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Articolo metodologico

Monitoraggio in tempo reale delle dinamiche indotte dall'agopuntura nel tessuto connettivo sottocutaneo tramite imaging confocale laser in vivo

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DOI:

10.3791/69173

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10 ottobre 2025

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1Institute of Acupuncture and Moxibustion, Jianghan University, 2School of Medicine, Jianghan University, 3Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo studio stabilisce l'imaging confocale laser in vivo come metodo in tempo reale per il monitoraggio delle dinamiche morfologiche indotte dall'agopuntura, come la vasodilatazione e il rimodellamento del collagene, nei ratti vivi. Utilizzando la marcatura con fluoresceina sodica, l'approccio cattura sia le risposte tissutali immediate che quelle ritardate, offrendo un nuovo strumento per valutare quantitativamente le terapie fisiche, tra cui l'agopuntura e la moxibustione.

Abstract

Il monitoraggio dinamico in tempo reale degli effetti dell'agopuntura è fondamentale per chiarire i suoi meccanismi biologici, ma i metodi istologici tradizionali non riescono a catturare le risposte transitorie nel microambiente vivo. Qui, abbiamo stabilito un quadro metodologico basato sull'imaging confocale laser in vivo , che consente l'osservazione ad alta risoluzione e in tempo reale dei cambiamenti morfologici nei tessuti locali dopo l'intervento di agopuntura. Dopo l'iniezione endovenosa di fluoresceina sodica nei ratti, durante l'agopuntura sono state rilevate alterazioni dinamiche della microcircolazione e della matrice extracellulare (ad esempio, disposizione delle fibre di collagene). I risultati hanno dimostrato che questo metodo distingueva chiaramente le reazioni tissutali immediate (ad esempio, vasodilatazione) e ritardate (ad esempio, risposta infiammatoria) indotte dall'agopuntura, con una risoluzione spaziale di 0,5 μm e una risoluzione temporale di 3,5 fps. La successiva analisi quantitativa ha permesso la misurazione oggettiva dei parametri morfologici. Questo protocollo, descritto in questo studio, fornisce uno strumento di visualizzazione per studi in vivo dei meccanismi di agopuntura e funge da riferimento tecnico per valutare gli effetti di altri stimoli fisici (ad esempio, la moxibustione).

Introduzione

L'agopuntura, come pietra miliare della medicina tradizionale, esercita effetti terapeutici attraverso complesse risposte a livello tissutale 1,2,3,4. Tuttavia, le incognizioni meccanicistiche rimangono limitate dall'istologia convenzionale, che cattura istantanee statiche ma non riesce a risolvere le dinamiche in tempo reale degli adattamenti morfologici (ad esempio, vasomodulazione, rimodellamento della matrice extracellulare) nel tessuto vivo5. Sebbene la microscopia intravitale offra un potenziale di imaging dinamico, la sua applicazione nella ricerca in agopuntura è scarsa, in particolare per quantificare le risposte spazio-temporali agli stimoli fisici 6,7. Al contrario, questo approccio di imaging confocale consente l'estrazione quantitativa di parametri strutturali e dinamici, come il tasso di variazione della velocità di movimento dei globuli rossi e la disposizione del collagene, nei tessuti profondi (ad esempio, strati muscolari e punti di agopuntura ST 36/GB 34), superando i limiti della microscopia intravitale convenzionale nella risoluzione spaziale, nell'imaging volumetrico e nel tracciamento a lungo termine8.

L'imaging confocale laser è emerso come un potente strumento per la visualizzazione in vivo a risoluzione cellulare 9,10,11,12,13. Tuttavia, gli studi esistenti si concentrano principalmente sui tessuti superficiali (ad esempio, pelle o cornea), con pochi che affrontano obiettivi di agopuntura profonda o integrano l'analisi morfologica quantitativa. Fondamentalmente, per quanto ne sappiamo, non esiste una metodologia standardizzata per correlare la manipolazione dell'agopuntura con i cambiamenti cinetici dei tessuti vivi.

Qui, colmiamo questa lacuna stabilendo una piattaforma metodologica basata sull'imaging confocale per il monitoraggio in tempo reale degli eventi morfologici indotti dall'agopuntura. Utilizzando la fluoresceina di sodio (somministrata per via endovenosa all'1% di concentrazione, 0,1 ml/100 g di peso corporeo) come mezzo di contrasto, otteniamo un monitoraggio ad alta risoluzione (0,5 μm di risoluzione spaziale/3,5 fps di risoluzione temporale) delle alterazioni del microcircolo e della matrice su un campo visivo di 450 μm × 450 μm fino a 400 μm di profondità, dalla vasodilatazione immediata alle cascate infiammatorie ritardate, durante la stimolazione dell'agopuntura. Questo approccio consente inoltre la ricostruzione 3D e la quantificazione dei parametri del riallineamento delle fibre di collagene, superando i limiti dell'istologia degli endpoint.

