Articolo metodologico

Dissezione dei muscoli di volo indiretti di Drosophila melanogaster per approcci di microscopia

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DOI:

10.3791/69185

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7 novembre 2025

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1Division of Biological and Biomedical Systems, School of Science and Engineering, University of Missouri Kansas City

In questo articolo

Sommario

La Drosophila è un potente modello per comprendere i meccanismi fondamentali della miogenesi. Questo protocollo per la dissezione e la preparazione di emisezioni toraciche, consente l'analisi al microscopio del muscolo del volo indiretto sia dallo stadio pupale che da quello adulto. Questo protocollo consente l'imaging confocale della morfologia cellulare, della localizzazione delle proteine, della struttura muscolare e di molti altri aspetti della miogenesi.

Abstract

I muscoli del volo indiretto (IFM) di Drosophila melanogaster sono un potente modello genetico per esplorare i principi fondamentali della miogenesi. Il meccanismo contrattile e molti componenti sarcomeri sono conservati dalle mosche ai vertebrati, consentendo lo studio dei processi cellulari dalla regolazione trascrizionale e dall'elaborazione dell'RNA al metabolismo e alla meccanobiologia che dirigono e regolano lo sviluppo muscolare. Molte di queste vie cellulari sono alterate nelle miopatie umane e gli studi IFM forniscono informazioni rilevanti sull'eziologia molecolare della malattia muscolare. In particolare, i moscerini sono adatti per la microscopia per analizzare la morfologia e la funzione delle miofibre e dei sarcomeri nell'intero processo di miogenesi IFM, dalla specifica dei mioblasti alla formazione, maturazione e mantenimento delle miofibrille. Qui, viene presentato un protocollo per la dissezione delle IFM di D. melanogaster a intervalli di tempo pupali e adulti per approcci microscopici. Vengono forniti protocolli illustrati per la dissezione dell'emitorace di IFM pupali e adulte tardive, nonché per la dissezione a libro aperto di IFM pupali precoci. Vengono descritte le procedure di fissazione, colorazione e montaggio del campione e gli artefatti comuni di dissezione, con dati rappresentativi che dimostrano la compatibilità della dissezione IFM con diversi reagenti di fissazione. Questi protocolli vengono applicati per studiare l'allele ipomorfico SmnE33 del motoneurone di sopravvivenza della proteina legante l'RNA (Smn) a 26 ore dopo la formazione del pupario (APF), 72 ore di APF e negli IFM adulti, fornendo nuove informazioni su un modello di atrofia motoria spinale (SMA) e illustrando l'utilità generale di questo protocollo. Questo protocollo dettagliato facilita l'accesso al sistema modello IFM e l'acquisizione di dati di microscopia di alta qualità per studiare i principi della miogenesi.

Introduzione

Gli animali hanno centinaia di muscoli che controllano diversi movimenti, dalla deambulazione alla facilitazione del linguaggio all'afferrare uno strumento. Per supportare una così ampia gamma di funzioni, i muscoli differiscono per dimensioni, attaccamento, capacità contrattile, metabolismo ed espressione genica1. Un obiettivo importante nel campo della biologia muscolare è la comprensione di come queste differenze strutturali e funzionali sorgono durante lo sviluppo e vengono alterate nella malattia muscolare2. La contrazione muscolare è alimentata da sarcomeri costruiti con filamenti sottili contenenti actina ancorati al disco Z che si interdigitano con filamenti spessi contenenti miosina bipolare ancorati alla lineaM 3. I sarcomeri sono organizzati end-to-end in miofibrille e questa disposizione regolare nel muscolo striato appare come bande chiare e scure alternate al microscopio4, fornendo un metodo visivo pratico per monitorare i cambiamenti nell'assemblaggio e nell'organizzazione dei sarcomeri. In combinazione con la genetica e gli approcci biochimici, la microscopia ha fornito importanti informazioni sui processi cellulari come la regolazione trascrizionale, l'elaborazione dell'RNA, il metabolismo e la meccanotrasduzione 5,6,7 che istruiscono e regolano lo sviluppo e la funzione muscolare. Molti di questi processi cellulari sono interrotti nelle miopatie umane e nei disturbi neuromuscolari 8,9, sottolineando l'importanza di comprendere lo sviluppo muscolare per ottenere informazioni sull'eziologia della malattia muscolare. I progressi nell'ingegneria genetica, che consentono la manipolazione di singole cellule e la marcatura endogena delle proteine10,11, insieme ai progressi tecnologici nell'acquisizione e nella risoluzione delle immagini12,13, garantiscono la continua importanza della microscopia per la ricerca muscolare. I sistemi modello con protocolli chiari e facilmente implementabili per la dissezione muscolare e la preparazione dei campioni sono quindi preziosi nel campo muscolare.

I muscoli del volo indiretto (IFM) di D. melanogaster sono un modello potente e ben caratterizzato per studiare i principi di base della miogenesi8. Le IFM sono costituite da sei muscoli dorsale-longitudinali (DLM) per emitorace che si formano su modelli muscolari larvali e sette fibre muscolari dorso-ventrali (DVM) che vengono costruite de novo durante lo sviluppo della pupa14. A causa della loro accessibilità vicino alla linea mediana, molti studi IFM si concentrano sui DLM, il muscolo più grande nei moscerini adulti che copre l'intera lunghezza di 1 mm del torace15. All'inizio dell'impupamento, i mioblasti IFM migrano dalla loro nicchia sulla cerniera del disco alare al torace, dove si fondono per formare miotubi sinciziali16. Dopo l'attacco del tendine a circa 24 ore APF a 27 °C, le miofibre IFM organizzano progressivamente il citoplasma e il citoscheletro, si compattano e iniziano la miofibrillogenesi da 30-32 ore APF17. Nuovi sarcomeri vengono aggiunti alle miofibrille e le miofibre crescono fino a riempire il torace fino a circa 48 ore APF. Le IFM subiscono quindi un processo di maturazione concordante con i cambiamenti sia nella trascrizione che nello splicing che promuove l'acquisizione delle proprietà metaboliche e contrattili adulte e l'attivazione dello stiramento18. I moscerini adulti escono dal caso di pupa tra 90 e 100 ore di APF a 27 °C e a circa 100 ore di APF (le femmine a circa 98 ore di APF e i maschi a circa 102 ore di APF) a 25 °C19. Gli IFM sono un sistema di modelli versatile e pertinente. Possono essere monitorati in tutte le fasi della miogenesi, sono morfologicamente e funzionalmente distinti da altri tipi di miofibre nel moscerino e beneficiano di un vasto assortimento di strumenti genetici accessibili e approcci di manipolazione 8,20. Il meccanismo contrattile, la morfologia di base del sarcomero e molti componenti strutturali sono conservati dalle mosche ai vertebrati5, consentendo la traduzione dei principi miogenici dalle mosche all'uomo. Infatti, modelli di mosche di malattie neuromuscolari come la distrofia miotonica, l'atrofia motoria spinale (SMA), le miopatie miofibrillari e le actinopatie hanno fornito intuizioni eziologiche e terapeutiche21,22. In particolare, le mosche sono adatte per la microscopia per analizzare la morfologia della miofibra e del sarcomero attraverso la miogenesi, dalla specifica dei mioblasti alla miofibrillogenesi alla maturazione e al mantenimento del sarcomero.

Gli IFM di Drosophila sono stati utilizzati per applicazioni di microscopia per più di quattro decenni, contribuendo notevolmente alla comprensione della crescita e dello sviluppo muscolare8. Durante questo periodo, i protocolli di dissezione IFM sono stati continuamente adattati con l'avanzare della tecnologia, portando a un'ampia gamma di protocolli presentati con livelli di dettaglio variabili che sono ottimali per alcuni e non ottimali per altre tecniche di imaging. Ad esempio, i protocolli sviluppati per la microscopia elettronica prevedono condizioni di fissazione forte, sezionamento ultrasottile e colorazione con contrasto con metalli pesanti 3,23,24,25, ma non sono ottimali per la microscopia ottica. I protocolli sviluppati per sezionare rapidamente le IFM dal torace per l'uso in saggi biochimici o analisi molecolari26,27 perdono il contesto tissutale e possono interrompere la struttura delle miofibrille, e sono quindi non ottimali per gli approcci microscopici. Sono stati sviluppati approcci di dissezione per l'analisi del muscolo larvale o del muscolo addominale adulto20,28, ma non sono ottimali per l'isolamento di IFM intatti. Gli approcci di imaging dal vivo richiedono dissezioni minimamente invasive o terreni speciali per mantenere in vita il tessuto IFM durante il processo di imaging29,30 e non comportano le fasi di fissazione necessarie per preservare i muscoli per l'immunoistochimica. Esistono diversi protocolli per l'inclusione in paraffina o la criosezione dei tessuti IFM e sono compatibili con l'istochimica o la colorazione con anticorpi 27,31,32, ma questi approcci in genere comportano il congelamento e la disidratazione dei tessuti che possono alterare l'ultrastruttura muscolare e limitare il riconoscimento di alcuni antigeni da parte degli anticorpi primari. I protocolli che fissano direttamente gli IFM preservano la morfologia muscolare e limitano i cambiamenti nella conformazione dell'antigene e sono auspicabili per molti esperimenti di immunoistochimica24. Tuttavia, questi protocolli sono anche mirati ad applicazioni specifiche, ad esempio protocolli che dissociano gli IFM consentendo l'analisi di singole miofibrille mediante fluorescenza, crioEM o microscopia a superrisoluzione 20,33,34. Altri esempi includono protocolli per sezionare fibre IFM intatte dal torace32,35 o per generare preparazioni a montatura intera o emitorace 20,32,36 che consentono l'analisi sia delle miofibre che dei sarcomeri in un contesto intatto. Può essere difficile per un nuovo utente ordinare il gran numero di protocolli esistenti, la maggior parte dei quali sono basati su testo. I tirocinanti e i ricercatori universitari trarrebbero vantaggio da un protocollo di dissezione IFM dettagliato applicato alle applicazioni standard di immunoistochimica.

