un fluorometro con il dsDNA High-Sensitivity Assay Kit. Verificare l'integrità del DNA tramite elettroforesi su un gel di agarosio all'1% a 100 V per 45 minuti; DNA di alta qualità appare come una singola banda compatta >20 kbp con una sfumaturaminima di 27.
    NOTA: (Passo critico) Il DNA genomico di alta qualità e alto peso molecolare (con un rapporto A260/A280 di ~1,8-2,0) è cruciale per la preparazione e il sequenziamento delle librerie di successo.
    ATTENZIONE: I coloranti per la colorazione degli acidi nucleici usati nell'elettroforesi del gel di agarosio (ad esempio, GelRed, Bromuro di Etidio) sono mutagenici. Indossa sempre i guanti quando maneggi gel e soluzioni per le macchie e smaltili secondo le normative istituzionali sui rifiuti pericolosi.
  4. Frammentazione del DNA: Frammentare circa 150 ng di DNA genomico qualificato a una dimensione media di ~350 bp utilizzando un sistema a ultrasultrasonicazione focalizzata secondo il protocollo del produttore.
  5. Costruire la libreria di sequenziamento dai frammenti di DNA tagliati utilizzando un kit commerciale di preparazione della biblioteca (vedi Tabella dei materiali). Eseguire la riparazione terminale e la fosforilazione 5'' dei frammenti di DNA tagliati. Poi, aggiungi una singola base 'A' alle estremità da 3' e lega gli adattatori di sequenziamento indicizzati.
  6. Amplificare e arricchire i frammenti di DNA legati tramite un programma PCR a ciclo limitato come specificato nel kit.
  7. Qualifica e quantifica la libreria finale utilizzando metodi come fluorometria ed elettroforesi capillare.
  8. Eseguire sequenziamento a estremità a coppie (2 × 150 bp) su una piattaforma di sequenziamento seguendo le procedure operative standard.

