Produzione efficiente di cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR) con transgeni superiori a 10 kb utilizzando vettori lentivrali

Sommario

Qui presentiamo un flusso di lavoro ottimizzato per la produzione di cellule T del Recettore dell'Antigene Chimerico (CAR) con transgeni di grandi dimensioni superiori a 10 kb utilizzando vettori lentivirali.

Abstract

L'ingegnerizzazione di più recettori nelle cellule T dei recettori chimerici dell'antigene (CAR) si è rivelata una strategia potente per prevenire la ricaduta antigene-negativa e ridurre le tossicità on-target e off-tumoral. Tuttavia, la produzione di cellule CAR CAR multi-recettore rimane una sfida, poiché aumentare le dimensioni dei transgeni lentivirali riduce significativamente i titoli virali e i tassi di trasduzione delle cellule T. I flussi di lavoro di produzione attuali spesso si basano sull'ordinamento delle celle per arricchire le cellule T trasdotte da produzioni a basso rendimento. Tuttavia, le tecniche di ordinamento delle celle non aumentano il numero assoluto di celle T CAR e aggiungono ulteriore complessità al già elaborato processo di produzione. Di conseguenza, queste limitazioni ostacolano la traduzione clinica delle cellule CAR T multi-recettore e limitano lo sviluppo di immunoterapie di nuova generazione.

Qui presentiamo un flusso di lavoro di produzione dettagliato e passo dopo passo, ottimizzato per generare cellule CAR T con grandi transgeni lentivirali. Utilizzando questo flusso di lavoro, dimostriamo aumenti dipendenti dalla dimensione dell'efficienza della trasduzione su una gamma di dimensioni di transgene, con il miglioramento più marcato fino a 14,8 volte osservato per un vettore lentivirale da 10,1 kb. È importante sottolineare che il flusso di lavoro supporta un'espansione robusta delle cellule T ed elimina la necessità di ordinamento delle celle. Superando le limitazioni di dimensioni attuali nel trasferimento genico lentivirale, questo flusso di lavoro consente la generazione efficiente di cellule CAR T multi-recettore, facilitando così lo sviluppo di immunoterapie avanzate.

Introduzione

I recettori dell'antigene chimerico (CAR) Le cellule T hanno rivoluzionato il campo dell'immunoterapia. Tuttavia, nonostante il loro notevole successo, persistono sfide critiche, tra cui l'immunosoppressione mediata dal microambiente tumorale (TME), le ricadute tumorali antigeniche negative e le tossicità on-target/^{off-tumor 1,2}. Ingegnerizzare le cellule CAR T con molteplici recettori sintetici, come doppi CAR, costrutti combinati di CAR e TCR, o recettori a commutazione di citochine, ha il potenziale di superare questi^{ostacoli 3,4}. Nei tumori del sangue, equipaggiare le cellule T effettrici con doppie CAR consente il targeting simultaneo di due antigeni distinti, come CD19 e CD20⁵, riducendo così il rischio di fuga di antigeni tumorali. Nei tumori solidi, le tossicità on-target/off-tumor possono essere mitigate incorporando, ad esempio, circuiti sintetici dei recettori Notch (synNotch) che consentono l'espressione CAR logic-dipendente e migliorano la precisione di targeting 6,7,8,9,10,11,12,13 . Tuttavia, la produzione di cellule CAR T che trasportano più recettori rimane difficile a causa dell'aumento sottostante della dimensione del transgene. I vettori lentivirali autoinattivanti di terza generazione derivati dal virus dell'immunodeficienza umana (HIV) tipo 1 sono l'attuale standard d'oro per la produzione di cellule CAR T a livello di ricerca e^{clinica 14}. Per generare le cellule T CAR, i vettori lentivirali sono progettati con cassette di espressione CAR personalizzate, affiancate da sequenze a lunga ripetizione terminale (LTR), che mediano l'integrazione nel genoma delle cellule T. La capacità massima di confezionamento effettivo (EPC) dei vettori lentivirali attuali è di circa 9,2 kilobasi (kb) LTR-a-LTR, corrispondente alla dimensione genomica nativa dell'HIV-1. Man mano che i titoli lentivirali diminuiscono semi-logaritmicamente con l'aumento della lunghezza del^{vettore 15}, l'ingegneria di grandi transgeni con molteplici recettori riduce drasticamente la produzione lentivirale e alla fine ostacola la produzione di cellule^{CAR T 16}. Sebbene le tecniche di ordinamento delle celle, come l'ordinamento cellulare attivato magneticamente o a fluorescenza (MACS o FACS, rispettivamente), possano essere utilizzate per arricchire le cellule T CAR da produzioni a basso rendimento, questi metodi non aumentano il numero assoluto di cellule T CAR e aggiungono ulteriore complessità a un processo di produzione già elaborato. Di conseguenza, le difficoltà nella produzione delle cellule CAR T con grandi transgeni lentivirali rimangono un ostacolo importante sia alla ricerca preclinica che all'applicazione clinica.

Abbiamo recentemente istituito un flusso di lavoro di produzione di cellule CAR T ottimizzato per le cellule T effettori che trasportano grandi transgeni lentivirali, come il sistema single-vector synNotch (svsNotch^{) 17}. Qui dettagliamo la metodologia in un protocollo passo dopo passo per facilitarne un'ampia adozione. Come prova di concetto, dimostriamo miglioramenti dipendenti dalla dimensione nell'efficienza della trasduzione su dimensioni dei transgeni lentivirali che vanno da 5,7 kb a 9,2 kb e 10,1 kb. Nel complesso, questo flusso di lavoro ottimizzato migliora le velocità di trasduzione fino a 14,8 volte, eliminando così la necessità di ordinamento cellulare e consentendo la generazione efficiente di cellule T effettori con dimensioni di transgeni superiori a 10 kb.

Protocollo

Le cellule T umane sono state acquisite tramite il Nucleo di Immunologia Umana dell'Università della Pennsylvania, che opera secondo i principi delle Buone Pratiche di Laboratorio con procedure operative standard consolidate e/o protocolli per la ricezione, la lavorazione, il congelamento e l'analisi dei campioni che conformano le linee guida etiche di MIATA e dell'Università della Pennsylvania.

