Un metodo raffinato di somministrazione intratracheale di bleomicina a base di aerosol per modelli murini riproducibili e minimamente invasivi di fibrosi polmonare

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per modellare la fibrosi polmonare nei topi utilizzando bleomicina aerosolizzata somministrata tramite la trachea. Questo metodo ottimizzato consente una consegna uniforme, quantitativa e precisa senza incisioni chirurgiche, migliorando la riproducibilità e l'affidabilità della fibrosi indotta dalla bleomicina.

Abstract

La fibrosi polmonare è caratterizzata da una progressiva deposizione di tessuto cicatriziale fibrotico all'interno del parenchima polmonare, che porta a uno scambio gassoso gravemente compromesso. Essa è alla base di uno spettro di malattie polmonari interstiziali croniche, in particolare la fibrosi polmonare idiopatica, una condizione associata a una prognosi estremamente negativa. Data la mancanza di terapie efficaci, modelli murini robusti sono fondamentali per chiarire i meccanismi patologici sottostanti e valutare nuovi interventi antifibrotici. La fibrosi polmonare indotta da bleomicina rimane il modello sperimentale più ampiamente utilizzato. Le vie comuni di somministrazione nei topi includono iniezioni endovenose e intraperitoneali, instillazione tracheale aperta invasiva e gocchiamento tracheale non invasivo. Tuttavia, i metodi chirurgici invasivi spesso causano lesioni tissutali secondarie, compromettendo potenzialmente la riproducibilità e la stabilità del modello. Al contrario, il gocchiamento tracheale non invasivo di solito provoca una distribuzione disomogenea della bleomicina tra i lobi polmonari e comporta un rischio di asfissia, riducendo così la riproducibilità e aumentando le difficoltà tecniche. Per affrontare queste limitazioni, viene sviluppato un metodo di somministrazione intratracheale basato su aerosol raffinato, che è operativamente più semplice, minimamente invasivo, altamente riproducibile ed eticamente superiore, riducendo significativamente il disagio animale. Utilizzando un laringoscopio di piccolo animale per visualizzare direttamente la rima glottide, viene inserito nella trachea un ago aerosolizzante specializzato, nettamente più stretto del diametro tracheale del topo. La soluzione di bleomicina viene somministrata a una pressione controllata con precisione, generando un aerosol fine. Questo garantisce una distribuzione uniforme ed efficiente dell'agente in tutto il parenchima polmonare. Inoltre, si può colpire selettivamente il polmone sinistro o destro dirigendo l'ago verso il bronco appropriato. La relazione dose-risposta di questo modello ottimizzato è ampiamente caratterizzata dal monitoraggio sistematico delle variazioni nella funzione polmonare, nelle manifestazioni istopatologiche e nel contenuto di idrossiprolina polmonare. Si prevede che questo protocollo sperimentale raffinato faciliti la standardizzazione di laboratorio, accelerando infine lo sviluppo e la validazione preclinica di nuove terapie antifibrotiche.

Introduzione

La fibrosi polmonare (PF) è un gruppo di malattie letali caratterizzate da danni progressivi al parenchima polmonare e riparazione anomala, di cui la fibrosi polmonare idiopatica (IPF) rappresenta il 30%-40%, con un'età mediana di diagnosi per i pazienti di 65 anni, e più dell'80% di loro con più di 60 anni^{di età superiore a 60 anni. 2}. Con l'intensificarsi dell'invecchiamento globale, l'incidenza dell'IPF aumenta anno dopo anno, con un'incidenza mondiale di IPF tra 3 e 9/100.000 all'anno, e secondo uno studio condotto negli Stati Uniti d'America su persone sopra i 65 anni, l'incidenza in questa popolazione è salita a 93,7/100.000/anno ^3,4.

Il primo modello storicamente sviluppato di fibrosi polmonare è stato il modello indotto dalla bleomicina, spesso utilizzato in ambito accademico, con la migliore caratterizzazione e il modello animale attualmente^{più utilizzato 5}, riproponendo molte delle caratteristiche dell'IPF e di altre ILD fibrotiche, tra cui infiammazione polmonare, lesioni epiteliali, proliferazione di fibroblasti e eccessiva deposizione della matrice extracellulare^{(ECM) 6}. Inoltre, sia la fibrosi polmonare acuta che quella cronica possono essere modellate a seconda della dose e della frequenza della somministrazione di bleomicina. È stato riportato che i polmoni entrano in una fase infiammatoria acuta entro 5-7 giorni dall'esposizione alla bleomicina, seguita da una fase fibrotica che inizia intorno al settimo giorno. Entro il giorno 21, si osserva tipicamente un marcato rimodellamento fibrotico, che permette al modello di ripetere sia la risposta infiammatoria precoce sia la patologia fibrotica in fase avanzata in modo temporalmente^{definito 7} (Figura 1A). Questo permette di studiare l'intero processo patologico dalla lesione iniziale fino allo stadio fibrotico, molto importante per lo sviluppo dei farmaci e gli studi dei meccanismi in tutte le fasi ^8,9.