4. Analisi dei dati

  1. Controllo qualità dei dati grezzi di sequenziamento: eseguire il controllo qualità iniziale sui file grezzi FASTQ utilizzando fastp (versione 0.23.0) con parametri predefiniti. L'obiettivo è rimuovere sequenze di adattatori e letture di bassa qualità, generando così dati FASTQ puliti per l'analisi a valle.
  2. Assembla le letture filtrate di alta qualità in genomi di bozza usando SPAdes (versione 3.15.0) con l'opzione attenta per ridurre discorrispondenze e indelcorti 26.
  3. Utilizzare le sequenze genomiche (file FASTQ / FASTA) come input per le varie previsioni dei sierotipi.
    1. Per MLST, importa il file FASTQ nel software BioNumerics (versione 7.6).
      1. Nella finestra Importa Template , clicca su Modifica analisi analizzante sotto opzioni avanzate. Imposta la stringa di analisi dati e la decorazione dati su [DATA]. Applicare le espressioni regolari DATA]_* e [DATA] per l'analisi dei nomi dei file. Salva il modello, selezionalo e clicca su Avanti e poi Termina. Conferma l'invio nella finestra Invia Compito per caricare i dati. Lo strumento CEStoreUploader si aprirà automaticamente per trasferire i dati grezzi WGS al motore di calcolo.
      2. Seleziona la voce del genoma dopo il caricamento. Naviga su Strumenti WGS e seleziona "TraNetGenotype" per una previsione automatica degli ST. Nella finestra di dialogo TraNetGenotype , seleziona Salmonella come tipo di ceppo, seleziona Analisi del sierotipo, Analisi della virulenza e Analisi della suscettibilità antimicrobica, e clicca su Sì.
    2. Per SISTR (versione 1.1.3; https://github.com/phac-nml/sistr_cmd; Parametri: tutti i parametri sono di default), apri un terminale e naviga nella directory contenente il file genoma assemblato assembly.fasta.
      1. Esegui il seguente comando per eseguire la previsione del serovar e generare un rapporto completo in formato CSV: sistr --qc --alleles-output allele-results.json --cgmlst-profiles cgmlst-profiles.csv -f tab -o sistr-output.tab -i assembly.fasta. Questo comando genera un report contenente il serovar previsto.
        NOTA: -qc: Esegue controlli di qualità sull'assemblaggio. -i assembly.fasta: Specifica il file FASTA in ingresso. -f csv: Definisce il formato di output come CSV. -o sistr_results: Imposta il nome base per il file di output (ad esempio, sistr_results.csv). -p 4: Utilizza 4 thread CPU per l'analisi e velocizzare il calcolo. --alleli-output: salva sequenze alleli e informazioni in un file JSON. --cgmlst-profiles: esporta i profili alleli cgMLST in un file CSV.
    3. Per SeqSero (versione 1.0; https://github.com/denglab/SeqSero; Parametri: tutti i parametri sono predefiniti), naviga nella cartella contenente il file dati di input. Esegui il seguente comando con parametri predefiniti per l'analisi: python SeqSero.py -m 4 -i assembly.fasta. Lo strumento crea una cartella di output contenente il file Seqsero_result.txt con il sierotipo previsto.
      NOTA: -m 4 specifica il tipo di input come assemblaggio genomico. -i definisce il file FASTA di input.
    4. Per SeqSero2 (versione 1.3.1; https://github.com/denglab/SeqSero2; Parametri: tutti i parametri sono predefiniti). Esegui il seguente comando: python3 SeqSero2_package.py -m k -t 4 -i assembly.fasta. Lo strumento invia il sierotipo previsto direttamente allo schermo terminale al completamento. L'output fornisce il sierotipo previsto.
      NOTA: -m k: specifica un flusso di lavoro basato su k-mer per la rapida previsione dei sierotipi utilizzando k-mer unici dei determinanti del sierotipo. -t 4: indica il tipo di input come sequenze assemblate.
    5. Per SeqSero2S (versione 1.1.1; https://github.com/denglab/SeqSero2S; Parametri: tutti i parametri sono predefiniti): Eseguilo usando lo script fornito: python SeqSero2S.py -m k -t 4 -i assembly.fasta. L'output fornisce il sierotipo previsto.
      NOTA: -m k consente l'analisi basata su k-mer di letture grezze o assemblaggi genomici. -t 4 specifica l'ingresso della sequenza assemblata.

5. Parametri critici e considerazioni pratiche

NOTA: Le seguenti considerazioni sono fondamentali per l'implementazione efficace di questo flusso di lavoro genomico, specialmente in contesti con risorse limitate.

  1. Verifica che i dati grezzi di sequenziamento raggiungano una profondità di copertura sufficiente. Una profondità di sequenziamento di circa 100x è tipicamente sufficiente per un'analisi di alta qualità.
    NOTA: Per i laboratori che danno priorità all'efficacia in termini di costi, è raccomandata una profondità minima di sequenziamento di 75x come soglia pratica inferiore per una previsione sierotipica affidabile utilizzando MLST o SeqSero221.
  2. Conferma che la qualità delle letture grezze sia alta, con un punteggio Q30 (accuratezza base delle chiamate del 99,9%) tipicamente superiore al 90%.
  3. Valuta la qualità dell'assemblaggio del genoma de novo prima di procedere con strumenti di previsione dei sierotipi che richiedono contigi assemblati. Usa la statistica N50 come metrica chiave.
    NOTA: Un N50 di almeno 100 kbp èraccomandato 22, mentre un N50 superiore a 30 kbp dovrebbe essere considerato il requisito minimo per un'analisiaffidabile 23.
  4. Controlla la completezza dell'assemblaggio assicurando una velocità di mappatura di lettura di almeno il ≥98% quando le letture filtrate vengono mappate di nuovo al genoma assemblato.