NOTA: Una panoramica schematica del flusso di lavoro ottimizzato per la produzione di lentivirus e cellule CAR T è mostrata nella Figura 1. Un confronto tra i passaggi chiave di ottimizzazione e il flusso di lavoro standard attuale è riassunto nella Tabella 1. Tutte le colture cellulari sono state mantenute a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di_CO2 utilizzando T Cell Medium (TCM) composto da RPMI-1640 integrato con 10% di siero fetale inattivato al calore (FBS), 10 mM di buffer HEPES, 2 mM di L-alanyl-L-glutamina (vedi Tabella dei Materiali), 100 U/mL di penicillina e 100 U/mL di estreptomicina.

Figura 1: Flusso di lavoro ottimizzato per la produzione di lentivirus e cellule CAR T con grandi transgeni. Rappresentazione schematica della produzione di lentivirus (in alto) e della generazione di cellule T CAR (in sotto), evidenziando i passaggi chiave e le ottimizzazioni che migliorano i titoli virali e l'efficienza della trasduzione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

		Flusso di lavoro standard	Flusso di lavoro ottimizzato
Virus	Inviluppo virale	VSV-G	Cocal-G
	Trasfezione	L2000	L30001
	Raccolto LV	24h 2 + 48h 2	30-36 h3
Cellula T	Nave	Fiaschetta T25	Piastra inferiore piatta a 96 pozzi
	Rapporto superficie/volume	Variabile	5,12 cm2/mL4
	Agiudice	Nessuna	SF1085
13 μL L3000 per 1 μg di DNA, nessuna modifica del mezzo
2centrifugazione a 106.800 x g per 2,5 h, tubo a fondo arrotondato
3centrifugazione a 12.300 x g durante la notte, tubo conico a fondo
4Supplementazione del mezzo dopo la trasduzione
555 μg/mL

Tabella 1: Confronto tra flussi di lavoro standard e ottimizzati. Ottimizzazioni chiave del flusso di lavoro migliorato rispetto all'attuale flusso di lavoro standard. Questa tabella è stata adattata con il permesso di Rommel et ^al.17.

