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Articolo metodologico

Stabilire un modello suino per studiare la preservazione dinamica e il trapianto del trapianto oculare completo

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DOI:

10.3791/69179

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25 novembre 2025

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1Center for Engineering in Medicine and Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Children's Boston, 3Plastic Surgery Research Laboratory, Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 4Department of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery, Hospices Civils de Lyon, 5Department of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery, CHU de Rennes, University of Rennes, 6Faculty of Medicine and Health Sciences, University of Antwerp, 7Bioengineering Research Group, Cardiff Metropolitan University, 8Collaboration for the Advancement of Sustainable Medical Innovation, University College London, 9Division of Plastic Surgery Research, Vascularized Composite Allotransplantation Program Development, Cedars-Sinai Hospital

In questo articolo

Sommario

Viene descritto un modello dettagliato e riproducibile di trapianto oculare intero (WET) su suini, dal procuramento chirurgico all'inizio della perfusione a macchina, permettendo lo studio della preservazione dinamica del WET nei trapianti.

Abstract

Il primissimo Trapianto Oculare Completo (WET) umano ha acceso nuove speranze ai pazienti che hanno perso la vista a causa di gravi lesioni oftalmiche, ma restano sfide significative da affrontare prima che il ripristino della vista tramite WET possa diventare possibile. Tra queste, una delle sfide più critiche è la conservazione ex vivo . Il bulbo oculare, in particolare i suoi componenti neurali come la retina e il nervo ottico, subisce una degenerazione rapida e irreversibile nel giro di pochi minuti, a meno che non si garantisca una corretta conservazione. La conservazione statica a freddo (SCS) rimane il punto di riferimento per l'allotrapiante composito vascolarizzato (VCA), ma non è adatta alla conservazione ex vivo in umidità a causa della sua incapacità di sopprimere o sostenere sufficientemente il metabolismo, causando perdita di vitalità e funzione dell'innesto. La perfusione subnormotermica delle macchine (SNMP) si è rivelata un'alternativa promettente alla SCS, offrendo il potenziale non solo per preservare gli innesti ma anche per ricondizionarli. Il nostro gruppo ha trasdotto con successo SNMP dal trapianto di organi solidi a diversi modelli VCA, dimostrandone la fattibilità e i vantaggi. In questo caso, riportiamo l'applicazione del SNMP per preservare un WET nei suini, dettagliando il modello anatomico e il protocollo di conservazione. Questo approccio rappresenta un passo significativo avanti nell'ottimizzazione delle tecniche di conservazione e trapianto del WET.

Introduzione

Gli allotrapianti compositi vascolarizzati (VCA) rappresentano un significativo progresso nella chirurgia ricostruttiva, offrendo risultati estetici e funzionali senza pari per i pazienti con lesionicomplesse 1,2. Tuttavia, la perdita della vista legata al bulbo oculare rimane una delle principali cause di compromissione nelle lesioni al volto. Il recente primo trapianto completo dell'occhio (WET) ha acceso nuove speranze ai pazienti 3,4. Sebbene la vista non sia stata recuperata, l'imaging funzionale ha dimostrato l'attivazione corticale in risposta alla stimolazione luminosa, e l'elettroretinografia (ERG) ha indicato una risposta fotorecettore attenuata ma riconoscibile alla luce5. Nonostante risultati tecnici eccezionali, restano sfide sostanziali da affrontare per rendere la WET funzionale una realtà clinica. Il bulbo oculare è altamente sensibile all'ischemia, e la retina e il nervo ottico subiscono una degenerazione irreversibile entro pochi minuti dal tempo di ischemia calda (WIT) a meno che non vengano mantenuti livelli di ossigenazione e pHadeguati 6. Pertanto, la WET presenta sfide specifiche all'interno del campo VCA, e devono essere considerati molteplici fattori, inclusi sia il segmento posteriore che quello anteriore, oltre alle componenti extraoculari. In particolare, la muscolatura è fondamentale per ottenere risultati funzionali positivi, poiché è altamente suscettibile a lesioni da ischemia calda, ulteriormente aggravate dalla ischemia-reperfusione 7,8. La privazione di ossigeno porta a danni cellulari e al rilascio di pattern molecolari associati al danno (DAMP). Al momento della reperfusione, questi DAMPs attivano il sistema immunitario del ricevente, scatenando infiammazione e infiltrazione delle cellule immunitari. Questo ambiente infiammatorio accelera il rigetto promuovendo la presentazione dell'antigene e l'attivazione delle celluleT 9. Oltre a superare sfide come la riconnessione del nervo ottico, il WET richiederà tecniche di perfusione ex vivo ottimizzate per prevenire danni derivanti da WIT o da stoccaggio statico a freddo (SCS) e infine per ottenere il ripristino della vista 5,7,9,10,11.