Questo articolo include una serie di protocolli per la dissezione e la preparazione di IFM di D. melanogaster allo stadio di pupa e adulto per approcci di microscopia immunoistochimica. Questo approccio è stato utilizzato in recenti pubblicazioni che tracciano le funzioni di sviluppo delle proteine leganti l'RNA Bruno137 e Rbfox138 durante la miogenesi IFM. Il protocollo include illustrazioni dettagliate e immagini passo-passo per guidare i potenziali utenti attraverso la dissezione dell'emitorace IFM di IFM adulte e pupali tardive (da 48 ore a 96 ore APF), in cui il torace è diviso in due lungo la linea mediana, mantenendo intatta la struttura delle miofibre. Inoltre, questo protocollo copre la dissezione a libro aperto degli stadi pupali precoci (da 8 h a 48 h APF), in cui la porzione ventrale del torace viene tagliata e sollevata, come l'apertura di un libro, per esporre le IFM intatte attaccate all'epidermide dorsale. Le fasi successive del protocollo includono la fissazione, la colorazione e il montaggio del campione, e dati rappresentativi dimostrano che questo approccio è compatibile con diversi metodi di fissazione per preparare i tessuti per l'immunoistochimica e la microscopia a fluorescenza. Vengono forniti esempi rappresentativi per aiutare i nuovi utenti a identificare gli artefatti di dissezione comuni. Il protocollo viene applicato per analizzare il fenotipo IFM evolutivo di SmnE33, un allele ipomorfico del motoneurone di sopravvivenza (Smn) utilizzato come modello di mosca di atrofia motoria spinale (SMA)21,39, a 26 h APF, 72 h APF e in IFM adulti. I dati qui presentati forniscono informazioni sulla funzione muscolo-specifica dell'Smn e sottolineano l'applicabilità di questo protocollo di dissezione per studiare lo sviluppo muscolare e l'eziologia della malattia muscolare.

Protocollo

Dichiarazione etica:
Tutti gli esperimenti di questo protocollo utilizzano Drosophila melanogaster, un insetto olometabolo. Gli invertebrati non sono soggetti alle normative sul benessere degli animali negli Stati Uniti d'America e il loro uso non richiede l'approvazione etica. Tutto il lavoro è stato condotto secondo le linee guida istituzionali standard per la biosicurezza e la sicurezza dei laboratori ed è stato approvato dal Comitato istituzionale per la biosicurezza dell'Università del Missouri Kansas City con il numero di protocollo 21940 (22-11).

1.Dissezione dell'emitorace di IFM adulta (Figura 1)

  1. Assemblare le forniture necessarie, tra cui due pinze Dumont #5 con punte biologiche, una pinza Dumont #3, un paio di forbici a molla Vannas, una pipetta di plastica, un pennello, una piastra a 24 pozzetti, salviette prive di lanugine, un vetrino da microscopio e lame per criostato (vedi Tabella dei materiali). Preparare 1x PBS, PBS-T allo 0,05% e soluzioni di fissaggio (vedi File supplementare 1). È disponibile una panoramica del diagramma di flusso della seguente dissezione dell'emitorace adulto (Figura supplementare 1).
  2. Raccogli adulti del genotipo e dell'età desiderati (ad esempio, appena chiusi, adulto di 1 giorno o adulto di 5 giorni). Il campione di anestesia vola su CO2 o ghiaccio.
    NOTA: Le mosche utilizzate in questo protocollo sono state coltivate in un ciclo diurno di 12 ore: 12 ore notturne in un'incubatrice a temperatura e umidità controllate. La Drosophila viene coltivata normalmente a 25 °C o 27 °C e può essere coltivata a 18 °C, il che prolunga il ciclo di crescita da 10 giorni a circa 20 giorni.
  3. Utilizzare una pipetta di plastica per trasferire una goccia di 1x PBS40 su un vetrino da microscopio sotto un microscopio da dissezione stereoscopica.
  4. Trasferire le mosche campione nella goccia PBS in piccoli gruppi utilizzando un pennello o una pinza (Figura 1A). Rimuovere la testa (Figura 1B), le ali (Figura 1C - D) e l'addome (Figura 1E) utilizzando una forbice a molla Vannas. Lasciare le gambe attaccate (Figura 1F).
  5. Trasferire delicatamente i torace, utilizzando uno spazzolino o una pinza, in una soluzione di fissazione da 500 μl in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Fissare per il tempo desiderato (in genere 15-60 minuti) su un nutatore/agitatore a dondolo.
    NOTA: Questo protocollo è compatibile con più tamponi di fissaggio, tra cui paraformaldeide, glutaraldeide, metanolo, soluzione di gliossale e altri. Vedere i risultati rappresentativi e il file supplementare 1 per i dettagli sull'ottimizzazione delle condizioni di fissaggio. I fissativi devono essere maneggiati utilizzando guanti e dispositivi di protezione individuale (DPI) appropriati secondo le linee guida sulle sostanze chimiche pericolose del proprio istituto.
  6. Rimuovere il fissativo con una pipetta da 200 μL e lavare in 1 mL di PBS-T allo 0,05% su un nutatore/agitatore a dondolo per 5 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: Smaltire il fissativo seguendo le linee guida dell'istituto sulle sostanze chimiche pericolose. Per la maggior parte degli antigeni, i torace fissati possono essere conservati in 1 mL di PBS-T allo 0,05% per un massimo di 2 settimane a 4 °C prima del taglio e della colorazione. Concentrazioni più elevate di Triton X-100 devono essere testate prima dell'uso, poiché lunghe incubazioni nel detergente possono degradare la struttura del sarcomero.
  7. Rimuovere il tampone con una pipetta da 200 μL e trasferire i torace utilizzando un pennello o una pinza fino a una goccia di 0,05% di PBS-T su un vetrino da microscopio sotto un microscopio da dissezione stereoscopico.
  8. Orientare il torace con lo scutello rivolto verso l'alto e stabilizzato tra un paio di pinze Dumont #3 (Figura 1G-H).
  9. Far scorrere una lama del criostato sul torace per intagliare lo scutello (Figura 1H, J, L), quindi tagliare con un colpo regolare verso il basso lungo la linea mediana (Figura 1I, J, L - N) per generare l'emisezione toracica che espone gli IFM (Figura 1K).
    NOTA: È importante che la cuticola sia "intagliata" o incrinata prima di tagliare gli IFM per evitare artefatti di stiramento che danneggiano la struttura del sarcomero. Non "segare" la lama avanti e indietro, poiché questo movimento danneggia meccanicamente gli IFM, provocando lo sfilacciamento delle miofibrille. Troppo tampone destabilizza il torace tra le pinze e rende il taglio più difficile. Gli approcci alternativi includono la stabilizzazione dei torci uno alla volta su nastro biadesivo per facilitare i tagli, nonché il taglio dal lato ventrale del torace.
  10. Spostare le due metà del torace in una posizione sul vetrino in cui rimarranno coperte da un tampone per evitare che si secchino, ma non siano d'intralcio a tagli futuri. Ripetere i passaggi 1.8-1.10 fino a quando tutte le tracolle sono state tagliate.
  11. Utilizzare una pinza per trasferire le emisezioni del torace dal vetrino del microscopio a 500 μl di PBS-T allo 0,05% in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e procedere con il blocco e l'immunocolorazione (vedere la sezione 4 di seguito).