6. Protocollo raccomandato di previsione del sierotipo per la sorveglianza ad alto rendimento della salmonella

NOTA: Selezionare i metodi di previsione dei sierotipi in base al contesto di sorveglianza, all'accuratezza richiesta e alle risorse di laboratorio disponibili. Per una sorveglianza ad alta produttività della Salmonella , segui il protocollo qui sotto:

  1. Identificazione preliminare: Effettuare lo screening iniziale in conformità con il GB 4789.4 per confermare che gli isolati sono specie di Salmonella .
    NOTA: A questo stadio, non è necessario identificare il sierotipo specifico degli isolati.
  2. Sorveglianza di routine (modalità ad alta produttività): Per la sorveglianza di routine, poiché BioNumerics non è più aggiornato, si utilizzano MLST28 open source, SeqSero2S o altre piattaforme di analisi genomica validate e user-friendly che ricevono supporto tecnico e aggiornamenti continui.
    NOTA: Per MLST: Lo schema a 7 geni offre un profilo standardizzato, portatile e filogeneticamente informativo (Sequence Type, ST) ideale per epidemiologia a lungo termine e confronto globale di ceppi. La sua semplicità garantisce un'analisi rapida e un carico computazionale minimo. Per SeqSero2S: offre il doppio vantaggio di una rapida previsione dei sierotipi e risultati integrati MLST in un'unica corsa. Può analizzare direttamente le letture di sequenziamento grezzo, bypassando l'assemblaggio del genoma per risparmiare tempo e risorse. Anche con dati FASTA assemblati, è più veloce di strumenti come SISTR, poiché esegue la previsione dei sierotipi in modo indipendente senza fare affidamento sull'analisi computazionale.
  3. Screening rapido (contesti sensibili al tempo): Per risultati rapidi o in laboratori con capacità computazionale limitata, utilizzare SeqSero2S per la predizione preliminare del sierotipo.
    NOTA: Quando si effettuano le previsioni di SeqSero2S, si consiglia fondamentalmente di interpretare "I_4,[5],12:i:-" come Salmonella Typhimurium.
  4. Indagine dell'epidemia (modalità ad alta precisione): Per il tracciamento dell'epidemia che richiede alta risoluzione, si utilizza SISTR, che utilizza cgMLST per integrare la previsione del sierotipo e per fornire analisi di cluster ad alta risoluzione per il tracciamento delle sorgenti.
  5. Controllo qualità e conferma dei risultati incoerenti:
    1. Per i ceppi di sequenziamento comuni, esegui una verifica casuale. Per quelli non comuni, si utilizza un rapporto di verifica del 20%. In caso di risultati di sierotipizzazione incoerenti, si riferiranno gli isolati a un laboratorio di livello superiore o di riferimento per un risultato definitivo.
    2. Per l'analisi confermativa, utilizzare più metodi validati tra cui: analisi genomica ripetuta con almeno due diversi strumenti di previsione in silico ; ripetuta in silico con almeno due strumenti diversi; contestualizzazione filogenetica utilizzando metodi ad alta risoluzione basati su WGS (ad esempio, cgMLST o analisi SNP del genoma completo)29.
    3. Assegnare il sierotipo finale sulla base del consenso di queste prove complete.
      NOTA: Il rapporto di verifica raccomandato del 20% per i sierotipi non comuni si basa sull'osservazione che gli strumenti genomici mantengono un'alta concordanza (93,3% per SISTR vs. MLST, 95,0% per SISTR vs. SeqSero2S) anche tra i sierotipi non comuni (Tabella 1). Questa soglia è conveniente e offre un margine di sicurezza sufficiente per rilevare la bassa frequenza di discrepanze tra gli strumenti genomici nella sorveglianza di routine.

7. Analisi statistica

  1. Eseguire analisi dati utilizzando il software R (versione 4.1.2).
  2. Presenta le variabili categoriche come frequenze con percentuali.
  3. Confrontando i gruppi che utilizzano i test χ2 per dati categorici30, considera un valore P <0,05 come statisticamente significativo.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo è stato convalidato utilizzando 315 isolati di Salmonella provenienti dal sud-ovest della Cina, con 213 isolati (2/3) che hanno servito come set di addestramento per confrontare cinque metodi di predizione dei sierotipi basati su WGS (MLST, SISTR, SeqSero, SeqSero2 e SeqSero2S) con i risultati convenzionali di sierotipazione, mentre i restanti 102 isolati (1/3) sono stati utilizzati come set di validazione per valutare le prestazioni di MLST, SISTR e SeqSero2S.