La perfusione a macchina (MP) è ben consolidata nel trapianto di organi solidi come metodo per prevenire lesioni ischemiche-reperfusione 12,13,14, con la perfusione macchina subnormotermica (SNMP) che ha mostrato risultati superiori rispetto alla SCS in vari modelli 15,16,17. Abbiamo tradotto con successo SNMP su modelli animali che vanno dai roditori18,19 aisuini 20,21,22 e, recentemente, ai primati non umani 23. SNMP non solo ha dimostrato la sua efficacia nella conservazione degli innestosi per lunghi periodi, ma ha anche mostrato potenziale nel ricondizionamento dell'innesto e nella mitigazione delle lesioni ischemiche calde, consentendo una repiantumazione sicura fino a 24 ore dopol'acquisizione 24,25. Grazie alla sua capacità di mantenere parzialmente il metabolismo cellulare, il SNMP apre anche nuove strade trasformando la fase di conservazione in una piattaforma diagnostica, terapeutica e di precondizionamento che può essere integrata nei protocolli di reimpianto e trapianti nel VCA. Abbiamo sviluppato un protocollo SNMP ottimizzato specificamente per i VCA e l'abbiamo applicato a questo scenario complesso di trapianto oculare.

In questo studio, il SNMP viene impiegato per la conservazione dinamica e ossigenata degli organi a temperatura ambiente (circa 20 °C). Questa tecnica utilizza una pompa peristaltica e un ossigenatore per far circolare e ossigenare il perfuso. Viene utilizzato un modello suino, altamente rilevante per studi sul trapianto e la conservazione di WET grazie alle sue somiglianze fisiologiche con l'uomo, dimensioni comparabili dei vasi e all'assenza unica di una parete orbitalelaterale 26,27,28. Questa caratteristica la rende particolarmente adatta per esperimenti ex vivo e studi di allotrapiante, poiché l'arteria carotide esterna e l'arteria oftalmica sono direttamente collegate, permettendo di ottenere il WET esclusivamente tramite l'arteria carotide esterna e le vene giugulari senza richiedere dissezione intracranica per esperimenti ex vivo e in vivo repiantumazione ortotopica o eterotopica. Il prelievo viene effettuato dopo la morte circolatoria, in linea con i protocolli di donazione dopo la morte cardiaca e consentendo un ritardo nel prelievo fino al prelievo di altri organi solidi. Questo modello, quindi, esplora ulteriormente il potenziale del SNMP nel ricondizionamento di innesti altamente sensibili dopo ischemia calda e supporta lo sviluppo di tecniche di conservazione del WET all'interno di laboratori di trapianti già consolidati che si concentrano su altri organi, aderendo ai principi "3-R" di raffinamento, riduzione esostituzione 29,30. Inoltre, rimane rilevante per gli acquisti a ritmo cardiaco seguendo passaggi simili. L'obiettivo è stabilire un modello di conservazione affidabile basato sui pedoli carotidi e giugulari esterni e valutarne la fattibilità per una conservazione dinamica. Sono previsti passaggi procedurali dettagliati, che comprendono l'approvvigionamento della corruzione, la conservazione e gli aspetti chiave dell'attuazione del SNMP.