2. Dissezione dell'emitorace dell'IFM pupale tardiva (~48 h a 96 h APF) (Figura 2, Figura 3)

  1. Stadio di pupe del genotipo desiderato ed età fino al punto selezionato nello sviluppo della pupa (Figura 2). Raccogliere le pre-pupe bianche maschi o femmine (Figura 2A, B) utilizzando un pennello umido e incubare su carta da filtro bagnata in una piastra di coltura cellulare da 60 mm. La stadiazione e la rimozione della pupa dal caso pupale sono state descritte in precedenza20,26.
    NOTA: Le pupe subiscono molteplici cambiamenti morfologici con l'avanzare dell'età, come l'eversione della testa e la pigmentazione della pupa, degli occhi e delle setole19,41 (Figura 2C). Queste caratteristiche morfologiche possono essere utilizzate come guida approssimativa per identificare l'età di una pupa (Figura 2D-E) e per identificare le pupe che non riescono a svilupparsi normalmente (Figura 2F). Tuttavia, per garantire una tempistica di stadiazione accurata, si consiglia di raccogliere le prepupe bianche in finestre temporali ristrette, ad esempio ogni 30 minuti o ogni 2 ore. I punti temporali strettamente stadiati sono necessari per distinguere i principali cambiamenti nella struttura del citoscheletro e nella lunghezza delle miofibre che si verificano da 24 ore a 35 ore di APF, nonché per distinguere le differenze nella struttura del sarcomero a 35 ore, 48 ore, 60 ore, 72 ore, 80 ore e 90 ore APF18,42.
  2. Assemblare le forniture necessarie, tra cui un pennello, due pinze Dumont #5 con punte per biologia, un paio di forbici a molla Vannas, nastro biadesivo, un vetrino da microscopio, una pipetta di plastica, una piastra a 24 pozzetti, salviette Kimwipe e lame per criostato (vedi Tabella dei materiali). Preparare 1x PBS, PBS-T allo 0,05% e soluzioni di fissaggio (vedi File supplementare 1). È disponibile una panoramica del diagramma di flusso della seguente dissezione dell'emitorace pupale (Figura supplementare 2).
  3. Al momento desiderato, utilizzare un pennello per trasferire le pupe dalla carta da filtro a una striscia di nastro biadesivo aderente a un vetrino da microscopio sotto un microscopio da dissezione stereo con ingrandimento 10-20x (Figura 3A, B). Allinea le pupe sul nastro rivolte nella stessa direzione, con il lato ventrale rivolto verso il basso.
  4. Usa un paio di pinze #5 per aprire la parte anteriore della custodia della pupa della prima pupa, rimuovendo delicatamente l'opercolo (la regione sopra la testa) (Figura 3C, D, I).
  5. Usa con attenzione una pinza #5 per tagliare la custodia della pupa appena dorsale all'ala e staccare la custodia della pupa dalla pupa con incrementi di 1-2 mm. Fissare la custodia della pupa al nastro biadesivo mentre si lavora da anteriore a posteriore (Figura 3E - G, I). Evita di colpire la pupa stessa, piuttosto inserisci la punta del forcipe tra la custodia della pupa e la membrana basale/sacco pulpale che circonda la pupa.
  6. Dopo che la custodia è stata rimossa, utilizzare un movimento di raccolta con la pinza per sollevarla sotto (Figura 3H, I) e trasferire delicatamente la pupa fuori dalla custodia in una goccia di 1x PBS su un secondo vetrino da microscopio (Figura 3J, K) per evitare la disidratazione. Ripetere i passaggi 2.4-2.6 (Figura 3I) fino a quando tutte le pupe non sono state rimosse dalla custodia pupale.
  7. Rimuovere l'addome dalle pupe sezionate utilizzando le forbici a molla di Vannas (Figura 3L).
    NOTA: L'addome viene rimosso per consentire una migliore penetrazione con il fissativo nel passaggio successivo. Per evitare di danneggiare il torace, tagliare direttamente nell'addome, lasciando fino al 30% dell'addome attaccato al torace.
  8. Trasferire delicatamente la testa della pupa con il torace (Figura 3M) utilizzando un pennello o una pinza a 500 μl di soluzione di fissazione in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Fissare per il periodo di tempo desiderato (in genere 15-60 minuti) e lavare in 1 ml di PBS-T allo 0,05% come descritto nei passaggi 1.5-1.6.
  9. Rimuovere il tampone con una pipetta da 200 μl e trasferire i torace utilizzando un pennello o una pinza su una goccia di PBS-T allo 0,05% su un vetrino da microscopio sotto un microscopio da dissezione stereo con ingrandimento 10x.
  10. Separare un campione dal resto e orientarlo con il lato ventrale rivolto verso il basso e stabilizzarlo tra un paio di pinze Dumont #3 (Figura 3N).
  11. Far scorrere una lama del criostato sul torace fino a quando la membrana basale e la cuticola non vengono aperte, quindi tagliare con un colpo regolare verso il basso lungo la linea mediana (Figura 3O) per generare le emisezioni del torace che espongono gli IFM (Figura 3P).
    NOTA: Non "segare" la lama avanti e indietro, poiché questo movimento danneggia meccanicamente gli IFM provocando lo sfilacciamento delle miofibrille. Troppo tampone destabilizza il torace tra le pinze e rende il taglio più difficile. Le torace pupali possono essere tagliate con la testa attaccata e orientate verso sinistra o verso destra.
  12. Spostare le due metà del torace in una posizione sul vetrino in cui rimarranno coperte da un tampone per evitare che si secchino, ma non siano d'intralcio a tagli futuri. Ripetere i passaggi 2.10-2.12 fino a quando tutte le tracolle sono state tagliate.
  13. Utilizzare una pinza per trasferire le emisezioni del torace dal vetrino del microscopio a 500 μl di PBS-T allo 0,05% in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e procedere con il blocco e l'immunocolorazione (vedere il passaggio 4 di seguito).

3. Dissezione a libro aperto della IFM pupale precoce (~15 h a 48 h APF) (Figura 4)

  1. Stadio di pupe del genotipo desiderato ed età fino al punto selezionato nello sviluppo della pupa (Figura 2) come descritto sopra (Passaggio 2.1).
    NOTA: Per le dissezioni a libro aperto, le pupe devono essere sezionate in gruppi di non più di 8-10 mosche.
  2. Assembla le forniture necessarie, tra cui un pennello, due pinze Dumont #5 con punte per biologia, un paio di forbici a molla Vannas, nastro biadesivo, un vetrino da microscopio, una pipetta di plastica, una piastra da dissezione in silicone nero, una capsula per colorare il vetro nero, spille per insetti e salviette prive di lanugine (vedi Tabella dei materiali). Preparare 1x PBS, PBS-T allo 0,05% e soluzioni di fissaggio (vedi File supplementare 1). È disponibile una panoramica del diagramma di flusso della seguente dissezione a libro aperto delle pupe (Figura 3 supplementare).
  3. Al momento desiderato, rimuovere le pupe dalla custodia pupale come descritto nei passaggi 2.3-2.6. Trasferire le pupe in una capsula di dissezione in silicone nero riempita con 1x PBS dopo averle rimosse dalla custodia pupale (Figura 4A).
  4. Dopo che tutte le pupe sono state liberate dalla custodia della pupa, utilizzare una pinza Dumont #5 per superare la tensione superficiale e spingere delicatamente le pupe sezionate verso la superficie del silicone. Disporre le pupe in linea vicino al centro del piatto (Figura 4B).
  5. Inserire due aghi per insetti utilizzando una pinza Dumont #5 attraverso l'addome di ciascuna pupa per tenerla in posizione (Figura 4C, D). Assicurati che le pupe siano orientate con il lato ventrale rivolto verso l'alto.
  6. Utilizzare una forbice a molla Vannas per aprire la membrana basale e la regione anteriore della testa di ciascuna pupa (Figura 4E).
  7. Inserire le forbici nell'apertura e tagliare lungo i lati destro e sinistro di ogni pupa (Figura 4F, G, Q). Posiziona le forbici e taglia appena sotto il notum in via di sviluppo fino alla giunzione tra il torace e l'addome per rimuovere le zampe e le ali con la parte ventrale. Assicurarsi che le forbici siano inserite orizzontalmente e non entrino in contatto con la parte dorsale del torace (Figura 4Q).
  8. Utilizzare una pinza Dumont #5 per afferrare e sollevare la porzione ventrale della pupa e rimuoverla con una forbice a molla Vannas (Figura 4H, I, Q).
  9. Rimuovere il cervello, il cordone nervoso ventrale (VNC), la trachea e l'intestino utilizzando una pinza Dumont #5 (Figura 4J, K, Q). Fare attenzione a non disturbare gli IFM in via di sviluppo, che si trovano direttamente sotto la trachea e i VNC attaccati all'epidermide sulla porzione dorsale del torace.
  10. Agganciare il puntale di un puntale per pipetta da 200 μl per creare un'apertura più ampia. Utilizzare una pipetta da 200 μl con la punta tagliata per lavare delicatamente 1 tampone PBS sul torace per rimuovere la maggior parte dei corpi adiposi rimanenti per esporre gli IFM (Figura 4L,M). Sii delicato per evitare di strappare gli attacchi tendinei che collegano le miofibre all'epidermide.
  11. Utilizzare una forbice a molla Vannas per tagliare la linea mediana del torace dorsale, creando due "foglietti" contenenti IFM (Figura 4N).
  12. Tagliare i lembi del torace dorsale lontano dall'addome usando una forbice (Figura 4O, Q) e trasferire i lembi a 300 μL di soluzione fissativa in un piatto di vetro nero utilizzando una pinza Dumont #5 (Figura 4P). Afferrare i lembi sulla custodia della testa con la pinza per evitare di danneggiare le miofibre o i tendini dell'IFM.
  13. Fissare per il periodo di tempo desiderato (in genere 15 minuti). Utilizzare una pipetta da 200 μl per rimuovere con cura il fissativo e lavare con 500 μl di PBS-T allo 0,05%. Procedere con il blocco e l'immunocolorazione (vedere il passaggio 4 di seguito).
    NOTA: Non raccogliere campioni di nutato o roccia in piatti di vetro nero. Gli attacchi muscolo-tendinei nelle prime fasi della pupa sono molto fragili e si strappano con una costante agitazione del tampone, con conseguente perdita di IFM. Pipettare lentamente e con attenzione i bordi del tampone nella piastra per evitare di aspirare i campioni nella punta della pipetta quando si cambiano le soluzioni.