...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questa valutazione su larga scala, che comprende 315 isolati di Salmonella provenienti dal Sud-Ovest della Cina, dimostra la superiore riproducibilità dei metodi di sierotipazione basati su WGS rispetto agli approcci convenzionali (84,1% contro 62,9% di copertura, P<0,001). I nostri risultati convalidano un flusso di lavoro genomico completo in cui i passaggi iniziali critici della preparazione del campione e del controllo della qualità del DNA (sezioni 1-3) influenzano direttam...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Tibet and Sichuan Science and Technology Bureau Funding (XZ202301ZY0049G, 2024NSFSC0563 a H.Z. e 2024NSFSC0033 a X.P.), dal Programma di Scienza e Tecnologia del Sichuan (2024JDRC0032 a Y.X.), dal Progetto di Nuova Produttività dell'Istituto di Salute (da HN240302C a H.Z.), dal Progetto di Rivitalizzazione della Disciplina di Scienze di Laboratorio di Sanità Pubblica (2023SY-04 a H.Z.), Scuola di Sanità Pubblica della Cina Occidentale/Quarto Ospedale della Cina Occidentale, Università del Sichuan.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
BioNumerics (versione 7.6)Matematica applicatahttps://bionumerics.software.informer.com/7.6/MLST/predittione dei sierotipi/analisi filogenica
CHROMagar SalmonellaBecton, Dickinson and Company214983Mezzo cromogenico selettivo per Salmonella
Fastp (versione 0.23.0)Open-sourcehttps://github.com/OpenGene/fastpLeggi controllo qualità
Sistema di sequenziamento Illumina NovaSeq 6000Illumina20012850Piattaforma di sequenziamento dell'intero genoma
Ultrasonicatore a fuoco M220Covaris500295Taglio del DNA
Kit Fast DNA per Magbeads per il terrenoMP BiomediciMP116560200Kit di estrazione del DNA genomico
Microsoft Excel 2016MicrosoftKB5002794Gestione dei dati
Kit Rapido DNA-Seq NEXTFLEXRevvity50-255-1124Preparazione della libreria di sequenziamento
Fluorometro Qubit 2.0Thermo Fisher ScientificQ32866Quantificazione del DNA
Kit per il test ad alta sensibilità del Qubit dsDNAThermo Fisher ScientificQ32851Quantificazione del DNA
R (versione 4.1.2)Fondazione Rhttps://www.r-project.org/Calcolo statistico
Kit Antisiero contro la SalmonellaIstituto del Siero Statens60898Rilevamento dell'antigene O/H
SeqSeroOpen-sourcehttps://github.com/denglab/SeqSeroPrevisione del sierotipo
SeqSero2Open-sourcehttps://github.com/denglab/SeqSero2Previsione del sierotipo
SeqSero2SOpen-sourcehttps://github.com/denglab/SeqSero2sPrevisione del sierotipo
SISTROpen-sourcehttps://github.com/phac-nml/sistr_cmdPrevisione del sierotipo
SPAdes (versione 3.15.0)Open-sourcehttps://github.com/ablab/spadesAssemblaggio del genoma
Agar di sciameBD in Biologia211519Utilizzato per l'incubazione della sierotipizzazione
TBS-380 FluorometroTurner BioSystemsP/N 3800-003Quantificazione del DNA
Sistema compatto VITEK 2BioMé rieux95061-768Sistema automatico di identificazione microbica