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Protocollo

L'approvazione istituzionale per questo studio è stata ottenuta dal Comitato locale per la Cura e l'Uso degli Animali Istituzionali (protocollo #2024N000205). Tutto il lavoro sugli animali seguiva le linee guida31 di Ricerca sugli Animali: Segnalazione degli Esperimenti In Vivo ed era conforme alle raccomandazioni dell'Ufficio di Revisione e Cura degli Animali dell'Esercito degli Stati Uniti (ACURO)32. Tutti i WET sono stati acquistati da suini sottoposti a procedure terminali di approvvigionamento di organi, seguendo i principi "3-R" 33. Gli animali del peso compreso tra 30 kg e 50 kg sono stati soppressi per dissanguinazione dopo aver ricevuto 100 IU/kg di eparina, e per gli esperimenti sono stati utilizzati innesti di wethumo lasciato. I WET giusti fungevano da controlli. L'acquisizione degli organi è avvenuta post-mortem con meno di 180 minuti di ischemia calda. Consulta la Tabella dei Materiali per dettagli su tutti i reagenti e le attrezzature utilizzate nel protocollo.

NOTA: I dati sono stati registrati in un foglio di calcolo (ad esempio Excel) e le analisi statistiche sono state condotte utilizzando un software statistico appropriato (ad esempio, GraphPad Prism). Il rischio di alpha era fissato al 5% ed era a due code. Per ogni variabile monitorata, sono stati determinati la media e l'errore standard della media. Il test di Spearman è stato utilizzato per studiare le correlazioni tra i parametri di perfusione.

1. Preparazione della perfusione a macchina (1 giorno prima dell'esperimento)

  1. Installare il sistema di perfusione a macchina34 (vedi Figura 1).
    1. Assemblare i componenti del sistema di perfusione: pompa, ossigenatore, trappola bolle, sensore di pressione continua e sensore di peso.
      NOTA: La lunghezza del tubo deve essere mantenuta al minimo necessario per assemblare tutti i componenti dell'allestimento. Una volta assemblato, tieni presente che la calibrazione della pressione è specifica per il sistema, in particolare per la lunghezza dei tubi.
    2. Collega il sistema come un circuito semi-chiuso di ricircolazione in modo da pompare il perfuso dal serbatoio nell'ossigenatore, quindi nell'afflusso dell'innesto (arteria carotide). L'uscita venosa defluisce nuovamente nel serbatoio (Figura Supplementare 1 e Video Supplementare 1).
    3. Collega il sensore di pressione al tubo di affluente.
    4. Posizionare l'innesto sulla piattaforma tridimensionale (stampata in 3D) posizionata sulla bilancia elettronica.
    5. Collega sia la bilancia che il sensore di pressione al microcontrollore.
    6. Collegare il microcontrollore al computer dell'operatore per il monitoraggio in tempo reale e la registrazione continua dei dati.
    7. Prepara la termocamera per il monitoraggio della temperatura.
      NOTA: Il monitoraggio del peso, come surrogato per la formazione dell'edema, è cruciale poiché rappresenta un indicatore precoce di lesioni dell'innesto durante laperfusione 35.
  2. Pulire accuratamente i componenti del circuito prima di iniziare la perfusione e prestare particolare attenzione all'ossigenatore, soprattutto se è stato usato più volte.
    1. Inizia risciacquando tutti i tubi separatamente con etanolo al 70%, poi con acqua deionizzata sterile.
    2. Assemblare il sistema e far circolare 2 L di acqua sterile deionizzata per lavare l'ossigenatore a una portata di 50-100 mL/min, se è già stato utilizzato.
      NOTA: Per studi di ripiantumazione di animali vivi, utilizzare un nuovo ossigenatore sterile e sterilizzare tutti gli altri componenti di perfusione con ossido di etilene (ETO)
  3. Prepara la soluzione perfusa. Per la perfusione subnormothermica delle macchine, si utilizza una soluzione Steen+ ottimizzata perVCA 24,34,36. In totale, utilizzare 1,5 L per innesto, seguendo la composizione dettagliata precedentementeriportata 34.
  4. Aggiungi una soluzione di idrossido di sodio al perfusato per ottenere un pH di 7,5-7,6. Imposta questo valore iniziale volutamente alto, poiché il pH diminuirà durante la circolazione quando la miscela di carbogeni (95% ossigeno, 5% anidride carbonica) si dissolve.
  5. Calibrare i sensori di peso e pressione per garantire misurazioni accurate.
    1. Taglia la bilancia per tenere conto del peso della piattaforma.
    2. Per misurare con precisione la pressione vascolare, calibrare il sistema secondo il manometro e la portata del catetere utilizzati: misura la pressione del sistema per ogni dimensione di catetere che può essere utilizzata a intervalli di flusso regolari (ogni incremento di 0,5 mL, da 0 a 20 mL/min).
    3. Durante gli esperimenti, per calcolare la pressione arteriosa, si sottrae la pressione di calibrazione dalla pressione totale che viene misurata. La tabella di calibrazione utilizzata in questi esperimenti è fornita come esempio (Figura Supplementare 2).
      NOTA: La calibrazione è specifica per ogni configurazione. Ripeti la calibrazione dopo qualsiasi modifica di tubo, ossigenatore o perfuso, poiché queste modifiche possono modificare la pressione del sistema.