4. Immunocolorazione e istochimica di campioni IFM fissati

  1. Assemblare le forniture necessarie, tra cui una pipetta, i puntali delle pipette e gli anticorpi o le macchie necessarie. Preparare PBS-T allo 0,05%, soluzione bloccante e miscele di anticorpi/coloranti (vedere File supplementare 1).
  2. Pipettare la soluzione di lavaggio (0,05% PBS-T) dai campioni e aggiungere la soluzione bloccante. Incubare i campioni in soluzione bloccante per almeno 30 minuti a temperatura ambiente (con oscillazione per i passaggi 1-2, senza oscillazione per i passaggi 3).
    NOTA: In alternativa, i campioni possono essere bloccati durante la notte a 4 °C. In questo protocollo, i campioni sono stati bloccati nel siero di capra normale al 5% (NGS) e nello 0,05% di PBS-T. Ulteriori informazioni sulle opzioni di soluzione di blocco sono disponibili nel file supplementare 1.
  3. Rimuovere la soluzione bloccante dai torace utilizzando una pipetta. Aggiungere la miscela di anticorpi primari e incubare almeno 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C (con oscillazione per le fasi 1-2, senza oscillazione per la fase 3).
    NOTA: Questo protocollo è compatibile con la maggior parte degli anticorpi primari. Gli anticorpi devono essere diluiti in soluzione bloccante. Le diluizioni degli anticorpi primari testate con questo protocollo vanno da 1:10 a 1:2000 e sono determinate sperimentalmente per ogni singolo anticorpo. Ulteriori dettagli sull'ottimizzazione della colorazione degli anticorpi primari sono forniti nel File supplementare 1.
  4. Rimuovere la miscela di anticorpi primari utilizzando una pipetta e lavare i campioni 3 volte per 10 minuti ciascuno, in PBS-T allo 0,05%.
  5. Aggiungere anticorpi secondari o miscela di coloranti al campione. Coprire il campione con un foglio di alluminio per ridurre al minimo lo sbiancamento. Incubare almeno 2 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 °C (con oscillazione per la fase 1-2, senza oscillazione per la fase 3).
    NOTA: La maggior parte degli anticorpi secondari e dei coloranti cellulari fluorescenti possono essere utilizzati con questo protocollo. Molti anticorpi secondari vengono utilizzati con una diluizione di 1:500. Nei dati rappresentativi riportati di seguito (vedere i risultati rappresentativi), i nuclei sono stati marcati con DAPI (1 mg/mL di stock, diluito 1:1000 in 0,05% di PBS-T) e F-actina con rodamina falloidina (300 unità/mL di stock, diluita 1:500 in 0,05% di PBS-T).
  6. Rimuovere la miscela secondaria/colorante utilizzando una pipetta e lavare i campioni 4 volte per 10 minuti ciascuno, in PBS-T allo 0,05% a temperatura ambiente. Procedere al montaggio (passaggio 5) subito dopo il lavaggio.

5. Montaggio di campioni colorati su vetrini per l'analisi al microscopio (Figura 5)

  1. Assemblare le forniture necessarie, tra cui un pennello, pinze, vetrini da microscopio smerigliati, vetrini coprioggetti (spessore #1), smalto trasparente, mezzo di montaggio e salviette prive di lanugine (vedere la Tabella dei materiali).
  2. Etichettare l'area di scrittura smerigliata di un vetrino da microscopio con il numero di campione pertinente o le informazioni identificative preferite (data, genotipo, anticorpo, numero di vetrino, ecc.).
  3. Aggiungere distanziatori per vetrini coprioggetti (vetrini coprioggetti #1), lasciando circa 1 cm tra i vetrini coprioggetti per il posizionamento del campione (Figura 5A-C). Utilizzare una piccola goccia di glicerolo al 50% per tenere in posizione i distanziatori (Figura 5A, D).
    NOTA: I distanziatori impediscono la distorsione del campione durante il montaggio di campioni spessi. I torace adulti richiedono tipicamente un distanziatore spesso a 2 vetrini, i torace APF a 48 ore un distanziatore spesso a 1 vetrino coprioggetti e foglietti illustrativi a libro aperto senza distanziatore.
  4. Aggiungere una goccia di terreno di montaggio al pozzetto tra i distanziatori del vetrino coprioggetti o al centro del vetrino del microscopio se si montano campioni di pupe precoci (Figura 5C-D). Posizionare il vetrino sotto un microscopio da dissezione stereoscopico.
    NOTA: Sono disponibili diversi tipi di supporti di montaggio. Se si utilizza un mezzo autoindurente, prenderne in considerazione uno con un tempo di polimerizzazione di diverse ore per consentire un tempo sufficiente per orientare correttamente i campioni prima che il mezzo si indurisca. È stato dimostrato che i mezzi di montaggio influenzano le dimensioni del sarcomero 43,44,45, quindi lo stesso reagente dovrebbe essere utilizzato per tutti i campioni in un esperimento.
  5. Utilizzare una pipetta per rimuovere la maggior quantità possibile di tampone di lavaggio dai campioni. Trasferire immediatamente i campioni utilizzando una pinza o un pennello sulla goccia del mezzo di montaggio sul vetrino (Figura 5E).
  6. Utilizzando le pinze Dumont #5, organizzare i campioni in righe e colonne, assicurarsi che i campioni non siano sovrapposti e orientare i denti con gli IFM rivolti verso l'alto (Figura 5F, J, Q, S). L'orientamento può richiedere di capovolgere con attenzione i campioni in cui le setole/cuticole sono rivolte verso l'alto (Figura 5G, H, K, L, R). Fare attenzione a non toccare gli IFM, poiché il contatto danneggerebbe la struttura del sarcomero (vedere Risultati rappresentativi).
  7. Aggiungere con cautela un vetrino coprioggetti #1 (18 x 18 mm o 22 x 22 mm) sui campioni del torace (Figura 5M). Se si utilizzano distanziatori, premere delicatamente il vetrino coprioggetti finché non tocca i distanziatori su entrambi i lati dei campioni (Figura 5N).
  8. Utilizzare un puntale per pipetta o un contagocce per riempire l'area del campione con il mezzo di montaggio fino a quando tutte le torace non sono racchiuse (Figura 5O). Evitare di creare bolle d'aria che interrompano l'acquisizione dell'immagine.
  9. Usa lo smalto trasparente per sigillare il supporto bagnato. Ricordarsi di sigillare sia il vetrino coprioggetti campione che i vetrini coprioggetti distanziatori (Figura 5P, S).
    NOTA: Evitare l'uso di top coat o smalto ad asciugatura rapida, poiché si sigillano male e si formeranno bolle d'aria man mano che il mezzo di montaggio evapora.
  10. Asciugare i vetrini per 10 minuti a temperatura ambiente. Conservare in una custodia per vetrini a 4 °C. Le diapositive possono essere visualizzate per diversi giorni o settimane.
  11. Campioni di immagine su un microscopio a fluorescenza, microscopio confocale o altro sistema secondo il disegno sperimentale. I protocolli per l'acquisizione e l'analisi delle immagini sono disponibili altrove 14,30,46,47,48.

Risultati

Il protocollo di dissezione presentato sopra può essere utilizzato per generare campioni di alta qualità per l'analisi microscopica della miofibra IFM e della morfologia del sarcomero già da 8 ore dopo la formazione del pupario (APF) utilizzando il metodo a libro aperto (fase 3) fino agli stadi adulti utilizzando l'approccio di dissezione dell'emitorace (fasi 1 e 2). Queste dissezioni sono state applicate per studiare, tra gli altri, la formazione di muscoli e sarcomeri 18,42,49, la funzione del fattore di trascrizione50,51 e la regolazione dell'RNA37,38. I risultati rappresentativi forniti di seguito dimostrano la compatibilità di questo protocollo con diversi metodi di fissazione, descrivono in dettaglio gli artefatti di dissezione comuni e utilizzano il fenotipo mutante SmnE33 per illustrare l'utilità di questo protocollo per affrontare questioni morfologiche e biologiche cellulari nel modello IFM.