1. Produzione di lentivirus

1. Mantenimento delle celle HEK293T
   1. Assicurati che HEK293T cellule siano distribuite uniformemente, libere da grumi e con una confluenza del 50-70% (resa tipica: 1,0-1,5 × 10⁷ celle per fiaschetta T150).
   2. Aspira il soprandante, aggiungi 20 mL di PBS a temperatura ambiente (RT) sul lato superiore della fiaschetta per evitare di spostare le cellule, fai girare delicatamente PBS sulle cellule e aspira il lavaggio.
   3. Aggiungi 3 mL di tripsina-EDTA allo 0,05% e incuba per 15-30 secondi a RT inclinando la fiaschetta da un lato all'altro. Monitorare il distaccamento delle celle.
   4. Aggiungere 7 mL di MTC freddo, risospendere le celle contro il fondo della fiaschetta per generare una sospensione a singola cella e trasferire su un tubo da 50 mL. Lava la fiaschetta con 10-20 mL di TCM freddo e aggiungi il lavaggio nello stesso tubo.
   5. Centrifugare le cellule (300 × g, 5 min, 4 °C), aspirare il soprandante, risospendere 10 mL di MTC e contare le cellule.
   6. Placca HEK293T cellule nei fiaschetti T150 a 3 × 10⁶ cellule per fiaschetta per il passaggio ogni 2 giorni (ad esempio lunedì e mercoledì) oppure a 1 ×^{10 6} cellule per fiaschetta per il passaggio ogni 3 giorni (ad esempio, placcatura il venerdì per il passaggio durante il fine settimana) utilizzando 30 mL di MTC preriscaldata a 37 °C.
2. Trasfezione di cellule HEK293T per la produzione di lentivirus
   NOTA: Esegui un piccolo esperimento pilota per determinare la densità di semina che produca costantemente una confluenza del 70-80% dopo 2 giorni. Assicurarsi che HEK293T confluenza cellulare non superi l'80% al momento della trasfezione (vedi Discussione). La trasfezione è stata ottimizzata utilizzando medium essenziale minimo a siero ridotto e reagenti commerciali per lipofeczione (L3000 e P3000, vedi Tabella dei Materiali).
   1. Prelevare HEK293T cellule tramite tripsinizzazione come descritto sopra e placcare 4 × 10⁶ cellule per fiaschetta T150 con 30 mL di MTC preriscaldati a 37 °C.
   2. Dopo 2 giorni, conferma che le colture siano distribuite uniformemente e confluenti al 70-80%.
   3. Riscalda 50 mL di medium essenziale minimo a ridotto siero per RT. Scongela i plasmidi lentivirali, mescola delicatamente e gira velocemente. Pulsa i reagenti di lipofezione dei vortici, gira veloce e lasciali in RT.
   4. Prepara i mix master del DNA. Per ogni fiaschetta, combinare in quest'ordine: 2 mL di mezzo essenziale minimo sirico ridotto, 39 μg di plasmidi lentivirali (18 μg di pTRP Gag-Pol, 18 μg di pTRP RSV-Rev, 3 μg di pTRP Cocal-G), 15 μg di plasmide di trasferimento e 108 μL di reagente P3000 (2 μL di P3000/μg DNA). Aumenta la scala secondo necessità e aumenta le quantità finali di almeno il 10% per compensare la perdita per pipetta. Vortice a impulsi, rotazione rapida e conserva a RT.
   5. Prepara master mix L3000. Per ogni fiaschetta, combinare in quest'ordine: 1,84 mL di mezzo essenziale minimo sirico ridotto e 162 μL di L3000 (3 μL di L3000/μg di DNA). Aumenta la scala secondo necessità e aumenta le quantità finali di almeno il 10% per compensare la perdita per pipetta. Vortice a impulsi, rotazione rapida e incubazione a RT per 5 minuti.
   6. Dopo 5 minuti, aggiungi 2 mL di Master mix L3000 per fiaschetta al corrispondente master mix DNA per ottenere una diluizione approssimativa 1:2. Aggiungi lentamente la miscela L3000 partendo dal fondo del tubo senza toccare i lati. Mescola accuratamente tramite pipetto e incuba 15 minuti a RT.
   7. Nel frattempo, rimuovere con attenzione 6 mL di sovrantantante da ogni HEK293T coltura e etichettare ogni fiaschetta.
   8. Dopo 15 minuti, trasfettisce ogni coltura inclinando la fiaschetta verso la superficie e rilasciando lentamente 4 mL di miscela di trasfezione nel sovrantato sulla parte superiore della fiaschetta per evitare di spostare le cellule. Pipetta lentamente su e giù due volte, riporta la fiaschetta alla posizione originale, fai ruotare delicatamente, rimettila nell'incubatrice e registra il tempo.
      NOTA: Lasciare le colture indisturbate fino al raccolto del lentivirus. A differenza della raccomandazione del produttore di sostituire il HEK293T soprantantante contenente la miscela di trasfezione L3000 con un mezzo di coltura fresco dopo la trasfezione¹⁸, omettere questo passaggio preserva titoli lentivirali^{più alti 17}.
3. Raccolta, concentrazione e congelamento dei supernattivi lentivirali
   NOTA: Mantenere i sopranattivi lentivirali sul ghiaccio o a 4 °C durante tutte le fasi di lavorazione per prevenire il degrado.
   ATTENZIONE: I vettori lentivirali sono classificati come materiali contagiosi. Segui le adeguate precauzioni di biosicurezza, incluso l'uso di dispositivi di protezione individuale (ad esempio, doppi guanti, camice usa e getta). Decontaminare tutte le superfici di lavoro con candeggina al 10% seguita dal 70% di etanolo. Disinfettare consumabili contaminati e rifiuti liquidi con candeggina al 10% prima di smaltire come rifiuti biopericolosi in conformità con le linee guida istituzionali di biosicurezza.
   1. Pulisci l'attrezzatura per ultracentrifughe (secchi, tubi conici e adattatori conici) con candeggina al 10%, poi risciacqua con acqua. Asciuga brevemente all'aria, seguita da una spruzzatura con etanolo al 70% e asciugatura all'aria sotto un cappuccio di coltura tissutale.
   2. Pre-raffreddare l'ultracentrifuga con il rotore inserito a 4 °C.
   3. Prelevate i supernatananti lentivirali 30-36 ore dopo la trasfezione trasferendoli in tubi da 50 mL. Chiarire i soprannatanti tramite centrifugazione (500 × g, 5 min, 4 °C), filtrare attraverso un filtro per pori da 0,45 μm e conservare su ghiaccio.