2. Approvvigionamento post-mortem di WET

NOTA: Per simulare la donazione dopo la morte cardiaca e/o l'autopsia, l'animale dovrebbe essere soppresso secondo le linee guida locali dell'IACUC. Preferisci l'essanguinazione all'iniezione endovenosa di pentobarbital per evitare tossicità da farmaci che potrebbero interferire con lo studio.

  1. Tieni l'animale soppresso in posizione prona. Radela e strofina la zona della testa e del collo e posiziona tende sterili.
    NOTA: Il modello anatomico è presentato nella Figura 2, e una guida di dissezione passo dopo passo è fornita nel File Supplementare 1.
  2. Disegna i segni cutanei del lembo.
    1. Assicurati che le marcature consistano in una linea intorno all'orbita, a 2 cm dal bordo orbitale, e un'incisione estesa di 1 cm sotto il canto laterale verso il collo.
    2. Eseguire l'incisione con un bisturi n°23 attraverso la pelle e il tessuto sottocutaneo fino all'osso nelle parti superiore e inferiore dell'orbita, incluso il periosto. Alle parti anteriore e posteriore del lembo, assicurarsi che l'incisione raggiunga il piano fasciale.
  3. Inizia la dissezione con l'aspetto anteriore dell'orbita usando forbici Stevens e una pinza Adson.
    1. Elevare il contenuto orbitale in un piano subperiostale verso le pareti orbitali con un elevatore periostale.
    2. Identificare e dividere le strutture vicine alla parete orbitale usando un bisturi a lama n°15, inclusi le inserzioni del muscolo obliquo e il plesso venoso orbitale, che esce dall'orbita per unirsi alla vena frontale.
      NOTA: La vena frontale drena nella vena facciale, che può essere sacrificata per risparmiare tempo, a condizione che il ramo anastomotico con la vena oftalmica venga preservato.
  4. Continuare la dissezione sull'aspetto posteriore dell'orbita. Con un bisturi, si reseziona il muscolo massetero all'inserimento zigomatico, seguito dal ramo ascendente della mandibola con un tagliaosso di Liston. Disarticolare manualmente il condilo ruotando esternamente il frammento della mandibola.
  5. Dividere il legamento orbitale che si estende dal processo zigomatico all'osso frontale per accedere alla porzione orbitale del muscolo temporale. Dissezionare il muscolo temporale.
  6. Con un elevatore periosteale, si crea un tunnel subperiosteale sotto l'arco zigomatico verso il margine orbitale anteriore. Usa una sega a pistone per tagliare l'osso. Identificare l'arteria oftalmica che si trova nella porzione inferolaterale del cono orbitale sotto il muscolo temporale.
  7. Risezionare l'arco zigomatico e le pareti orbitali antero-inferiori usando un rongeur.
    NOTA: Questi passaggi forniscono accesso all'aspetto inferolaterale del cono orbitale e al suo pedicolo vascolare.
  8. Identificare e dissezionare con forbici Stevens fini e forze microchirurgiche entrambi i rami dell'arteria oftalmica man mano che entrano nel contenuto orbitale.
    NOTA: La maggior parte dei vasi (arteria carotide esterna e vena giugulare superficiale) si trova sotto la mandibola, ad eccezione della vena facciale, che è superficiale rispetto alla mandibola.
  9. Dopo aver isolato la lunghezza desiderata dell'arteria carotide esterna e della vena giugulare, completare la dissezione sezionando il nervo ottico, i nervi oculomotori e il pedacolo vascolare con un bisturi.