La dissezione IFM è compatibile con più metodi di fissazione

Un aspetto critico della preparazione dei campioni per l'istochimica o l'immunofluorescenza è la conservazione accurata delle strutture cellulari attraverso la fissazione. I fissativi preservano la struttura e la morfologia dei tessuti prevenendo la degradazione e stabilizzando le strutture proteiche e lipidiche attraverso la reticolazione52,53. Diverse classi di fissativi, ad esempio solventi a base di aldeidi rispetto a solventi organici, hanno diverse efficienze di penetrazione e reticolazione e influiscono in modo differenziale sul riconoscimento anticorpo-bersaglio prendendo di mira gruppi funzionali distinti53,54. Le dissezioni IFM sono compatibili con diversi metodi di fissazione, tra cui il 4% di paraformaldeide (PFA), il 9% di gliossale e la fissazione con metanolo (Figura 6), sottolineando l'utilità generale di questo protocollo di dissezione.

Per confrontare le dimensioni e la morfologia del sarcomero con l'applicazione di diversi metodi di fissazione, sono state eseguite dissezioni dell'emitorace di 1 giorno adulto con1118 mosche. È stata confrontata la fissazione del PFA al 4% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (Figura 6A, E) o in soluzione rilassante (RS) (Figura 6B, F). La soluzione rilassante contiene ATP ed è consigliata per l'uso quando si quantificano le dimensioni dei sarcomeri per preservare i sarcomeri nel loro stato rilassato20,55 (vedi File supplementare 1). La fissazione del PFA al 4% preserva efficacemente la morfologia del sarcomero, ma è stata osservata una differenza significativa nella larghezza del sarcomero tra la fissazione del PFA del 4% nella PBS rispetto alla RS (Figura 6I, J). La fissazione nel metanolo ha preservato la struttura della miofibra e del sarcomero (Figura 6C, G), ma i sarcomeri erano significativamente più corti e sottili rispetto alla fissazione con PFA al 4% (Figura 6I, J). Gli IFM potrebbero essere efficacemente preservati con una fissazione notturna del gliossale al 9% (Figura 6D, H) (la fissazione del gliossale al 3% è risultata inefficace), che ha anche alterato significativamente la larghezza del sarcomero rispetto alla fissazione del PFA al 4% (Figura 6I, J). In conclusione, gli emitoracei IFM possono essere efficacemente conservati con più fissativi. Tuttavia, poiché sia il fissativo che il tampone possono influenzare la misurazione delle dimensioni del sarcomero, gli esperimenti dovrebbero essere progettati con controlli adeguati e un protocollo di fissazione ben definito e coerente.

Artefatti comuni di dissezione e fissazione negli IFM

Una sfida con la microscopia, soprattutto per i nuovi utenti e i tirocinanti, è distinguere gli artefatti tecnici dai fenotipi in buona fede. Per aiutare con questa distinzione nelle IFM di Drosophila, vengono presentati dati rappresentativi degli artefatti e dei fallimenti di dissezione più comunemente osservati (Figura 6). I protocolli di fissazione richiedono l'ottimizzazione del tipo, della concentrazione e della lunghezza della fissazione per evitare la sottofissazione o la sovrafissazione 52,53,54. Utilizzando un decorso del tempo di fissazione di w1118 1 giorno di dissezioni di emitorace adulto incubate in PFA al 4% in soluzione rilassante, è stato osservato che mentre il tempo di fissazione di 15 o 30 minuti preserva accuratamente la morfologia del sarcomero, una fissazione di 7 minuti produce morfologie del sarcomero incoerenti (Figura 6K-M). Inoltre, il tessuto è meno rigido con un tempo di fissazione più breve, rendendo più difficile tagliare e dividere in due il torace senza danneggiare gli IFM. Ulteriori artefatti possono verificarsi sia durante il taglio che durante il processo di montaggio. La struttura della miofibra IFM può apparire irregolare se la lama è smussata e provoca strappi o sfilacciamenti (Figura 6N) o se la lama scivola o il taglio è angolato (Figura 6O). Se le pinze entrano in contatto diretto con gli IFM fissi durante la manipolazione o il montaggio, fanno un'impressione che può portare a avvallamenti o stiramenti e possono separare i sarcomeri (Figura 6P). Anche l'allungamento o la deformazione del torace, durante il taglio, la manipolazione o il montaggio, separano i sarcomeri e provocano la perdita di un disco Z chiaramente delimitato (Figura 6Q). Infine, il "taglio" o lo "sfregamento" delle IFM con una pinza o una lama porta all'abrasione e al disfacimento, allo sfilacciamento e alla disorganizzazione delle miofibrille, specialmente sulla superficie della miofibra (Figura 6R). I potenziali utenti dovrebbero familiarizzare con questi artefatti tecnici ed escluderli dall'analisi fenotipica.

Progressione evolutiva del fenotipo Smn E33 nelle IFM

Le dissezioni a libro aperto e l'emitorace sono particolarmente utili per tracciare la traiettoria di sviluppo di un fenotipo muscolare e per individuare quando nello sviluppo agisce un gene di interesse o insorgono fenotipi di miofibrille. Il fenotipo evolutivo IFM di SmnE33, un allele ipomorfico della proteina legante l'RNA Survival motor neuron (Smn)39 , è presentato come dati rappresentativi che illustrano l'ampia utilità delle dissezioni a libro aperto e dell'emitorace.

Le piccole ribonucleoproteine nucleari (snRNP) che formano lo spliceosoma, il complesso macromolecolare che catalizza la reazione di splicing per generare mRNA7, sono assemblate dal complesso SMN. Il complesso SMN, costituito da motoneurone di sopravvivenza (Smn) e proteine Gemina, è necessario per la vitalità in tutti gli organismi56. Livelli ridotti di SMN nell'uomo portano alla grave malattia neuromuscolare ereditaria dell'atrofia motoria spinale (SMA)21. La Drosophila è stata utilizzata come modello per comprendere l'eziologia della SMA e la funzione cellulare della Smn, compreso lo sviluppo dell'allele ipomorfico SmnE33. Le mosche SmnE33 sono vitali e fertili, ma non possono volare o saltare39. Sebbene i moscerini SmnE33 abbiano difetti di arborizzazione dei motoneuroni, mostrano anche una struttura IFM disorganizzata e una perdita dell'espressione di Actin88F specifica del muscolo di volo39,57. L'SMN è co-localizzato con l'alfa-actinina al disco Z nei moscerini e nei topi39, suggerendo che l'Smn possa avere una funzione muscolo-specifica.

Per ottenere una migliore comprensione di quando la struttura delle miofibrille viene persa e la funzione Smn è richiesta nello sviluppo muscolare, è stata eseguita un'analisi del decorso temporale dello sviluppo del fenotipo SmnE33 nelle IFM a 26 ore di APF, 72 ore di APF e da 1 a 5 giorni negli adulti. Mentre gli IFM di controllo w1118 sia a 72 h APF che negli adulti hanno un forte segnale di F-actina colorato con falloidina (Figura 7E,E',I,I') e una struttura sarcomera regolare (Figura 7G,G',K,K'), il segnale della falloidina è drasticamente ridotto (Figura 7F,F',J,J') e le strutture sarcomeriche sono assenti (Figura 7H,H',L,L') in SmnE33 IFM. La F-actina è invece osservata in strutture reticolari attorno ai nuclei o in fasci irregolari o strutture "starburst" nel citoplasma (Figura 7H,H',L,L'), coerenti con una perdita dell'espressione di Act88F18, 39 e un'incapacità di assemblare filamenti sottili. Sono state eseguite dissezioni a libro aperto per esaminare il fenotipo SmnE33 a 26 ore di APF e hanno rivelato che lo sviluppo precoce di IFM procede normalmente in SmnE33. Paragonabili agli IFM di controllo w1118 (Figura 7A,A',C,C'), i moscerini SmnE33 hanno 6 fibre IFM longitudinali dorsali per emitorace, formano cavi organizzati di F-actina alla periferia della miofibra prima della miofibrillogenesi (Figura 7B,B') e mostrano una rete di F-actina simile a una rete in tutta la miofibra (Figura 7D,D'). Questi risultati indicano che le fasi iniziali della differenziazione IFM procedono normalmente, mentre l'Smn è necessario nelle fasi successive dello sviluppo dell'IFM per sostenere l'espressione di Act88F e costruire i sarcomeri. È importante sottolineare che questi risultati rappresentativi illustrano il dettaglio fenotipico e la risoluzione che può essere raggiunta con le dissezioni a libro aperto e con emitorace.