Le vie di modellazione della bleomicina sono diverse e possono essere somministrate localmente o sistemicamente, inclusi endotracale, nasale, endovenosi e intraperitoneali. La più comunemente utilizzata è l'iniezione endotracheale. Lo svantaggio è che crea incisioni nei topi, che influiscono sul tasso di sopravvivenza dei topi^{modellati 10}. Successivamente furono apportati miglioramenti per consentire l'uso di un ago residente per l'intubazione tracheale e l'iniezione a goccia nei^{topi 11}. Tuttavia, il farmaco somministrato dalla siringa può essere distribuito nei polmoni solo come blocco, il che può portare a una distribuzione disomogenea della bleomicina in ciascun lobo polmonare, producendo sovradensità locale e compromettendo la stabilità del modello murino. Inoltre, cartucce a nebulizzatore a camera sono state utilizzate per la somministrazione di bleomicina, ma la quantità di aerosol di bleomicina inalata in ogni topo non può essere quantificata con precisione, e il tempo di induzione singolo è^{lungo 12}. Pertanto, è stato sviluppato un metodo raffinato di somministrazione intratracheale di bleomicina basato su aerosol per modelli murini riproducibili e minimamente invasivi di fibrosi polmonare. La bleomicina viene aerosolizzata, permettendo una dispersione e una deposizione uniforme nei polmoni, riproducendo così meglio la patologia delle malattie polmonari. Si spera che l'emergere di questo metodo acceleri la ricerca su farmaci in grado di curare completamente la fibrosi polmonare.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state condotte secondo linee guida istituzionali approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Durante tutto l'esperimento furono adottate adeguate misure di benessere animale. Sono stati selezionati maschi C57BL/6 topi di età compresa tra 6 e 8 settimane, con un peso di circa 25 g, per l'esperimento. La Tabella dei Materiali elenca tutti gli animali, reagenti e attrezzature utilizzati in questo studio e le loro fonti commerciali.

1. Selezione e acclimatazione degli animali

1. Ospita tutti i topi in condizioni specifiche prive di patogeni con un ciclo di 12 ore di luce/scurezza e accesso ad libitum a cibo e acqua.
2. Acclimatare i topi alla struttura per 5-7 giorni prima di iniziare il modello a base di aerosol.

2. Preparazione della soluzione di bleomicina

ATTENZIONE: La bleomicina è un agente antitumorale citotossico. Esegui tutti i passaggi in un armadietto di biosicurezza certificato indossando i DPI appropriati.

1. Utilizzando una siringa sterile da 1 mL, preleva 3 mL di cloruro di sodio sterile allo 0,9% e iniettalo in una fiala contenente 15 U di cloridrato di bleomicina.
2. Fai ruotare delicatamente la fiala finché la polvere non si scioglie completamente per ottenere una soluzione di stock da 5 U/mL.
3. Aliquota la soluzione di serie in tubi microcentrifughe sterili da 1,5 mL. Prepara soluzioni operative di 3,75 U/mL e 2,5 U/mL diluendole con soluzione salina sterile.
   NOTA: Per un topo da 25 g, queste concentrazioni corrispondono rispettivamente a dosi di 7,5 U/kg e 5 U/kg. Regola le concentrazioni se il peso del mouse varia.
4. Conservare le soluzioni funzionanti a 4 °C per un massimo di 1 settimana o a -80 °C per un massimo di 1 mese. Scongela e porta a temperatura ambiente prima dell'uso.