   4. Inserire adattatori conici nei secchi, trasferire i soprannatanti filtrati in tubi ultracentrifughe conici e caricarli nei secchi. Bilanciare i secchi opposti con la MTC fredda, assicurandosi che le differenze di peso siano inferiori a 0,1 g.
   5. Concentrate i soprannatanti tramite ultracentrifugazione a 12.300 × g durante la notte a 4 °C.
   6. La mattina seguente, rimuovi con cura i secchi e conservali sul ghiaccio.
   7. Prepara una scatola con ghiaccio secco per il congelamento e cryovials etichettati per l'allicitazione.
   8. Sotto un cappuccio per coltura tissutale, apri ogni secchio e rimuovi il tubo dell'ultracentrifuga all'interno con una pinza. Per ogni tubo, procedi come segue:
   9. Aspirare con attenzione il sovrantato fino a 0,5 pollici dal fondo del tubo e decantare il liquido rimanente in una piastra a 6 pozzi. Tocca delicatamente il tubo per rimuovere un po' del liquido residuo.
   10. Aggiungi 300 μL di TCM freddo, risospezioni delicatamente per 30 secondi e trasferisci la sospensione in un cryovial.
   11. Lava il tubo con 200 μL di TCM freddo e aggiungi il lavaggio allo stesso cryovial.
   12. Mescolare delicatamente e aliquote 60 μL per la titolazione dei lentivirus (vedi passo 1.4), diverse aliquote da 100 μL per la produzione di cellule CAR T e un tubo aggiuntivo con il volume rimanente come residuo. Congela immediatamente le aliquote su ghiaccio secco. Trasferire le aliquote a -80 °C per la conservazione a lungo termine.
4. Titolazione del lentivirus concentrato utilizzando cellule T primarie
   NOTA: Circa 1 × 10⁵ Le cellule T sono necessarie per diluizione per lentivirus. Ad esempio, sei lentivirus con otto diluizioni ciascuno richiedono: 6 × 8 × 1 × 10⁵ = 4,8 × 10⁶ Cellule T. Devono essere preparate cellule aggiuntive per compensare la perdita di pipetta. Le cellule T sono stimolate tramite sfere magnetiche di attivazione rivestite con anticorpi anti-CD3 e anti-CD28 (vedi Tabella dei Materiali).
   1. Attivazione delle cellule T (giorno 0)
      1. Prerequisito: Tenere pronte le cellule T umane purificate CD4⁺ e CD8⁺ in MTC.
      2. Contare le cellule T CD4⁺ e CD8⁺ e combinarle in un rapporto 1:1.
      3. Lavare le sfere di attivazione come segue: aggiungere 1 mL di MTC a un tubo, risospendere le sfere tramite vortice e trasferire la quantità richiesta per ottenere un rapporto di 3 a 1 di sfere a cellule T. Posiziona il tubo in un supporto magnetico e lascia che le perline formino un pellet lungo la parete del tubo. Dopo 30 secondi, aspirare con cura il soprantantante, rimuovere il tubo dal supporto magnetico e risospendere le sfere in 1 mL di MTC. Ripeti il lavaggio altre due volte.
      4. Aggiungi delle sfere di attivazione alle cellule T e regola la concentrazione finale a 1 × 10⁶ cellule/mL con la MTC preriscaldata a 37 °C.
      5. Mescola bene e trasferisci la sospensione in un serbatoio di reagente. Celle a piastra in piastre a fondo piatto da 96 pozzi con 100 μL di MTC per pozzo utilizzando una pipetta multicanale. Mescola accuratamente ogni 1-2 minuti per evitare che la perla si depositi.
   2. Trasduzione delle cellule T (giorno 1)
      NOTA: Per lentivirus con transgeni grandi (ad esempio, 9 kb LTR-to-LTR), preparare 6 condizioni usando diluizioni seriali 1:2 (non diluite, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32). Per i lentivirus con transgeni più piccoli (ad esempio, 7 kb LTR-a-LTR), sono necessarie 8 condizioni con diluizioni seriali 1:4. Usa i pozzi rimanenti come controlli non trasdotti (UTD).
      1. Scongelare 60 μL di ciascun lentivirus concentrato a RT e conservare sul ghiaccio.
      2. Preparare una serie di diluizione in una piastra a fondo arrotondato da 96 pozzi: aggiungere 60 μL di lentivirus alla riga superiore, aggiungere 30 μL di TCM freddo a ciascuna riga sotto, trasferire 30 μL dalla prima alla seconda fila e mescolare (diluizione 1:2), trasferire 30 μL dalla seconda alla terza fila e mescolare (diluizione 1:4). Continua finché non sono preparate in totale sei condizioni (non diluite, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32). Usalo subito per la trasduzione.
      3. Tra 23 e 26 ore dopo la stimolazione con la perla, si trasducono le cellule T con 25 μL per pozzo di lentivirus dalla piastra di diluizione utilizzando una pipetta multicanale. Aggiungere 25 μL di MTC ai pozzi di controllo UTD.
   3. Alimentazione con cellule T (giorno 3)
      1. Aggiungi delicatamente 125 μL di MTC preriscaldata a 37 °C in ciascun pozzo usando una pipetta multicanale.
   4. Analisi della deboazione delle cellule T e citometria a flusso (giorno 5)
      1. Prepara tre set di tubi a vite da 1,5 mL per ogni condizione e rimuovi i coperchi. Metti due dei tre set in un supporto magnetico.
      2. Sospezione di ciascun pozzo e trasferisci le celle al primo set di tubi per permettere alle sfere di formare un pellet lungo la parete del tubo. Dopo 30 s, trasferire con attenzione i soprantativi nel secondo set di tubi. Aspetta 30 secondi (le perline non dovrebbero più essere visibili), poi trasferisci i soprantativi nel terzo set di tubi e conserva sul ghiaccio.
      3. Colorare le cellule T per il marcatore di trasduzione appropriato (ad esempio, anti-CD19 CAR o anti-HER2 synNotch) con anticorpi (vedi Tabella dei materiali) e analizzare l'espressione dei marcatori tramite citometria a flusso.
      4. Identificare condizioni con tassi di trasduzione inferiori al 30%, corrispondenti approssimativamente all'intervallo lineare tra il volume del virus e il tasso di trasduzione.
      5. Calcola i titoli lentivirali usando la seguente formula:
         Titolo (TU/mL) = (numero iniziale di cellule T x percentuale di cellule trasdotte x fattore di diluizione)/volume virale (mL)
         ad esempio, espressione CAR del 20% con diluizione 1:32 della scorta lentivirale:
         (100.000 celle x 0,2 x 32) / (0,025 mL) = 2,56 × 10⁷ TU/mL