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Figura 1: Dissezione emiscosa di IFM adulti. (A) Posizionare una mosca adulta in 1x PBS su un vetrino da microscopio. (B) Usando una pinza (ciano, punto) per stabilizzare la mosca, rimuovere la testa con una forbice (arancione). (C-E) Rimuovere le ali sinistra (C) e destra (D) e l'addome (E). (F) Scartare la testa, l'addome e le ali e trasferire il torace al fissativo. (G,H) Orientare un torace fisso su un vetrino con una goccia di 1x PBS-T con la parte posteriore (P) e lo scutello rivolti verso l'alto (G), utilizzando una pinza per stabilizzare l'orientamento (H). (I-K) Utilizzare una lama di criostato per tagliare il torace a metà (I-J), per generare due emisezioni del torace (K). (L) Diagramma di una lama di criostato e di un torace, che illustra la posizione del taglio sagittale per produrre emisezioni. La lama viene fatta scorrere verso destra per incidere lo scutello del torace, quindi spostata verso il basso con un movimento regolare (frecce gialle) per tagliare il torace (linea rossa tratteggiata). (M,N) Schema di una vista coronale (M) e trasversale (N) del torace, che illustra la posizione dei principali gruppi muscolari e la posizione del taglio (tra i triangoli gialli). L'orientamento del torace è indicato (L, sinistra; R, a destra; V, ventrale; D, dorsale; A, anteriore; P, posteriore). Barre della scala = 1 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Stadiazione delle pupe e caratteristiche dello sviluppo delle pupe. (A) Le pupe maschili e (B) le femmine possono essere distinte come pre-pupe bianche a 0-2 h APF. Le pupe maschili hanno strutture accoppiate, rotonde e traslucide (il testicolo in via di sviluppo) verso la parte posteriore (frecce). (C) Tabella delle caratteristiche che fungono da segni distintivi dello sviluppo della pupa. Le caratteristiche includono la maturazione del case pupale, l'eversione della testa e il distacco della pupa dal case pupale, lo sviluppo della pigmentazione degli occhi, la pigmentazione delle setole, delle ali, delle zampe, dell'epantrio e della cuticola e la visibilità della macchia vergine (meconio). Il colore degli occhi e la pigmentazione si scuriscono progressivamente. I tempi e gli stadi dello sviluppo della pupa etichettati nella parte superiore di ogni colonna della tabella (punti temporali indicati in testo nero, stadio corrispondente nello sviluppo della pupa in basso nel testo blu) sono stati precedentemente definiti da Bainbridge e Bownes19,41. (D-E) Decorso temporale dello sviluppo della pupa a 0-2 ore, 24 ore, 48 ore, 72 ore e 96 ore APF in una pupa intatta con occhi rossi (D; Mef2-Gal4, fln-GFP) e in una pupa con occhi arancioni sezionata dalla custodia pupale (E; Fln-Gal4). Da notare il progressivo oscuramento degli occhi e delle setole da 48 h a 96 h APF. (F) Esempi di letalità pupale nei momenti di sviluppo precoce, medio e tardivo. Le mosche letali Pharate sono completamente formate, ma non riescono a chiudersi completamente dal caso pupale. Barre della scala = 1 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Dissezione emisezione di IFM pupali (>48 h APF). (A-H) Rimozione di una pupa dal caso pupale. Attacca le pupe su una striscia di nastro biadesivo (A,B). Aprire la cresta anteriore (C) e rimuovere l'opercolo (D) utilizzando un paio di pinze Dumont #5 (blu, la freccia indica la direzione del movimento, il punto è fermo). Utilizzare una pinza per aprire (E) e staccare (F) la custodia pupale a strisce (G). Le strisce della custodia pupale sono incollate al nastro biadesivo. Dopo aver esposto l'addome, sollevare la pupa dalla custodia (H). (I) Schema che illustra il processo di sezionamento di una pupa dal caso della pupa. I pannelli delle figure corrispondenti a ciascun passaggio dello schema sono etichettati (in basso). La linea tratteggiata rossa segna il punto in cui la pinza può essere inserita senza danneggiare la pupa per aprire la custodia della pupa. (J-L) Dopo aver rimosso la pupa dalla custodia (J) e averla trasferita su un vetrino da microscopio in una goccia di 1x PBS (K), utilizzare una forbice per rimuovere l'addome (L). (M) Scartare l'addome e trasferire il torace al fissativo. (N) Dopo la fissazione, trasferire i torati pupali su un vetrino in una goccia di 1x PBS-T. Orientare la pupa con il lato dorsale rivolto verso l'alto e stabilizzarla con una pinza. (O-P) Utilizzare una lama di criostato (O) per tagliare un'emisezione pupale (P). Il posizionamento del taglio è lo stesso della Figura 1 M-N. Barre della scala = 1 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Dissezione a libro aperto di IFM pupali (<48 h APF). (A) Dopo aver rimosso la pupa dal case pupale come mostrato nella Figura 3 A-I, trasferire la pupa su 1x PBS in un piatto di dissezione in silicone nero. (B-D) Spingere delicatamente la pupa verso il basso sulla superficie della capsula di silicone usando una pinza (B) e fissare il lato ventrale verso l'alto usando due spilli per insetti (C, D). (E) Aprire la membrana basale (bm) e la cuticola della testa usando una forbice (arancione). (F,G) Tagliare lungo il lato destro (F) e sinistro (G). La posizione del taglio è rappresentata in (Q). (H,I) Sollevare la sezione ventrale con una pinza (H) e rimuoverla con una forbice (I). (J,K) Usa una pinza per rimuovere il cervello (J), la trachea laterale del tronco e l'intestino (K). (L-M) Utilizzare un getto delicato di tampone da una pipetta per rimuovere i corpi adiposi ed esporre gli IFM. (N) Tagliare il torace in due foglioline. (O,P) Tagliare i foglietti illustrativi e trasferirli nel fissativo. (Q) Schema che riassume i passaggi in una dissezione a libro aperto. I pannelli delle figure corrispondenti a ciascun passaggio sono etichettati (in basso). Le viste dall'alto e dal lato sono fornite per illustrare il posizionamento dei tagli (linea rossa tratteggiata) sul lato sinistro e destro della pupa. Le ali, le zampe e la proboscide (etichettate) sono usate per distinguere i lati dorsale e ventrale della pupa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Montaggio del campione su vetrini da microscopio. (A-D) I distanziatori coprioggetti vengono utilizzati per montare campioni di emisezione toracica spessa. Il glicerolo (A) viene utilizzato per apporre distanziatori (vetrini coprioggetto #1) su un vetrino etichettato (B) e i campioni vengono montati in un mezzo di montaggio nello spazio tra i distanziatori (C). Le pupe tardive e le torace adulte richiedono due distanziatori #1 per vetrini coprioggetti (D). I punti temporali a metà pupa richiedono un singolo distanziatore per vetrini coprioggetti #1 e le prime dissezioni pupali possono essere montate senza distanziatore. (E-H) I campioni di emitorace adulto vengono trasferiti nel terreno di montaggio con una pinza o un pennello (E). I torace sono inizialmente orientati in modo casuale (F) e potrebbe essere necessario capovolgerli utilizzando una pinza (G) in modo che gli IFM siano orientati verso l'alto verso il vetrino coprioggetti (H). (I-L) I lembi delle prime dissezioni a libro aperto della pupa vengono trasferiti per il montaggio utilizzando una pinza (I). I lembi sono orientati in modo casuale (J) e possono essere capovolti utilizzando una pinza (K) in modo che gli IFM siano rivolti verso l'alto verso il vetrino coprioggetti (L). (M-P) Dopo che i campioni sono stati orientati correttamente, posizionare un vetrino coprioggetti sui campioni (M) e picchiettarlo anche contro i distanziatori (N). Riempire intorno ai campioni con il mezzo di montaggio (O), facendo attenzione a non formare bolle. Sigillare tutti i bordi aperti del vetrino coprioggetti e i distanziatori con smalto per unghie (P) per evitare l'evaporazione del mezzo di montaggio. (Q-R) Immagini di campioni di torace adulto montati correttamente (Q, ingrandimento 10x) orientati con gli IFM rivolti verso l'alto verso il vetrino coprioggetti (R, ingrandimento 20x). (S) Uno schema del vetrino completato, con i campioni orientati IFM-up tra i distanziatori e lo smalto per unghie che sigilla tutti i bordi aperti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Le dissezioni IFM sono compatibili con diversi fissativi. (A-H) Proiezione z confocale della struttura della miofibra (A-D) o immagini su un singolo piano della struttura della miofibrilla e del sarcomero (E-H) del controllo con1118 IFM adulta. La dissezione dell'emitorace è compatibile con diversi metodi di fissaggio, tra cui paraformaldeide al 4% (PFA) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (A,E) o soluzione rilassante (RS) (B,F), metanolo (C,G) o soluzione di gliossale al 9% (D,H). DAPI (1:1000), blu; F-actina colorata con falloidina (1:500), grigia. (I,J) Quantificazione della lunghezza (I) e della larghezza (J) del sarcomero da E-H. Il metodo di fissazione e il tampone possono avere un impatto significativo sulla misurazione della lunghezza e della larghezza del sarcomero. Una lunghezza del sarcomero di 3,040 ± 0,2935 μm con fissazione del metanolo era significativamente più corta delle lunghezze misurate di 3,271 ± 0,2736 μm, 3,190 ± 0,2586 μm e 3,217 ± 0,2023 μm con fissazione del gliossale del PFA (PBS), PFA (RS) e 9%, rispettivamente (p < 0,001). La larghezza del sarcomero era significativamente diversa tra tutti i metodi di fissazione testati (PFA (PBS), 1,410 ± 0,1331 μm; PFA (RS), 1,284 ± 0,2514 μm; metanolo, 1,280 ± 0,1538 μm; e fissazione gliossale al 9%, 1,137 ± 0,2032 μm). I boxplot vengono mostrati con baffi di Tukey con punti dati anomali contrassegnati da punti neri. La significatività è stata determinata mediante ANOVA con un test di Tukey post hoc (**, p < 0,01; ***, p < 0,001). (K-M) Immagini confocali su un piano singolo di un decorso del tempo di fissazione dell'adulto w1118 in PFA al 4% in fissazione RS, dimostrando che tempi di fissazione di 15 (L) o 30 (M) min, rispetto a 7 min (K), determinano una struttura sarcomera ben conservata e coerente. (N,O) Proiezioni Z-stack di IFM adulti Act88F-Gal4 fissate in PFA al 4% che dimostrano artefatti di dissezione nelle miofibre. Gli artefatti comuni includono miofibre tagliate, sfilacciate o parziali da una lama smussata (N) o da un taglio angolato (O). (P-R) Immagini confocali su un piano di campioni adulti w1118 fissati in PFA al 4% in PBS che dimostrano artefatti di dissezione comuni in sarcomeri e miofibrille. Gli artefatti tecnici comuni includono l'allungamento irregolare dei sarcomeri a causa del contatto con le pinze durante il montaggio (P), l'estrazione dei dischi Z fuori registro allungando le miofibre durante i tagli longitudinali (Q) e le miofibrille sfilacciate, disorganizzate o arricciate a causa dell'abrasione o di una lama smussata (R). DAPI (1:1000), blu; F-actina colorata con falloidina (1:500), grigia. Barra graduata = 100 μm (A-D, N-O), 5 μm (E-H, K-M, P-R). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: Applicazione delle dissezioni per studiare il fenotipo IFM evolutivo di SmnE33. (A-D) Struttura muscolare nelle prime pupe a 26 h APF. Immagine confocale su un piano singolo della struttura delle miofibre (A, A', B, B') e della struttura delle miofibrille e dei sarcomeri (C, C', D, D') in controllo (A, A', C, C') e SmnE33 (B, B', D, D'). Sia il controllo che l'SmnE33 hanno sei miofibre IFM per emitorace e formano cavi F-actina. (E-H) Struttura muscolare nelle pupe tardive a 72 h APF. Immagine di proiezione Z della struttura della miofibra nel controllo (E, E') e SmnE33 (F, F'). Gli IFM in SmnE33 sono presenti sulla base della colorazione DAPI, ma mancano di un forte segnale F-actina. Le immagini confocali a piano singolo rivelano che gli IFM di controllo hanno una struttura sarcomera altamente organizzata (G, G'). Al contrario, gli IFM SmnE33 (H, H') hanno strutture F-actina simili a stelle anomale (frecce gialle) e mancano della struttura sarcomera organizzata osservata negli IFM di controllo. (I-L) Struttura muscolare adulta in controllo (I, I', K, K') e SmnE33(J, J', L, L'). Le immagini a proiezione Z (I,J) e confocali a piano singolo (K,L) rivelano un contenuto di F-actina notevolmente ridotto e strutture anomale di actina (frecce gialle) negli IFM SmnE33. DAPI (1:1000), blu; F-actina colorata con falloidina (1:500), magenta o grigio. Barra della scala = 50 μm (A, B), 10 μm (C, D, G, H, K, L), 100 μm (E, F, I, J). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Fascicolo supplementare 1: Una descrizione dettagliata dei metodi di fissazione e colorazione utilizzati nel testo e in particolare per generare i dati mostrati nella Figura 6 e nella Figura 7. Sono incluse ulteriori informazioni sulla determinazione delle diluizioni degli anticorpi primari. Viene inoltre fornito un elenco dei componenti del buffer e delle ricette utilizzate in questo protocollo. Questi dati motivano il protocollo di dissezione e ne dimostrano l'utilità per la microscopia confocale e l'analisi dei fenotipi IFM in fase di sviluppo. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 1 supplementare: Diagramma di flusso delle fasi nella dissezione dell'emitorace di IFM adulti. Riassunto testuale dei passaggi in Figura 1 per preparare le sezioni IFM dell'emitorace. Dopo la dissezione, la fissazione e la bisezione del torace, le sezioni vengono colorate per l'analisi al microscopio. Clicca qui per scaricare questa figura.