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. GBD 2017 Non-Typhoidal Salmonella Invasive Disease Collaborators. The global burden of non-typhoidal Salmonella invasive disease: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet Infect Dis. 19 (12), 1312-1324 (2019).
  2. Selim, S. A. A comprehensive review of antibiotic susceptibility patterns in strains isolated from food. J Pure Appl Microbio. 19 (2), 818-833 (2025).
  3. Shen, Y., et al. Genomic investigation of Salmonella enterica serovar Welikade from a pediatric diarrhea case first time in Shanghai, China. BMC Genomics. 25 (1), 604(2024).
  4. Pulford, C. V., et al. Global diversity and evolution of Salmonella enterica serovar Panama: a genomic epidemiology study. Lancet Microbe. 6 (9), 101150(2025).
  5. Hong, H., et al. Genetic characterization and in silico serotyping of 62 Salmonella enterica isolated from Korean poultry operations. BMC Genomics. 26 (1), 166(2025).
  6. Kitchens, S. R., Wang, C., Price, S. B. Bridging classical methodologies in Salmonella investigation with modern technologies: a comprehensive review. Microorganisms. 12 (11), 2249(2024).
  7. Uelze, L., et al. Performance and accuracy of four open-source tools for in silico serotyping of Salmonella spp. based on whole-genome short-read sequencing data. Appl Environ Microbiol. 86 (5), e02265-e02319 (2020).
  8. Wang, B. X., et al. High-throughput fitness experiments reveal specific vulnerabilities of human-adapted Salmonella during stress and infection. Nat Genet. 56 (6), 1288-1299 (2024).
  9. Kumar, S., Kumar, Y., Kumar, G., Kumar, G., Kasana, D. A highly drug-resistant Salmonella enterica serovar Weltevreden of human origin from India and detection of its virulence factors. Indian J Microbiol. 65 (3), 1384-1394 (2025).
  10. Lu, Y., et al. Advances in whole genome sequencing: methods, tools, and applications in population genomics. Int J Mol Sci. 26 (1), 372(2025).
  11. Mukherjee, S., et al. Increasing frequencies of antibiotic resistant non-typhoidal Salmonella infections in Michigan and risk factors for disease. Front Med (Lausanne). 6, 250(2019).
  12. Yachison, C. A., et al. The validation and implications of using whole genome sequencing as a replacement for traditional serotyping for a national Salmonella reference laboratory. Front Microbiol. 8, 1044(2017).
  13. Zhang, S., et al. Salmonella serotype determination utilizing high-throughput genome sequencing data. J Clin Microbiol. 53 (5), 1685-1692 (2015).
  14. Zhang, S., et al. SeqSero2: rapid and improved Salmonella serotype determination using whole-genome sequencing data. Appl Environ Microbiol. 85 (23), e01746-e01819 (2019).
  15. Deng, X., et al. Salmonella serotypes in the genomic era: simplified Salmonella serotype interpretation from DNA sequence data. Appl Environ Microbiol. 91 (3), e0260024(2025).
  16. Cui, Q., et al. Characterization and implications of the regionally prevalent ST8333 strains of Salmonella enterica serotype 4,[5],12:i: - China, 2017-2023. China CDC Wkly. 6 (47), 1232-1235 (2024).
  17. Yoshida, C. E., et al. The Salmonella In Silico Typing Resource (SISTR): an open web-accessible tool for rapidly typing and subtyping draft Salmonella genome assemblies. PLoS One. 11 (1), e0147101(2016).
  18. Ikeuchi, S., et al. Molecular epidemiological analysis of Salmonella Schwarzengrund isolated in Japan by newly developed multi-locus variable-number tandem repeat analysis method. Lwt. 207, 116593(2024).
  19. Kong, X., et al. Emergence of extensively drug-resistant Salmonella Kentucky ST198 in Southwest China. J Glob Antimicrob Resist. 43, 264-270 (2025).
  20. Davedow, T., et al. PulseNet international survey on the implementation of whole genome sequencing in low and middle-income countries for foodborne disease surveillance. Foodborne Pathog Dis. 19 (5), 332-340 (2022).
  21. Xian, Z., et al. Subtyping evaluation of Salmonella Enteritidis using single nucleotide polymorphism and core genome multilocus sequence typing with nanopore reads. Appl Environ Microbiol. 88 (15), e0078522(2022).