Le considerazioni pratiche per l'implementazione di questo protocollo sono (i) l'hardware raccomandato include un sistema confocale con risoluzione di ≥0,5 μm e velocità di acquisizione di ≥3 fps, (ii) le limitazioni tipiche includono il fotosbiancamento oltre i 90 s di imaging continuo e la sensibilità al movimento respiratorio o dei tessuti e (iii) la penetrazione in profondità può essere ridotta in tessuti altamente densi o dispersivi. Per quanto ne sappiamo, questo lavoro non solo fornisce il primo atlante dinamico della riorganizzazione tissutale evocata dall'agopuntura, ma stabilisce anche un precedente per la valutazione delle terapie fisiche (ad esempio, la moxibustione) nei sistemi vivi. Convertendo le risposte fisiologiche transitorie in metriche quantificabili, offriamo un nuovo paradigma per gli studi meccanicistici delle terapie neuromodulatorie.

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Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Etico Animale dell'Istituto di Agopuntura e Moxibustione, Accademia Cinese delle Scienze Mediche Cinesi (n. D2023-01-29-01). Otto ratti maschi Sprague Dawley (SD) (8 settimane di età, 200-220 g) sono stati ottenuti da Biotechnology Co., Ltd. (Licenza n. SCXK (Jing) 2020-0001). Gli animali sono stati alloggiati in recinti di isolamento sterilizzati in condizioni controllate: ciclo luce-buio di 12 ore, temperatura di 21 ±± 2 °C, con accesso ad libitum a pellet standard e acqua. Tutti gli esperimenti sono stati conformi alle linee guida istituzionali e alla Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

NOTA: Nella Figura 1 è riportato un diagramma di flusso che evidenzia le procedure principali.

1. Preparazione dell'animale e tracciante: Fluoresceina sodica (FS)

  1. Per preparare una soluzione colorante di fluoresceina sodica (FS) all'1%, sciogliere 0,1 g di FS in 10 mL di soluzione fisiologica sterile (NaCl 0,9%). Conservare la soluzione a temperatura ambiente (RT) per un uso successivo.
  2. Anestetizzare i ratti SD tramite induzione di isoflurano (induzione: 5% di isoflurano, mantenimento: 2,5% di isoflurano). Rimuovere i peli dalla regione cranica (esclusa la testina) utilizzando un tagliacapelli elettrico, quindi applicare la crema depilatoria per 5 minuti. Eliminare i residui di crema e peli risciacquando con acqua tiepida.
    NOTA: Mantenere la lama del tagliacapelli parallela alla superficie della pelle durante il funzionamento per evitare lesioni cutanee che potrebbero compromettere l'analisi quantitativa dell'imaging. L'acqua calda deve essere utilizzata rigorosamente per il risciacquo per evitare che l'ipotermia animale influisca sui risultati sperimentali.

2. Iniezione di FS

  1. Metti al sicuro il topo.
    1. Anestetizzare i ratti depilati mediante iniezione intraperitoneale di uretano al 10% (1 g/10 mL, in soluzione fisiologica) alla dose di 1,0 g/kg.
    2. Dopo aver ottenuto l'anestesia completa, fissare gli animali in posizione supina sulla piattaforma operativa. Applicare un leggero pizzicotto sulla zampa posteriore usando una pinza e osservare l'assenza di riflesso di ritiro. Verificare la perdita del riflesso corneale toccando leggermente la cornea con una punta di cotone umido.
    3. Confermare la mancata risposta prolungata e la frequenza respiratoria stabile prima di procedere con la procedura. Durante l'anestesia, mantenere la temperatura corporea dell'animale con un termoforo a 37 °C.
      NOTA: L'anestesia completa deve essere confermata per evitare movimenti involontari che comprometterebbero il riposizionamento della finestra di imaging.
  2. Somministrare per via endovenosa una soluzione di FS all'1% attraverso la vena caudale alla dose di 0,1 ml per 100 g di peso corporeo.
    1. Eseguire l'iniezione della vena caudale utilizzando una siringa da 1 ml dotata di un ago da 27 G. Strofinare delicatamente la coda con acqua tiepida per favorire la vasodilatazione, seguita da una disinfezione con etanolo al 70%.
    2. Inserire l'ago smussato verso l'alto con un angolo poco profondo (≤15°) lungo l'asse longitudinale della vena. Iniettare la soluzione lentamente a una velocità di 0,1-0,2 mL/min.
    3. Garantire un flusso tecnicamente privo di resistenza, l'assenza di edema perivascolare e confermare il successo dell'iniezione mediante lo scolorimento giallo delle pupille, dei padiglioni auricolari e delle zampe.
      NOTA: L'iniezione intra-arteriosa accidentale deve essere rigorosamente evitata.