3. Preparazione alla perfusione

  1. Su un tavolino laterale, dilatare l'arteria carotide usando un dilatatore microchirurgico e inserire un angiocatere. Fissa la canulazione con cravatte di seta 3-0.
    NOTA: In questo protocollo, per tutte le arterie veniva utilizzato un angiocatetere 18-G. Se il pedicolo arterioso è corto, bisogna fare attenzione a non inserire troppo il catetere per evitare la cannulazione selettiva di uno dei due rami oftalmici. La vena giugulare non deve essere canulata a meno che non venga utilizzato un sistema di perfusione a anello chiuso, cosa che non avveniva in questo protocollo.
  2. Per lavare l'arteria carotide, si utilizza una siringa da 10 mL montata con un sensore di pressione identico a quello usato per la perfusione. Usa 10 mL di eparina (100 unità UI/mL) per lavare i vasi in modo che l'uscita sia libera. Rimani sotto i 35 ± 5 mmHg, poiché l'alta pressione può portare a lesioni microvascolari e fallimento della perfusione.

4. Perfusione subnormotermica delle macchine

  1. Collegare l'arteria canulata dell'innesto al tubo di afflusso del sistema di perfusione della macchina e inserire l'innesto nella scala.
  2. Avvia la pompa impostata a 2-4 mL/min.
    NOTA: Il flusso di perfusione e i tassi di pressione dipendono dal protocollo utilizzato. Per l'ACV, si utilizza un regime stabile e a basso flusso per prevenire danni capillari e formazione di edema.
  3. Valutare i parametri di vitalità in ogni punto temporale predefinito sia in ingresso che in uscita utilizzando una siringa da 1 mL e analizzando campioni con la macchina del sistema gassesimo (ad esempio, metriche di gas nel sangue [pH, pCO2,pO 2, lattati, eccesso di basi, bicarbonato], glucosio, sodio, potassio, calcio, cloruro). Questo ci permette di calcolare lo stato metabolico dell'innesto secondo le equazioni presentate nella Tabella 1.
    NOTA: In questo protocollo, la perfusione dura 18 ore, e i campioni dall'afflusso e dall'uscita vengono prelevati ogni ora per le prime 6 ore e poi ogni 3 ore per le restanti 12 ore.

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Risultati

Un test preliminare di fattibilità è stato condotto in un periodo di 6 ore di SNMP, seguito da 2 ore di perfusione di macchine normotermiche (NMP) con sangue intero per valutare la corretta reperfusione dell'intero innesto e simulare il reimpianto. Durante la fase SNMP, è stato osservato un flusso costante in uscita e la successiva simulazione di reperfusione del sangue totale ha dimostrato una ricolorazione riuscita dell'intero innesto. I parametri di perfusione confermarono ulteriormen...

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Discussione

Più di due decenni dopo i primi casi clinici, il VCA continua ad affrontare significative sfide immunologiche e di conservazione ex vivo , limitandone la vasta disponibilità37. Queste sfide sono ancora più evidenti nel caso del WET, che offre prospettive entusiasmanti per il ripristino della vista ma presenta ostacoli unici, come il raggiungimento di una riconnessione efficace del nervo ottico, la preservazione della funzionalità sia dei segmenti anterior...