2. Produzione di cellule T CAR

NOTA: Le quantità iniziali tipiche per la produzione di cellule T CAR sono 1-5 × 10^{cellule T 6} per gruppo. Aumentare il numero di cellule nel gruppo di controllo UTD del 50%, poiché questo gruppo sarà utilizzato anche per normalizzare i livelli di trasduzione negli esperimenti a valle. Aspettatevi 5-6 raddoppi della popolazione durante l'espansione. La trasduzione delle cellule T è stata ottimizzata utilizzando un copolimero a blocchi come potenziatore (vedi Tabella dei Materiali) e con rapporti specifici di coltura superficie-volume in piastre a fondo piatto a 96^{pozzi 17}.

1. Preparazione di una soluzione di potenziatore da 100 mg/mL
   1. Aggiungi 5 g di esaltatore di copolimeri in una bottiglia di plastica, poi aggiungi 45 mL di acqua ultrapura. Mescolate durante la notte al RT.
   2. Trasferire la soluzione in un cilindro graduato e regolare il volume a 50 mL con acqua ultrapura.
   3. Filtra la soluzione attraverso un filtro per pori da 0,22 μm e conserva a 4 °C.
2. Attivazione delle cellule T (giorno 0)
   1. Prerequisito: Tenere pronte le cellule T umane purificate CD4⁺ e CD8⁺ in MTC.
   2. Contare le cellule T CD4⁺ e CD8⁺ e combinarle in un rapporto 1:1.
   3. Lava le perline di attivazione come segue.
      1. Aggiungere 1 mL di MTC a un tubo, sospendere le sfere tramite vortice e trasferire la quantità necessaria per ottenere un rapporto 3 a 1 tra sfere e cellule T. Posiziona il tubo in un supporto magnetico e lascia che le perline formino un pellet lungo la parete del tubo.
      2. Dopo 30 secondi, aspirare con cura il soprantantante, rimuovere il tubo dal supporto magnetico e risospendere le sfere in 1 mL di MTC. Ripeti il lavaggio altre due volte.
   4. Aggiungi delle sfere di attivazione alle cellule T e regola la concentrazione finale a 1 × 10⁶ cellule/mL con la MTC preriscaldata a 37 °C.
   5. Mescola bene e trasferisci la sospensione in un serbatoio di reagente. Celle a piastra in piastre a fondo piatto da 96 pozzi con 50 μL di MTC per pozzo utilizzando una pipetta multicanale. Mescola accuratamente ogni 1-2 minuti per evitare che la perla si depositi.
3. Trasduzione delle cellule T (giorno 1)
   NOTA: Selezionare le quantità di lentivirus in base ai risultati della titolazione precedente, assicurandosi che i livelli finali di trasduzione siano comparabili tra i gruppi (tipicamente tra il 20% e il 30%). Per evitare integrazioni lentivirali multiple, mantenere i livelli massimi di trasduzione ≤ 30%. I lentivirus con transgeni di grandi dimensioni generalmente richiedono o virus non diluiti o una diluizione 1:4-1:8. Regolare le dimensioni dei gruppi per evitare residui di lentivirus, poiché ogni ciclo di gelo-disgelo riduce i titoli lentivirali. Usa miscele master lentivirali subito dopo la preparazione.
   1. Scongelare le quantità necessarie di lentivirus concentrato a RT e conservarle sul ghiaccio.
   2. Prepara un materiale di lavoro da 2 mg/mL per un potenziatore in TCM freddo mescolando, ad esempio, 100 μL di potenziatore (100 mg/mL) con 4,9 mL di MTC.
   3. Preparare le miscele master di lentivirus basate sui risultati della titolazione e aggiungere un potenziatore a una concentrazione finale di 275 μg/mL. Aumentare i volumi finali di almeno il 10% per compensare la perdita da pipetta. Ad esempio, per ottenere una diluizione 1:16 con 100 pozzi:
      Volume totale: 100 pozzi × 12,5 μL di lentivirus × 110% = 1.375 μL
      1:16 diluizione: 1.375 μL/ 16 = 85,9 μL di lentivirus
      Potenziatore: 189 μL (275 μg/mL finale)
      Miscela master finale: 1.100 μL di TCM + 85,9 μL di lentivirus + 189 μL di potenziatore = 1.375 μL
   4. Tra 23 e 26 ore dopo la stimolazione con la perla, si trasducono le cellule T con 12,5 μL per pozzo di miscela master lentivirus usando una pipetta multicanale, ottenendo una concentrazione finale di 55 μg/mL dell'amplificatore. Aggiungere 12,5 μL di MTC ai pozzi di controllo UTD.
4. Alimentazione con cellule T (giorno 3)
   1. Aggiungi delicatamente 125 μL di MTC preriscaldata a 37 °C in ciascun pozzo usando una pipetta multicanale.
5. Scavamento delle cellule T (giorno 5)
   NOTA: Prepara un serbatoio sterile e tre serie di tubi da 50 mL per ogni coltura. Limitare il volume totale di lavaggio a ≤ 20% del volume della coltura delle cellule T per evitare di diluire le cellule sotto 8 × 10⁵ cellule/mL.
   1. Raccogli ogni coltura in un serbatoio sterile usando una pipetta multicanale, lava le lastre originali con la MTC e aggiungi il lavaggio al serbatoio. Trasferire ogni sospensione di cella al primo set di tubi da 50 mL.
   2. Posiziona i tubi in un supporto magnetico per permettere alle perline di formare un pellet lungo la parete del tubo. Dopo 30 secondi, trasferisci con cura i sopranattivi nel secondo set di tubi e posizionali nel supporto magnetico. Aspetta 30 secondi (le perle non dovrebbero più essere visibili), poi trasferisci i soprantativi nel terzo gruppo di tubi e conservali nell'incubatrice.
   3. Contare ogni coltura e normalizzare a 8 × 10⁵ cellule/mL con la MTC preriscaldata a 37 °C. Placca nel recipiente di coltura appropriato a seconda del volume finale (Tabella 2).
   4. Lascia riposare le cellule T per 1 giorno, poi inizia le poppate giornaliere a partire dal giorno 7 (vedi passo successivo).
6. Alimentazione con cellule T (giorno 7 e quotidiano successivamente)
   NOTA: Le cellule T raddoppiano approssimativamente ogni 24-36 ore e subiscono 5-7 raddoppiamenti della popolazione prima di riposare. Monitorare i volumi delle cellule T utilizzando un contatore di celle basato su impedenza elettrica (vedi Tabella dei materiali) per identificare il momento ottimale per la crioconservazione.
   1. Raccogli ogni coltura, mescola bene e conta le cellule.
   2. Normalizzare ogni coltura a 8 × 10⁵ cellule/mL con MTC preriscaldata a 37 °C e riplaccare nel recipiente di coltura appropriato (Tabella 2).
   3. Continuare l'espansione finché il volume medio della cella non scende sotto i 320^{μm 3}, poi passare alla fase di crioconservazione.
7. Validazione della trasduzione delle cellule T tramite citometria a flusso
   NOTA: La trasduzione delle cellule T può essere valutata in qualsiasi momento tra il giorno 5 e il giorno della crioconservazione. I livelli di espressione diminuiranno nel corso dell'espansione, così che una misurazione precoce garantirà una netta separazione tra frazioni negative e positive durante l'analisi della citometria di flusso.
   1. Prelevare 2 × 10 5 cellule T da ogni coltura.
   2. Colorare le cellule T per il marcatore di trasduzione appropriato (ad esempio, anti-CD19 CAR o anti-HER2 synNotch) con anticorpi (vedi Tabella dei materiali) e analizzare l'espressione dei marcatori tramite citometria a flusso
8. Crioconservazione delle cellule T (tipicamente tra i giorni 10-12)
   NOTA: La criopreservazione ha espanso le cellule T subito prima o dopo il loro stato di riposo per migliorare la vitalità durante lo scongelamento. Un volume medio di 320^{μm 3} può fungere da soglia per la crioconservazione. Quando il volume cellulare scende sotto i 300^{μm 3}, le cellule T smettono di dividersi e il loro numero totale inizia a diminuire. Assicurati che tutti i gruppi abbiano volumi comparabili al momento della crioconservazione, che potrebbe richiedere un giorno aggiuntivo di cultura per alcuni gruppi. Congelare le celle a una velocità costante di -1 °C al minuto utilizzando contenitori di congelamento appropriati (ad esempio, contenitori di congelamento a celle senza alcol, vedi Tabella dei materiali).
   1. Raccogli ogni coltura in un tubo appropriato (ad esempio, 500 mL), conteggi le cellule e conservale nell'incubatrice.
   2. Calcola il numero totale di celle e le quantità aliquote desiderate.
   3. Le celle centrifughe (300 × g, 10 min, 4 °C) aspirano i soprantativi e risospendono ogni coltura in un mezzo congelante contenente il 50% di substrati senza siero, il 40% di FBS inattivato dal calore e il 10% di dimetilsolfosida (DMSO) a 2 × 10⁷ cellule/mL (vedi Tabella dei Materiali).
   4. Cellule aliquote in crioviali (250 μL a 1 mL, corrispondenti a 5-20 × 10⁶ cellule per fiala). Metti i cryovial in un contenitore di congelamento a celle e conservali a -80 °C durante la notte.
   5. Trasferire i cryovials in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
9. Scongelamento delle cellule T
   NOTA: Per ogni gruppo di cellule T, preparare un tubo con 50 mL di MTC preriscaldato a 37 °C per diluire il DMSO nel mezzo di congelamento dopo lo scongelamento. Riscalda ulteriormente MTC per la piastratura.
   1. Scongelare rapidamente i cryovial a 37 °C in un bagno d'acqua o sotto acqua calda corrente.
   2. Non appena il liquido è visibile, si procede verso un cappuccio per la coltura tissutale, si aggiungono 500 μL di MTC preriscaldato, si mescola delicatamente e si trasferiscono le cellule nei tubi preparati contenenti 50 mL di MTC.
   3. Lava il cryovial con 500 μL di TCM e aggiungi il lavaggio allo stesso tubo.
   4. Incubare le cellule per 10 minuti in tempo di terapia respiratoria.
   5. Le celle centrifughe (300 × g, 10 min, temperatura ambiente), aspirano i supernatanti e risospendono le celle a 4 × 10⁶ cellule/mL.
   6. Placca le cellule nel vaso di coltura appropriato (Tabella 2).
   7. Riposare le cellule durante la notte nell'incubatrice prima di procedere con gli esperimenti a valle.