Figura 2 supplementare: Diagramma di flusso delle fasi nella dissezione dell'emitorace di IFM pupali. Riassunto testuale dei passaggi in Figura 3 per preparare le sezioni dell'emitorace delle IFM pupali. Dopo la rimozione dal caso della pupa, le pupe vengono fissate, sezionate e colorate per la microscopia. Clicca qui per scaricare questa figura.

Figura 3 supplementare: Diagramma di flusso delle fasi della dissezione a libro aperto delle IFM pupali precoci. Riassunto testuale dei passaggi mostrati nella Figura 4 per eseguire la dissezione a libro aperto delle IFM pupali prima di 48 ore di APF. Dopo la dissezione e la fissazione, i lembi epiteliali con IFM attaccati vengono colorati per la microscopia. Clicca qui per scaricare questa figura.

Discussione

Questo protocollo presenta una procedura per la dissezione emitorace di IFM adulte (Figura 1) e pupali tardive (48 h - 96 h APF) (Figura 3), nonché per la dissezione a libro aperto di IFM nei punti temporali precoci della pupa (8 h - 48 h APF) (Figura 4). Questo protocollo è ottimale per le applicazioni di immunoistochimica e microscopia a fluorescenza. Il protocollo è illustrato con diagrammi schematici e fotografie graduali della procedura di dissezione. I diagrammi di panoramica rendono inoltre il protocollo accessibile agli scienziati che non conoscono il campo della Drosophila , nonché ai ricercatori universitari e ai tirocinanti all'inizio della carriera. Sono inclusi esempi rappresentativi di scarsa fissazione e artefatti di preparazione del campione per consentire agli utenti del protocollo di distinguere gli artefatti dai fenotipi di sarcomero in buona fede .

La fase più difficile nella dissezione dell'emitorace IFM è la bisezione del torace (Figura 1I, J, L e Figura 3O). Questo passaggio richiede tempo e pratica per essere padroneggiato. Per una maggiore stabilità durante il taglio, i singoli torace possono essere posizionati su nastro biadesivo e tagliati36, ma è necessario prestare attenzione per evitare l'essiccazione degli IFM. È anche possibile tagliare dal lato ventrale del torace, con il lato dorsale orientato verso il basso, in modo che i nuovi utenti possano testare quale approccio è più efficace con la loro configurazione. I tagli devono essere eseguiti con lame nuove e affilate per evitare di danneggiare gli IFM e una lama deve essere sostituita quando diventa smussata. Le lame del microtomo (criostato) vengono utilizzate per tagliare in modo netto il torace in questo protocollo, rispetto ad altri protocolli che utilizzano un ago, una pinza o una lama di bisturi24, 32, 36. Le lame di rasoio sono un'altra alternativa per dividere in due in modo pulito il torace. La fissazione è importante anche prima della bisezione, poiché il tessuto leggermente fissato, sebbene conservato stabilmente, può essere "molle" e più difficile da tagliare. I tempi di fissazione di 30-60 minuti bilanciano la disponibilità di antigene e la rigidità dei tessuti facilitando i tagli e possono essere ridotti a 15 minuti con l'esperienza.

Una limitazione dei preparati di emitorace è la penetrazione degli anticorpi. Gli emitorace sono campioni spessi32 e le micrografie confocali della migliore qualità sono ottenute dai 10-20 μm superiori degli IFM42, 58. Una concentrazione di detergente troppo bassa o un tempo di permeabilizzazione troppo breve possono portare a una colorazione debole e incoerente. La penetrazione degli anticorpi può anche essere migliorata con un'incubazione più lunga (2-3 giorni) nell'anticorpo primario. Anche un sistema a due fotoni o un obiettivo con una distanza di lavoro maggiore possono aumentare la profondità di imaging59. Se lo sperimentatore ha bisogno di visualizzare l'intero diametro della miofibra IFM, dovrebbe essere preso in considerazione un approccio alternativo come il microtomo24, 58 o la criosezione27 nel piano sagittale.