3. Configurazione dell'endomicroscopia laser confocale con sonda in vivo (pCLE)

  1. Attivare il sistema pCLE e verificare la pulizia sia del connettore della sonda di scansione che della punta distale.
  2. Pulire la punta distale della sonda (detta anche punta di scansione) utilizzando un batuffolo di cotone inumidito con soluzione fisiologica, quindi asciugare delicatamente con un panno per lenti.
  3. Posizionare la sonda laser nel sito di osservazione del bersaglio (ad es. regione mediale della coscia). Fissare la sonda per imaging confocale utilizzando un morsetto regolabile, garantendo un contatto stabile con la superficie del tessuto senza artefatti di compressione, e fissarla serrando la manopola di regolazione.
  4. Collegare la sonda al sistema pCLE e configurare i parametri di acquisizione (ad es. campo visivo [FOV], directory di memorizzazione). I parametri specifici utilizzati in questo esperimento sono i seguenti:Profondità: 18 μm; Laser: 219 mW; Luminosità: 76%; Velocità: 1920 × 540; Guadagno: 2400; Zoom: 1× (464 μm); Filtro: LP 515; Tabella di ricerca: Scansione grigia.
    NOTA: I parametri di imaging (profondità di scansione/potenza laser) sono stati ottimizzati iterativamente fino a ottenere una visualizzazione distinta dell'architettura tissutale. L'intensità costante è fondamentale per la comparabilità longitudinale delle immagini. L'aggiunta di goccioline saline a 37 °C all'interfaccia sonda-tessuto ha eliminato la perdita di segnale osservata nelle iterazioni iniziali. La potenza del laser utilizzata in questo studio è inferiore alla soglia comunemente accettata per la fototossicità nell'imaging confocale in vivo .

4. Imaging della struttura organizzativa con pCLE e acquisizione

  1. Posizionare la sonda sulla superficie della pelle e avviare l'acquisizione dei dati per visualizzare l'architettura dei tessuti.
    1. Tenere la sonda con impugnatura a matita; manovrarlo verso le regioni target (ad esempio, aree con vascolarizzazione o tessuto connettivo fibroso all'interno del campo visivo), posizionare la punta distale direttamente sulla zona di imaging, quindi stabilizzare tramite il braccio della sonda.
  2. In primo luogo, acquisire l'architettura tissutale basale per 1 minuto in condizioni fisiologiche, seguito da 5 minuti di registrazione durante l'intervento di agopuntura. Terminare l'acquisizione dopo l'intervento. I file di dati vengono salvati automaticamente nella directory specificata nei passaggi 3.3-3.4.
    NOTA: I file vengono salvati come pile di livelli (.tiff) e singoli fotogrammi (.tiff).

5. Intervento di agopuntura

NOTA: L'acquisizione nella fase di imaging viene eseguita durante l'intervento.

  1. Inserire un ago monouso in acciaio inossidabile da 1 cun (l'unità di misura cinese è di circa 13 mm) nel punto di agopuntura adiacente al tessuto osservato dalla sonda. Collegare un elettrocatetere all'ago in acciaio inossidabile e fissare l'altro elettrodo di riferimento sulla coda del topo.
  2. Applicare la stimolazione con elettroagopuntura (EA) utilizzando i seguenti parametri: intensità 1 mA, onda densa dispersa (2/15 Hz), per 5 min.
    NOTA: Mantenere una distanza sufficiente (>3 mm) tra il sito di inserimento dell'ago e la sonda per evitare tremori dermici indotti da EA che compromettono la stabilità dell'immagine.

6. Analisi delle immagini

  1. Aprire le pile di immagini acquisite in ImageJ. Converti la calibrazione spaziale in micrometri e trasforma il formato dell'immagine a 8 bit per la compatibilità con i plug-in (tipo di > immagine > 8 bit).
    NOTA: Le dimensioni predefinite dell'immagine sono in pollici (impostazione specifica del sistema).
  2. Definire la regione di interesse (ROI) per: microcircolazione: singolo segmento capillare, struttura della matrice: regione delle fibre di collagene. Mantieni ROI identici su immagini sequenziali per coerenza longitudinale.
  3. Analisi del microcircolo
    1. Selezionare la regione contenente i globuli rossi che deve essere osservata e ritagliare l'immagine per rimuovere altre aree interferenti (Rettangolo > Immagine > Ritaglia). Utilizzare lo strumento soglia per segmentare esclusivamente i globuli rossi (RBC) (> immagine Regola > strumento Soglia).
    2. Carica il plug-in MTrack2 . Impostare i parametri di tracciamento appropriati in base alle dimensioni RBC (in questo esperimento, 10-42 pixel) per escludere interferenze e garantire un tracciamento RBC accurato (Plugin > Tracking > MTrack2).
  4. Analisi strutturale a matrice
    1. Carica il plug-in Direzionalità , seleziona la modalità componenti di Fourier ed esegui analisi statistiche sulla proporzione di distribuzione delle fibre di collagene con orientamenti da 0° a 180° (Analizza > direzionalità).