Nave	Volume minimo	Volume massimo
96-pozzo	0,1 mL/pozzo*	0,25 mL/pozzo
48-pozzo	0,2 mL/pozzo	1 mL/pozzo
24-pozzo	0,5 mL/pozzo	2 mL/pozzo
12-pozzo	1 mL/pozzo	4 mL/pozzo
6-pozzo	2 mL/pozzo	6 mL/pozzo
T25 (orizzontale)	3 mL	8 mL
T75 (orizzontale)	8 mL	20 mL
T150 (orizzontale)	20 mL	60 mL
* il volume di coltura viene temporaneamente ridotto a 50 μL/pozzo per migliorare la trasduzione delle cellule T

Tabella 2: Volumi di media di coltura raccomandati per le espansioni delle cellule CAR T. Volumi minimi e massimi di media di coltura attraverso formati vasali comunemente usati durante l'espansione delle cellule T.

Risultati

Per dimostrare i miglioramenti ottenuti con il flusso di lavoro ottimizzato (Figura 1) su un'ampia gamma di dimensioni di transgene, abbiamo selezionato tre dimensioni di vettori lentivirali: 5,7 kb (CD19 CAR), 9,2 kb (HER2-MSLN svsNotch) e 10,1 kb (HER2-MSLN-CBG svsNotch) (Figura 2A). I lentivirus sono stati prodotti in condizioni standard o ottimizzate (Figura 2B: STD vs. opt e Tabella 1).

Per il vettore più piccolo con 5,7 kb, è stato osservato solo un miglioramento moderato nella trasduzione delle cellule T in un lotto di produzione (Figura 2B: in alto, 73% contro 88% usando virus non diluito). Costantemente, i titoli lentivirali aumentarono solo modestamente di circa 1,5 volte (Figura 2C: in alto, 2,86 × 10⁸ TU/mL contro 4,35 × 10⁸ TU/mL). Al contrario, il vettore da 9,2 kb ha mostrato prestazioni sostanzialmente migliorate, con tassi massimi di trasduzione delle cellule T che aumentano di circa 5,4 o 3,8 volte a seconda del lotto (Figura 2B: centro, 8,3%/16,6% vs. 45,1%/63,1% usando virus non diluito) e titoli funzionali che migliorano di circa 3,3 volte (Figura 2C: centro; 3,1 × 10⁶ TU/mL vs. 10,1 × 10⁶ TU/mL). L'effetto più forte si è osservato con il vettore da 10,1 kb, dove i tassi di trasduzione sono aumentati di circa 12,4 o 9,8 volte (Figura 2B: fondo, 1,4%/1,5% vs. 17,3%/14,7% usando virus non diluito) e i titoli funzionali sono migliorati di circa 10 volte (Figura 2C: fondo, 0,24 × 10⁶ TU/mL contro 2,41 × 10⁶ TU/mL).

Successivamente, le cellule T provenienti da donatori sani sono state trasdotte con vettori lentivirali prodotti in condizioni standard o ottimizzate, utilizzando i relativi flussi di lavoro (Figura 3 e Tabella 1). Per confrontare le efficienze della trasduzione, sono state utilizzate quantità uguali di lentivirus in ciascun flusso di lavoro, e la dose virale è stata regolata per mantenere i tassi di trasduzione al 30% o inferiori, prevenendo eventi di integrazione multipli. Rispetto alle cellule T trasdotte in condizioni standard e con produzione standard di lentivirus, la trasduzione è aumentata in media di 5,1 volte per il vettore da 5,7 kb, di 13,3 volte per quello da 9,2 kb e di 14,8 volte per quello da 10,1 kb (Figura 3A e Tabella Supplementare 1). Colture selezionate di cellule T generate con il flusso di lavoro ottimizzato sono state ulteriormente espanse fino a raggiungere uno stato di riposo (Figura 3B,C). I raddoppi della popolazione variavano da 5,3 a 6,7, a seconda del donatore di cellule T (Figura 3B). Le misurazioni giornaliere del volume delle cellule T hanno mostrato detriti cellulari minimi, senza indicare segni di tossicità durante le espansioni. Prima della crioconservazione, i tassi di trasduzione venivano valutati tramite colorazione per l'espressione del recettore CAR/synNotch o misurando la fluorescenza di mTag-BFP2¹⁹ (Figura 3C e Figura Supplementare 1). I tassi di trasduzione erano del 31,2% per il vettore da 5,7 kb (nero; diluizione lentivirus 1:512), 29,8% per il vettore da 9,2 kb (rosso; diluizione lentivirus 1:16) e 20,2% per il vettore da 10,1 kb (blu; diluizione lentivirus 1:4). Ulteriori dati funzionali che convalidano le prestazioni delle cellule T svsNotch e CAR T sono presentati nel nostro studio^{complementare 17}. È importante sottolineare che le cellule T effettrici prodotte con il protocollo ottimizzato non hanno mostrato differenze nei raddoppi della popolazione o nel fenotipo delle cellule T rispetto a quelle generate con il flusso di lavoro^{standard 17}.