3. Somministrazione intratracheale di bleomicina in aerosol

1. Preparazione e somministrazione dell'anestesia
   1. Preparare la soluzione anestetica di lavoro dissolvendo 0,1 g di polvere pentobarbital di sodio in 10 mL di soluzione fisiologica sterile. Filtra usando un filtro a membrana PES da 0,22 μm. Conservare la soluzione a 4 °C in un ambiente protetto dalla luce e utilizzare entro 3 giorni dalla preparazione.
   2. Somministrare la soluzione pentobarbital sodica tramite iniezione intraperitoneale utilizzando una siringa da 1 mL con ago calibro 26 a una dose di 60 mg/kg di peso corporeo. Se la profondità o la durata dell'anestesia non è sufficiente, si regola la dose in base alla risposta dell'animale sotto la guida del veterinario presente.
   3. Valuta la profondità dell'anestesia alcuni minuti dopo l'iniezione pizzicando saldamente il dito del piede e confermando l'assenza del riflesso di astinenza prima di procedere con le procedure successive.
2. Preparazione di apparecchiature di erogazione aerosol
   1. Prepara l'apparecchio di somministrazione dell'aerosol, assicurandoti che l'ago di nebulizzazione, la siringa di nebulizzazione e il pilastro di dosaggio siano tutti presenti e sterili (Figura 1B).
   2. Immergi la siringa di somministrazione in aerosol in soluzione salina sterile. Aspira lentamente il liquido e pausa per 8 secondi. Espelle il liquido rapidamente. Ripeti questo tre volte per riempire e svuotare il sistema.
   3. Riempi la siringa con soluzione salina dopo l'espulsione finale. Attacca l'ago aerosolizzante, assicurandoti che la giunzione sia riempita di soluzione salina.
   4. Immergi l'ago assemblato in soluzione salina e ripeti il ciclo di aspirazione-pausa-espulsione altre tre volte per eliminare le bolle d'aria.
      NOTA: Per confermare la prontezza, espellere la soluzione salina su uno sfondo scuro. Assicurati che la soluzione salina rapidamente espulsa formi una nebbia a ventaglio su uno sfondo scuro.
3. Procedura di somministrazione intratracheale in aerosol
   1. Prepara l'ago in aerosol con la soluzione di lavoro della bleomicina aspirandolo ed espellendolo tre volte con pause di 8 secondi.
   2. Inserire un pilastro di dosaggio da 25 μL sopra il pilastro da 50 μL per calibrare il volume. Aspirare il volume richiesto (50 μL). Espelle qualsiasi liquido in eccesso.
      NOTA: Questa configurazione di dosaggio garantisce una consegna coerente minimizzando l'errore umano.
   3. Posizionare il topo anestetizzato sulla piattaforma di intubazione, agganciare gli incisivi superiori e fissare gli arti con nastro per stabilizzarlo (Figura 1C).
      NOTA: Conferma movimenti ritmici del petto. Se l'animale appare attivo, somministrare una dose anestetica aggiuntiva.
   4. Usa delle pinze curve per estrarre delicatamente la lingua. Inserire un laringoscopio di piccolo animale per esporre la lotte (Figura 1D).
   5. Inserisci l'ago aerosolizzante verticalmente attraverso la glotte. Somministrare rapidamente l'aerosol della bleomicina (Figura 1E).
      NOTA: Inclina la punta dell'ago verso il polmone desiderato per una consegna mirata. Evita di inserire troppo in profondità per prevenire traumi. La punta dell'ago del nebulizzatore dovrebbe essere posizionata vicino ma senza toccare il punto di biforcazione (prima biforcazione) della trachea del topo per ottenere il miglior effetto di modellazione. Se la punta viene inserita solo al centro della trachea, l'aerosol può colpire solo la parete tracheale, formando grandi gocce che vengono tossite o inghiottite. Se la punta è troppo vicina alla biforcazione tracheale, c'è il rischio di danni tracheali.

4. Recupero post-procedura

1. Metti il mouse su un tappetino riscaldante per mantenere la temperatura corporea. Osserva il topo continuamente finché non si riprende dall'anestesia (tipicamente 1-2 ore).
2. Esegui un pizzicotto al dito del piede per controllare i riflessi e confermare che il topo sia vivo.
3. Effettua un monitoraggio clinico giornaliero per 21 giorni, includendo peso corporeo, livello di attività, cura personale e segni respiratori.
4. Eutanasiare gli animali quando sono soddisfatti uno dei seguenti criteri: (i) >20% di perdita di peso corporeo rispetto alla base pre-trattamento, oppure ≥15% di perdita accompagnata da altri segni clinici di disagio; (ii) persistente e grave difficoltà respiratoria a riposo (respirazione affannosa o addominale, marcata tachipnea o bradicnea, riacutizzazione nasale o respirazione a bocca aperta), con o senza cianosi degli arti; (iii) incapacità di ottenere cibo o acqua, marcata letargia o un aspetto moribondo (nessuna risposta alla manipolazione e/o perdita del riflesso di raddrizzamento); oppure (iv) grave disidratazione, ipotermia o altri segni di deterioramento irreversibile giudicati dal veterinario competente. Quando si raggiungono questi parametri umani, si fa eutanasia agli animali con un'overdose di pentobarbital sodio (≥150 mg/kg, i.p.), seguita da un metodo fisico secondario (ad esempio, lussazione cervicale), per garantire la morte e minimizzare dolore e disagio.