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Dichiarazioni

Alcuni autori dichiarano interessi contrastanti. I dottori Uygun, Lellouch e Cetrulo hanno presentato domande di brevetto rilevanti per questo studio. I dottori Korkut Uygun e Basak Uygun hanno interessi finanziari e fanno parte del Comitato Consultivo Scientifico di Sylvatica Biotech Inc., un'azienda focalizzata sullo sviluppo di tecnologie per la conservazione degli organi ad alto livello di zero (sub-zero). Gli interessi concorrenti per gli investigatori MGH sono gestiti dal MGB in conformità con le loro politiche di conflitto di interessi. Tutti gli autori rimanenti dichiarano di non avere conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dai National Institutes of Health con il premio n. R01AR082825 (BEU), R01EB028782 (KU), DoD RTRP RT240044 (KU, AGL, CLC), Shriners Children's 84308 (YB) e il sotto-premio ARPA-H FY25.1065.001 (CLC), e dalla National Science Foundation con il Grant No. EEC 1941543 (KU). HO e YB ricevettero finanziamenti dalla Fondation des Gueules Cassées. Il sostegno della Société Française de Chirurgie Plastique, Reconstructrice et Esthétique (SOFCPRE, Francia) a HO e YB è molto apprezzato.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Pinza AdsonStrumenti scientifici di qualità11019-12Strumento chirurgico
Sistema di ossigenazione Affinity PixieMedtronicBBP241Ossigenatore
Angiocath (24 G)Becton Dickinson381112Catetere per canulazione
Albumina sierica di BovinSigma-AldrichA9647Componente di perfusazione
Cloruro di calcio diidratoSigma-Aldrich223506Componente di perfusazione
Anidride carbonica OssigenoAirgasUN3156Miscela di anidride carbonica e ossigeno   gas 
Catete 24 GDutscher921048Canulazione arteriosa
D-(+)-Glucosio monoidratoSigma-Aldrich49159Componente di perfusazione
DesametasoneSigma-AldrichD2915Componente di perfusazione
DextranoTermoscientifica406271000Componente di perfusazione
Pinza dilatatriceAROSurgical11.946.1102Strumento chirurgico
Excel MicrosoftFoglio di calcolo
Iniezione di eparina sodioEugia Pharma63739-953-25Componente di perfusazione
Humulin Insulina Regolare umanaLilly0002-8215-01Componente di perfusazione
Idrocortisone sodio succinatoPfizer0009-0011-03Componente di perfusazione
LigaclipEthiconMCS20Clip vascolari chirurgiche
Tagliaossa di ListonStrumenti scientifici di qualità16104-19Strumento chirurgico
Cloruro di magnesio esaidratoSigma-AldrichM9272Componente di perfusazione
MasterFlex L/SCole-Parmer77200-32Pompa a rulli
Pinze microchirurgicheStrumenti scientifici di qualità11253-20Strumento chirurgico
Ascensore periostaleAROSurgical46.415.18Strumento chirurgico
Polietilenico glicole 35000Sigma-Aldrich25322-68-3Componente di perfusazione
Cloruro di potassioSigma-Aldrich7447-40-7Componente di perfusazione
Monitor di pressione, portatile, PM-P-1Strumentazione dei Sistemi ViventiPM-P-1Sensore di pressione
Prism GraphPadv. 10.1.1Software di analisi statistica
Radnoti  Camera di conformità con trappola a bolleRadnoti130149Trappola a bolle
RAPIDPoint 500Siemens500Sistema di gas ematico
Sega reprocandoStryker5100-37Strumento chirurgico
RongeurStrumenti scientifici di qualità16002-18Strumento chirurgico
Lama per bisturi (n15)Strumenti scientifici di qualità10015-00Strumento chirurgico
Lama da bisturi (n23)Strumenti scientifici di qualità10023-00Strumento chirurgico
Sutura di seta 3-0EthiconP683HSutura
Bicarbonato di sodioSigma-AldrichS5761Componente di perfusazione
Cloruro di sodioSigma-AldrichS9888Componente di perfusazione
Idrossido di sodioSigma-Aldrich72068Componente di perfusazione
Fosfato di sodio monobasique diidrato Sigma-Aldrich71505Componente di perfusazione
Forbici StevensAROSurgical07.367.13Strumento chirurgico
Siringa 1 mLBD309659Approvvigionamento di campioni
Siringa 10 mLDutscher300912Riscatto dell'innesto
Camera termicaFlir Onehttps://www.flir.fr/products/flir-one-gen-3/?vertical=condition+monitoring&segment=solutionsMonitoraggio della temperatura di perfusione
Tubing (n° 16)Masterflex13-310-282Configurazione della perfusione a macchina
Vancomicina cloridratoSlate run pharmaceuticals70436-021-82Componente di perfusazione

Riferimenti

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