Figura 2: Produzione di lentivirus seguendo flussi di lavoro standard e ottimizzati. (A) Panoramica schematica dei vettori lentivirali con corrispondenti dimensioni di transgene¹⁷. Sopra: Un CAR contro CD19 (CD19 CAR) è espresso dal promotore alfa del fattore di allungamento umano 1 (EF1α), con una dimensione totale del transgene di circa 5,7 kb. Centrale e inferiore: Un recettore synNotch HER2 viene co-espresso con una proteina reporter blu-fluorescente (BFP2) (centrale) o con una luciferasi verde del coleotomaco click (CBG) (in fondo) tramite un peptide auto-scindente 2A (P2A) dal promotore EF1α. L'espressione di un CAR (MSLN) che mira alla mesotelina (MSLN) è controllata da un promotore specifico del citomegalovirus minimo (CMV) specifico per GAL4 (GAL4-CMV). Le dimensioni totali dei transgeni sono di circa 9,2 kb per il Notch svsNotch HER2-MSLN (centro) e 10,1 kb per il Notch svsNotch HER2-MSLN-CBG (inferiore). SIN = vettore autoinattivante; LTR = lunga sequenza di ripetizione terminale. (B) Trasduzione delle cellule T con diluizioni seriali di lentivirus generate in condizioni standard (STD) e ottimizzate (opt) utilizzando i vettori descritti in (A). Due produzioni indipendenti (cerchi e triangoli) per vettore con due lotti ciascuno, e due donatori distinti di cellule T per lotto. I tassi di trasduzione sono stati mediati tra i donatori di cellule T. (C) Titoli funzionali delle produzioni di virus standard (std, cerchi aperti) e ottimizzate (opt, cerchi chiusi) mostrati in (B). I dati sono stati generati da due produzioni indipendenti di lentivirus, ciascuna con due lotti, e utilizzando due donatori distinti di cellule T per lotto. Tutte le barre di errore indicano la media ± SD. La significatività statistica è stata calcolata utilizzando un test t a due code. *p < 0,03, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Questa figura è stata adattata con il permesso di Rommel et ^al.17. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Produzione di celle T CAR con flussi di lavoro standard e ottimizzati. (A) Aumento di pieghe nei tassi di trasduzione delle cellule T con il flusso di lavoro ottimizzato (opt) rispetto al flusso di lavoro standard (std) (vedi anche Tabella S1). I dati sono stati ottenuti da due o tre espansioni indipendenti di cellule T utilizzando donatori distinti e due produzioni indipendenti di lentivirus. (B) Raddoppi della popolazione delle espansioni delle cellule T generati utilizzando il flusso di lavoro ottimizzato. Per ogni vettore, vengono mostrate due espansioni indipendenti di cellule T da donatori normali distinti (ND), ciascuna utilizzando una produzione separata di lentivirus. (C) Grafici di citometria a flusso che mostrano l'espressione dei recettori CAR, BFP2 e synNotch nelle cellule T effettori espanse al giorno 7 (10,1 kb) o al giorno 10 (5,7 kb e 9,2 kb) (vedi anche la Figura Supplementare 1). Tutte le barre di errore indicano la media ± SD. La significatività statistica è stata calcolata utilizzando un test t a due code. *p < 0,03, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Questa figura è stata adattata con il permesso di Rommel et ^al.17. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Strategia di gating per valutare l'espressione di CAR, recettore synNotch e BFP2, correlata alla Figura 3C. Grafici rappresentativi di citometria a flusso che mostrano la strategia di gating utilizzata per determinare l'espressione di CAR, synNotch e BFP2 nelle colture di cellule T espanse. Clicca qui per scaricare questo File.

Tabella supplementare 1: Tassi di trasduzione attraverso le singole espansioni delle cellule T, correlati alla Figura 3A. Velocità di trasduzione delle espansioni delle cellule T generate con flussi di lavoro standard e ottimizzati. Questa tabella è stata adattata con il permesso di Rommel et ^al.17. Clicca qui per scaricare questo File.

Discussione

Qui presentiamo un protocollo passo dopo passo che dettaglia un flusso di lavoro di produzione ottimizzato per le cellule T CAR con grandi transgeni lentivirali, come le cellule T svsNotch. Questo flusso di lavoro elimina la necessità di ordinamento cellulare e consente la generazione efficiente di cellule T effettorie che trasportano grandi transgeni lentivirali. Utilizzando questo flusso di lavoro, produciamo regolarmente cellule T effettrici con transgeni lentivirali di 9-10 kb e tassi massimi di trasduzione del 60-70% (9 kb) o 15-20% (10 kb).

Quando si cerca di risolvere i bassi titoli virali o tassi di trasduzione, bisogna considerare diversi fattori chiave. Innanzitutto, la qualità delle cellule HEK293T. È importante che HEK293T cellule siano passate con un programma costante e non vengano mai lasciate crescere oltre il 50-70% di confluenza. Secondo la nostra esperienza, i vettori lentivirali prodotti da cellule HEK293T precedentemente cresciute presentano titoli ridotti, anche quando le cellule sembrano morfologicamente riprese. Generiamo regolarmente vettori virali ad alto titolo utilizzando cellule HEK293T oltre il passaggio 30, indicando che numeri di passaggio più elevati sono tollerati se le cellule sono mantenute correttamente. Oltre alla qualità cellulare, la confluenza delle HEK293T cellule al momento della trasfezione è un fattore critico. Abbiamo osservato una diminuzione dei titoli lentivirali durante la trasfettazione delle cellule HEK293T ad alta confluenza (90-100%).

In secondo luogo, è essenziale il rigoroso rispetto dei tempi, concentrazioni e volumi specificati in questo protocollo, poiché molti passaggi sono stati ottimizzati a fondo in uno studio^{precedente 17}. Ad esempio, l'esaltatore di copolimeri (vedi Tabella dei Materiali) è stato titolato per massimizzare i tassi di trasduzione senza rilevare tossicità. Sebbene concentrazioni più elevate possano aumentare ulteriormente la trasduzione, causano anche tossicità e riducono l'espansione delle cellule T. Analogamente, la raccolta di supernatori lentivirali al di fuori della finestra raccomandata di 30-36 ore (ad esempio, a 24 ore o 48 ore) ha prodotto titoli più bassi in un corrispondente esperimento^{temporale 17}. Al contrario, non è necessario rispettare rigorosamente un rapporto 1:1 tra cellule T CD4 e CD8, poiché non abbiamo osservato differenze significative nell'efficienza della trasduzione utilizzando cellule T di blocco con distribuzioni variabili CD4/CD8. Tuttavia, le deviazioni da questo rapporto possono influenzare la durata dell'espansione e il numero di raddoppi della popolazione. Pertanto, di solito manteniamo il rapporto 1:1 CD4-CD8 per garantire la coerenza tra gli esperimenti.

Gli sforzi di ottimizzazione futuri potrebbero concentrarsi su strategie aggiuntive per migliorare la trasduzione delle cellule T con transgeni lentivirali ancora più grandi, come formulazioni di mezzi specializzati o regimi di citochine su misura. Estendere questo flusso di lavoro ad altri tipi di cellule immunitarie, incluse cellule natural killer e macrofagi, potrebbe ampliarne le applicazioni terapeutiche. È importante sottolineare che la traduzione clinica di questo flusso di lavoro possa anche contribuire a ridurre i costi di produzione dei prodotti di terapia cellulare modificata con lentivirus.