5. Misurazione della funzione polmonare terminale e raccolta dei tessuti

1. Al giorno 21, anestesiare il topo con 90 mg/kg di soluzione anestesica per indurre un'anestesia profonda e sopprimere la respirazione.
2. Conferma dell'anestesia completa con pizzicatura del dito del piede. Esponi la trachea tagliando la pelle e separando i muscoli.
3. Fai una piccola incisione smussato nella trachea e inserisci l'ago per intubazione. Fissare con una legatura chirurgica.
4. Trasferire il topo al ventilatore controllato da piccoli animali per meccanica polmonare controllata dal computer. Avvia la ventilazione meccanica e assicurati che non respiri spontaneamente. Utilizzare il sistema di ventilazione per misurare i parametri della funzione polmonare.
5. Eseguire la perfusione ventricolare destra con 5-10 mL di soluzione salina sterile finché i polmoni non sembrano sbolliti.
6. Disseziona tutto il polmone. Fissare il polmone sinistro in formalina neutra tamponata per 24 ore.
7. Immergere il tessuto polmonare fisso nella paraffina, sezionarlo ed eseguire la colorazione H&E, la colorazione tricroma di Masson e la colorazione immunoistochimica per COL1A1 e α-SMA.
8. Inserisci il polmone destro in un tubo di omogeneizzazione da 2 mL con delle sfere. Aggiungi acqua come previsto dal protocollo del kit di idrossiprolina. Omogeneizzare e procedere con il saggio.

Risultati

In questo studio, abbiamo proposto un metodo di somministrazione intrabronchiale basato su aerosol per indurre fibrosi polmonare nei topi utilizzando la bleomicina. Negli esperimenti preliminari, un colorante verde veniva aerosolizzato e somministrato ai polmoni di diversi topi. Il colorante mostrava un pattern di distribuzione maculato in tutti i polmoni, indicando che la somministrazione intrabronchiale basata su aerosol permetteva una dispersione uniforme dell'agente su tutti i lobi p...

Discussione

Questo studio propose un modello ottimizzato di nebulizzazione tracheale non invasiva della fibrosi polmonare indotta dalla bleomicina nei topi. Un piccolo laringoscopio per animali è stato utilizzato per localizzare la glotide e un piccolo ago di nebulizzazione è stato inserito nelle vie aeree del topo. La pressione è stata applicata manualmente per nebulizzare il farmaco nei polmoni, riducendo così il disagio e l'asfixiamento associati all'ago di ritenzione usato nell'iniezione non

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0.22 & mu; Filtro a siringa di polieterosolpone M	Cytosci	CSTPE3320
1 mL di siringa usa e getta	BD	300481
Tubo microcentrifuga da 1,5 mL	Servicebio	EP-150-M
Tubo di lisi rinforzato da 2,0 mL	Servicebio	HT-200-M
4 & deg; Frigorifero da laboratorio C	Meiling	BCD-402WPCX
Tubo centrifugo conico da 50 mL	Servicebio	EP-5001-J
-80 ° C Congelatore a temperatura ultra-bassa	Haier Biomedical	DW-86L828J
Etanolo assoluto	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	100092683
Soluzione di differenziazione acida	Servicebio	G1039
Microspruzzatore aerosol per l'intubazione di piccoli animali	Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd	Yan-30012
Set di strumenti chirurgici di base	Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd	YAN-21A3
Soluzione di cloridrato di bleomicina	Hanhui Pharmaceutical Co., Ltd	H20055883
Reagente di bluing	Servicebio	G1040
Ventilatore meccanico polmonare per piccoli animali controllato da computer	EMKA Biotech Beijing Co., Ltd.	FX-2
Nastro isolante elettrico	3M	1500
Soluzione di colorazione con eosina Y	Zhuhai Baso Biotech Co., Ltd	BA4022
Inchiostro verde per la marcatura	Pilota	Chiku-rin
Soluzione di colorazione con ematossilina	Servicebio	G1004
Kit per la quantificazione dell'idrossiprolina	Abcam	ab222941
Cappa a flusso laminare	HDL	DL-CJ-1N
Laringoscopio per procedure con piccoli animali	Shenzhen Bilead Biology Technology CO., LTD	DXSHJ0
Microscopio ottico	Nikon	E100
Soluzione di dewaxing a bassa tossicità	Servicebio	G1128
Kit di colorazione tricroma di Masson	Zhuhai Baso Biotech Co., Ltd	BA4079B
Lettore di micropiastre con rilevamento assorbanza	Agilent	Sinergia H1
Formalina tamponata a neutro	Servicebio	G1101-3ML
Mezzo di montaggio neutro	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10004160
Anticorpo Monoclonale Ricombinante del Coniglio Anti-COL1A1	Huabio	HA722517
Centrifuga refrigerata	Eppendorf	5424R
Acqua priva di RNasi	Generalbiol	TYJC002
Piattaforma di intubazione tracheale di piccoli animali	Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd	CG-02M
Soluzione sterile di cloruro di sodio allo 0,9%	China Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd	H12020024
Omogeneizzatore tissutale	Servicebio	KZ-III
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10023418
Perle di lenature in zirconia	Servicebio	G0203