  22. Liu, C. C., Hsiao, W. W. L. Machine learning reveals the dynamic importance of accessory sequences for Salmonella outbreak clustering. mBio. 16 (3), e0265024(2025).
  23. Fourteenth external quality assessment for Salmonella typing. , European Centre for Disease Prevention and Control. ECDC, Stockholm. (2025).
  24. Gomes, E., et al. Advances in whole genome sequencing for foodborne pathogens: implications for clinical infectious disease surveillance and public health. Front Cell Infect Microbiol. 15, 1593219(2025).
  25. Zhou, L., et al. Antimicrobial resistance and genomic investigation of Salmonella isolated from retail foods in Guizhou, China. Front Microbiol. 15, 1345045(2024).
  26. Zuo, H., et al. Comparative genomic and antimicrobial resistance profiles of Salmonella strains isolated from pork and human sources in Sichuan, China. Front Microbiol. 16, 1515576(2025).
  27. Feehan, J. M., et al. Purification of high molecular weight genomic DNA from powdery mildew for long-read sequencing. J Vis Exp. (121), e55463(2017).
  28. Jolley, K. A., Bray, J. E., Maiden, M. C. J. Open-access bacterial population genomics: BIGSdb software, the PubMLST.org website and their applications. Wellcome Open Res. 3, 124(2018).
  29. Yang, L., et al. Phylogeny and divergence of the 100 most common Salmonella serovars available in the NCBI Pathogen Detection database. Front Microbiol. 16, 1547190(2025).
  30. Zuo, H., et al. High-altitude exposure decreases bone mineral density and its relationship with gut microbiota: results from the China multi-ethnic cohort (CMEC) study. Environ Res. 215 (Pt 2), 114206(2022).
  31. Arrieta-Gisasola, A., et al. Genotyping study of Salmonella 4,[5],12:i:- monophasic variant of serovar Typhimurium and characterization of the second-phase flagellar deletion by whole genome sequencing. Microorganisms. 8 (12), 2049(2020).
  32. De Sousa Violante, M., et al. Genomic diversity of Salmonella Typhimurium and its monophasic variant in pig and pork production in France. Microbiol Spectr. 12 (12), e0052624(2024).
  33. Kong, X., et al. Phenotypic and genotypic characterization of Salmonella Enteritidis isolated from two consecutive food-poisoning outbreaks in Sichuan, China. J Food Safety. 43 (1), e13015(2022).
  34. Hong, W., et al. Integrating serotyping, MLST, and phenotypic data: decoding the evolutionary drivers of Salmonella pathogenicity and drug resistance. Appl Environ Microbiol. 91 (10), e0151125(2025).
  35. Lin, A., et al. Targeted next-generation sequencing assay for direct detection and serotyping of Salmonella from enrichment. J Food Prot. 87 (4), 100256(2024).
  36. van den Berg, O. E., et al. Ongoing increase in autochthonous Salmonella Enteritidis infections, the Netherlands, June 2023 to June 2025. Euro Surveill. 30 (30), 2500536(2025).
  37. Li, X., Oladeinde, A., Rothrock, M. Jr, Chung, T. J., Ghazi Al Hakeem, W. Using core genome and machine learning for serovar prediction in Salmonella enterica subspecies I strains. FEMS Microbiol Lett. 372, fnaf040(2025).
  38. Krüger, G. I., et al. Adaptive signatures of emerging Salmonella serotypes in response to stressful conditions in the poultry industry. Lwt. 215, 117188(2025).
  39. Gou, J., et al. Microbial biomarkers and sex-associated gut microbiota characteristics of thyroid cancer. BMC Cancer. 25, 1688(2025).
  40. Meng, J., et al. Medical laboratory data-based models: opportunities, obstacles, and solutions. J Transl Med. 23 (1), 823(2025).
  41. Wu, X., et al. Evaluation of multiplex nanopore sequencing for Salmonella serotype prediction and antimicrobial resistance gene and virulence gene detection. Front Microbiol. 13, 1073057(2022).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Sierotipizzazione genomicaMultilocus Sequence Typingsequenziamento dell intero genomasorveglianza della salute pubblicaindagine sui focolaiMLST del core genomeconcordanza del sierotipo

Articoli correlati