Il protocollo completo passo dopo passo presentato qui fornisce un riferimento pratico per la produzione di cellule CAR T con grandi transgeni lentivirali e pone le basi per lo sviluppo di nuove cellule CAR T contro tumori solidi e del sangue.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anticorpo - AUTO anti-CD19	Cytoart	200101	Anti-CD19 CAR (idiotipo), coniugato AF647, 1:100
Anticorpo - anti-HER2 synNotch	R& Sistemi D	FAB95471G	Anti-Trastuzumab (idiotipo), coniugato AF488, 1:80
Candeggina	Clorox	Candeggina germicida
Contenitore di congelamento delle celle	Biocision	FTS30	Senza alcol
Centrifuga (grande)	Thermo Scientific	Legend XTR
Centrifuga (mini)	Fisher Scientific	Sprout Plus
Centrifuga (piccola)	Eppendorf	5425
Contatore Coulter	Beckman Coulter	Multisizer 4	Contatore cellulare basato su impedenza elettrica che determina il numero e i volumi cellulari
Tubi criogenici	Thermo Scientific	375418
Dimetilsolossido (DMSO)	Tecnologia di segnalazione cellulare	12611P
DPBS (senza calcio, senza magnesio)	Gibco	14190-136
Dynabeads (CD3/CD28)	Gibco	40203D	Sfere di attivazione usate per la stimolazione delle cellule T
Etanolo	Laboratori di Decon	200 Proof
FBS (inattivato dal calore)	Avantor (VWR)	97068-091
Citometro a flusso	BD	LSRFortessa (647177)
Freezer (-80 °C; C)	Panasonic	MDFU76VA-PA
Congelatore (azoto liquido)	MVE HEco	1500-190
Frigorifero (4 e deg; C)	Fisher Scientific	Isotemp
Guanti (Nitrile)	Drizza	55082
Integratore GlutaMAX	Gibco	35050-061	L-alanyl-L-glutamina
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Ghiaccio (secco)	n.a.	n.a.
Ghiaccio (bagnato)	n.a.	n.a.
Secchio di ghiaccio	Fisher Scientific	07-210-108
Camice da laboratorio (usa e getta)	Kappler	PVS112WH-MD
Plasmidi di imballaggio lentivvirale	Proprietario	n.a.	pTRP Gag-Pol, pTRP RSV-Rev, pTRP Cocal-G
Plasmidi di trasferimento lentivvirale	Proprietario	n.a.	ad esempio pTRPE svsNotch
Reagente di trasfezione Lipofectamina 3000	Invitrogen	L3000015	Reagente commerciale per lipofezione; contiene Lipofectamina 3000 (L3000) e il suo reagente potenziatore (P3000)
Supporto magnetico (grande)	Stemcell	EasySet 18103	Per 5 mL/15 mL
Supporto magnetico (piccolo)	Invitrogen	DynaMag-2 12321D	Per valvole da 1,5 mL
Barra di agitazione magnetica	Fisher Scientific	14-513-82	Kit a barra agitatrice
Piattaforma magnetica di mescolare	Thermo Scientific	S88857100
Cilindro di misura (100 mL)	VWR	76019-316
Acqua MQ	Merck	Q-POD	Acqua di ultrapue; Utilizza il filtro finale Millipak 40 Express, 0,22 micron (MPGP04001)
Piotetta multicanale	Fisher Scientific	vedi commenti	30-300 & micro; L:  FBE1200300; 5-50 & micro; L:  FBE1200050
Opti-MEM (con L-glutamina, Fenolo Rosso)	Gibco	31985-070	Mezzo essenziale minimo a ridotto siero utilizzato per la trasfezione di DNA
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL, 10.000 & micro; g/mL)	Gibco	15140-122
Pipete	Fisherbrand	vedi commenti	50 mL: 13-678-11F; 25 mL: 13-678-11; 10 mL: 13-678-11E; 5 mL: 13-678-11D
Pipete (aspiranti)	Falcon	357558	2 mL
Pipetta	Gilson	PIPETMAN P10/P20/P200/P1000
Controller a pipetta	Hirschmann	Pipeto Z314951
Punte per pipette	Thomas Scientific	vedi commenti	1000 & micro; L: 1159M42; 200 & micro; L: 1159M40; 20 & micro; L: 1159M43; 10 & micro; L: 1159M41
Bottiglia di plastica per conservare (500 mL)	Corning	430282
Serbatoio di reagenti	Celltreat	3054-2007
RPMI-1640 (con L-glutamina, Fenolo Rosso)	Gibco	11875-085
Scala	Ohaus	Pioniere	Precisione minima di 0,1 g richiesta
Filtro Steriflip (0,45 & micro; m)	Millipore	SE1M003M00
Sinperonica F 108 (SF108)	Sigma-Aldrich	07579-250G-F	Copolimero a blocchi utilizzato per migliorare la trasduzione delle cellule T
Fiaschetta per coltura tissutale - T150	Corning	430825
Fiaschetta per coltura tissutale - T25	Corning	430639
Fiaschetta per coltura tissutale - T75	Corning	430641U
Cappuccio per coltura tissutale	Thermo Scientific	Serie 1300 A2
Incubatore per colture tissutali	Thermo Scientific	Heracell 150i
Piastra di coltura tissutale - 6 pozzi	Corning	3516
Piastra di coltura tissutale - fondo piatto a 96 pozzi	Falcon	353072
Piastra di coltura tissutale - fondo arrotondato a 96 pozzi	Falcon	353077
Tripsina-EDTA (0,05%)	Gibco	25300-054
Tubi - tappi a vite da 1,5 ml	Sarstedt	72692005
Tubi - 15 mL	Falcon	352099
Tubi - 5 mL	MSP	62-1028-2
Tubi - 500 mL	Corning	431123
Tubi - 50ml	Falcon	352098
Ultracentrifuga	Beckman Coulter	Optima XPN-100
Rotore ultracentrifugo con secchi	Beckman Coulter	SW 32 Ti
Adattatori per tubi ultracentrifughe (per tubi conici)	Seton Scientific	4230
Tubi ultracentrifughe (conici)	Seton Scientific	5067
Vortice	Fisher Scientific	02215414
Bagno d'acqua (37 & deg; C)	Fisher Scientific	Isotemp 210	Usato con perle Lab Amor (Gibco) invece dell'acqua
X-VIVO-15	Lonza	04-418Q	Mezzi senza siero utilizzati per congelare le cellule T