7. Finalizzazione dei dati

  1. Esporta i dati analizzati in formato TIFF/XSL utilizzando la convenzione di denominazione: [Gruppo]_[Data].estensione. Esegui il backup di tutti i file non elaborati e elaborati su un server sicuro designato. Registra gli output quantitativi in un foglio di calcolo riepilogativo per l'analisi statistica.

8. Sicurezza e gestione dei rifiuti

  1. Dispositivi di protezione individuale (DPI): indossare guanti in nitrile, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza quando si maneggia uretano, isoflurano o fluoresceina sodica.
  2. Manipolazione dell'anestesia: eseguire procedure che coinvolgono l'uretano o l'isoflurano all'interno di una cappa aspirante per ridurre al minimo l'esposizione all'inalazione.
  3. Precauzioni per oggetti taglienti: Smaltire immediatamente tutti gli aghi e gli oggetti appuntiti negli appositi contenitori per oggetti taglienti resistenti alla perforazione.
  4. Sicurezza dell'elettroagopuntura (EA): verificare l'isolamento elettrico delle apparecchiature EA e fissare i collegamenti dei cavi per evitare correnti di dispersione o cortocircuiti.
  5. Smaltimento dei rifiuti: Scartare i flaconi di isoflurano come rifiuti sanitari secondo le linee guida istituzionali. Smaltire i rifiuti di materiali contaminati da coloranti (ad es. tamponi, fazzoletti) in contenitori sigillati per rifiuti pericolosi. Raccogli gli oggetti taglienti in scatole per lo smaltimento di oggetti taglienti certificati.
    NOTA: Tutte le procedure devono essere conformi alle norme istituzionali di sicurezza e salute ambientale.

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Risultati

Questo protocollo dimostra l'utilità del pCLE per la valutazione dinamica in tempo reale degli effetti dell'agopuntura sulla microcircolazione e sull'architettura della matrice extracellulare. Dopo somministrazione endovenosa di fluoresceina sodica attraverso la vena caudale, i cambiamenti sono stati valutati osservando alterazioni della velocità degli eritrociti all'interno dei capillari locali e la riorganizzazione della disposizione delle fibre di collagene.

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Discussione

Come dimostrato nei risultati, il protocollo di imaging confocale in vivo stabilito in questo studio consente l'analisi quantitativa simultanea della dinamica della matrice microcircolatoria ed extracellulare durante l'intervento di agopuntura utilizzando apparecchiature standard disponibili in commercio e marcatura fluorescente di routine. Il successo di questo protocollo si basa su due passaggi fondamentali: la tempistica precisa dell'iniezione di fluoresceina di sodio, che ga...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata finanziata dal National Key Research and Development Program of China (2024YFA1209900, 2024YFA1209903, 2024YFA1209904); Fondi speciali della Fondazione nazionale per le scienze naturali della Cina (82050006); Progetto di ricerca sulla MTC dell'Amministrazione della Medicina MTC della Provincia di Hubei (ZY2025Z015); Il Fondo di ricerca dell'Università di Jianghan (2024JCYJ13).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1 cun ago per agopunturaHwato, Suzhou, CinaN/A13 mm/0,25 mm
10% di fluoresceina sodicaGuangxi Wuzhou Pharmaceutical Co Ltd, CinaH45021477
Macchina per anestesia animaleRWD, Shenzhen, CinaR620IE
Misuratore di temperatura corporeaRWD, Shenzhen, Cina69026
Apparecchio elettrico per agopunturaHwato, Suzhou, CinaSDZ-III
Crema depilatoriaVeet, Francia
ImmagineJIstituti Nazionali di Sanità, Stati Unitihttps://imagej.nih.gov/ij/
Endomicroscopia laser confocale con sonda in vivoOptiscan, AustraliaViewnVivoB30Diametro: sonda rigida portatile da 4 mm, resistente alla flessione e mantiene l'integrità strutturale nel tempo. Lunghezza: ≥ 46 mm. Modalità di scansione: capacità di scansione zoom.
IsofluranoRWD, Shenzhen, Cina
R510-22-16
UretanoSigma-Aldrich, Stati Uniti94300

Riferimenti

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