Un aspetto importante che non viene affrontato nel protocollo principale è l'analisi dei dati delle immagini. Per l'analisi delle miofibre IFM in immagini 10x o 20x (Figura 6A-D, Figura 7A, B, E, F, I, J), l'analisi standard include la determinazione se le miofibre sono attaccate e se la morfologia grossolana della miofibra è intatta37, 38. Esempi di parametri che possono essere quantificati, a seconda dell'esperimento, includono la lunghezza, la larghezza, il numero, il numero attaccato o il numero di miofibre strappate37, 60. Uno dei principali vantaggi di questo protocollo è la compatibilità con la microscopia a fluorescenza e la capacità di analizzare la morfologia di sarcomeri e miofibrille a ingrandimenti più elevati di 60x o 100x (Figura 6E-H, Figura 7C, D, G, H, K, L). La morfologia del sarcomero deve essere analizzata in campioni privi di artefatti tecnici (Figura 6K-P). Un certo numero di possibili fenotipi di miofibrille e sarcomeri è stato precedentemente definito60. Più comunemente, la lunghezza e la larghezza del sarcomero sono misurate disegnando e misurando una linea da disco Z a disco Z nel software di elaborazione delle immagini, o alternativamente utilizzando uno dei numerosi strumenti automatizzati disponibili gratuitamente18, 45, 61. La valutazione della morfologia del sarcomero può essere migliorata includendo marcatori che etichettano il disco Z o la linea M, o i filamenti spessi o sottili30, 34,58. Questi dati possono essere utilizzati per descrivere quantitativamente i fenotipi di miofibra, miofibrilla e sarcomero tra un campione di controllo e un campione di prova preparati utilizzando questo protocollo di dissezione.

Gli utenti del protocollo devono essere consapevoli del fatto che, sebbene la fissazione preservi la morfologia della miofibra e del sarcomero, il fissativo, così come i tamponi e il mezzo di montaggio, possono causare il restringimento o il rigonfiamento dei tessuti e possono influenzare la misurazione dei parametri morfologici45. È noto che la fissazione e la disidratazione della glutaraldeide necessarie per la microscopia elettronica riducono il diametro del sarcomero43, mentre è stato dimostrato che la scuoiatura e la gliceratizzazione delle fibre aumentano il diametro del sarcomero44,45. Questo fenomeno può essere alla base delle differenze nei parametri dei sarcomeri in letteratura e sottolinea l'importanza di includere campioni di controllo e di test in ogni esperimento. Gli IFM di controllo e di prova devono essere elaborati simultaneamente negli stessi tamponi per un confronto accurato dei parametri quantitativi del sarcomero.

Questo protocollo dettagliato mira a rendere la dissezione IFM adulta e pupale per l'immunoistochimica e la microscopia a fluorescenza più accessibile ai Drosofili principianti e avanzati. Questo protocollo può essere adattato per l'uso con altri insetti e per altre tecniche di imaging come la microscopia crioelettronica (cryo-EM), l'ibridazione in situ a fluorescenza a singola molecola (smFISH) o la trascrittomica spaziale. La combinazione di potenti strumenti genetici per la Drosophila con la microscopia a fluorescenza offre opportunità uniche per studiare i principi conservati della miogenesi e della funzione muscolare. Poiché gli IFM sono anche suscettibili di approcci molecolari e biochimici26, 27, studi futuri che collegano i fenotipi molecolari alla morfologia muscolare, alla biologia cellulare e alla funzione forniranno una comprensione più profonda della miogenesi e dell'eziologia dei disturbi muscolari.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano Gregory Matera per aver fornito l'allele Smn E33 e per le utili discussioni su Smn. Gli autori ringraziano Frank Schnorrer, Cornelia Schoenbauer, Manuela Weitkunat e Aynur Kaya-Copur per le utili discussioni e il supporto. Gli autori ringraziano il centro di allevamento di Bloomington per la fornitura di mosche. Questo lavoro è stato supportato da finanziamenti iniziali della School of Science and Engineering dell'Università del Missouri Kansas City (UMKC), della Divisione di Sistemi Biologici e Biomedici (MLS), dell'UMKC Funding for Excellence Program (MLS) e dell'Ufficio UMKC per la ricerca universitaria e la borsa di studio creativa (SF, MLS).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastre di coltura tissutale da 60 mmFisher ScientificFB01292160 mm, polistirene
Acido Acetico, Glaciale (Certificato ACS)Fisher ScientificA38S-212
Adenosina Trifosfato (ATP)Millipore SigmaA1852
Carta stagnola, resistenteAmazon12 pollici. x 1000 ft.
Piatti di silicone nero per sezionare: polvere di carbone attivoMillipore SigmaC9157Disponibile anche nella maggior parte delle farmacie
Piatti dissezionatori in silicone nero: Sylgard 184Millipore Sigma761036Per preparare piatti sezionatori in silicio, combina i componenti Sylgard in un sacchetto ziploc e mescola bene. Aggiungi polvere di carbone attivo (~200 mg) a Sylgard (~50 g), mescola bene, taglia l'angolo della busta, riempi piastre di coltivazione da 60 mm, rimuovi le bolle con una punta di pipetta e indurisci durante la notte.
Vassoio per diapositive in cartone, Research Products International CorpFisher Scientific50-136-7558
Microscopio confocale, confocale invertita Nikon AXRNikonwww.microscope.healthcare.nikon.com/
Microscopio confocale, Zeiss LSM 780 confocale invertitaZeisswww.zeiss.com
Camera di allevamento degli insetti Darwin (Incubatrice)Fisher Scientific/Darwin ChambersIN034Incubatore a controllo di luce, temperatura e umidità
piatto dissezionale (vetro nero)Mikroskop Technik Diethelm398011Lymphbecken (ciotole per la tintura/serbatoi per linfa), vetro nero, 4x4 cm, con copertura in vetro trasparente
Pinza Dumont #3Strumenti scientifici di qualità11231-30Pinza Dumoxel a punta dritta da 12 cm con punta 0,17 x 0,1 mm  
Pinza Dumont #5Strumenti scientifici di qualità11252-20Pinza Inox a punta dritta da 11 cm, grado biologico con punta 0,05 x 0,02 mm  
EGTA (Acido Egazico)Millipore Sigma324626
Etanolo, Assoluto (200 proof)Fisher ScientificBP28184Grado di Biologia Molecolare
Vetro Fisherbrand Premium Cover (18 x 18 mm), copertineFisher Scientific12548AVetro, quadrato, spessore #1 (0,13 - 0,16 mm)
Vetro Fisherbrand Premium Cover (22 x 22 mm), copertineFisher Scientific12548BVetro, quadrato, spessore #1 (0,13 - 0,16 mm)
Piastre di coltura cellulare a fondo piatto (24 pozzi)Fisher Scientific7200740
telecamera a microscopio fluorescente dissezionante, telecamera Infinity8Teledyne (Visual Dynamix)6 megapixel, a scarsa luce, monocromatico
Vola: SMN[E33]Stock per mosche; dono di Gregorio Matera
Vola: w[1118]Centro Stock di BloomingtonRRID:BDSC_3605Materiale moschero
gliceroloFisher ScientificBP229-1Grado di Biologia Molecolare
Soluzione gliossissale (40% in peso in H2O)Millipore Sigma128465  Questa è una soluzione standard al 40%
Software di elaborazione immagini, Affinity Designer 2Affinitàhttps://affinity.serif.com/en-us/
Software di elaborazione immagini, Image J (Fiji)ImageJ2https://imagej.net/software/fiji/
Spille per insettiStrumenti scientifici di qualità26002-10Acciaio inossidabile, diametro 0,1 mm (perni Minutien)
Cloruro di magnesio (MgCl2)Fisher ScientificAA12315A1
Metanolo (HPLC)Fisher Chemical (Fisher Scientific)A452-4Rilassarsi a -20? Prima dell'uso
Vetri per microscopio, smerigliatiFisher Scientific12-550-400area di scrittura, non carica, 75 mm x 25 mm x 1 mm
Vetrine per microscopio, vetro sempliceFisher Scientific12-544-4Prepulito, 75 mm x 25 mm
Lame a microtomo MX35 Ultraepredia (Fisher Scientific)3053835Profilo basso, 34&£; angolo di taglio; Le lame C35 feather da 80mm funzionano bene
Smalto trasparente (Sally Hansen Xtreme Wear Polish)Amazon0,4 fl. oz.
Siero normale per capraMillipore SigmaS26-LITRI
Nutator (Mini Nutating Rocker, Benchmark)Midwest ScientificH3D102024 giri/min, fisso; 8 x 6 pollici. Piattaforma con tappetino con fossette
Pennello (Round n. 0)AmazonPennello rotondo n. 0 o simile da qualsiasi materiale d'arte
Paraformaldeide (PFA)Millipore Sigma158127-500G
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS): KClMillipore Sigma529552-250GMPreparare PBS secondo il Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS): KH2PO4Millipore SigmaP0662-500GPreparare PBS secondo il Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS): Na2HPO4Millipore SigmaS9763-500GPreparare PBS secondo il Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS): NaClFisher Chemical (Fisher Scientific)S271-1Preparare PBS secondo il Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
Punte per pipette PR1MA (10 & micro; L)Midwest ScientificPR10XLRK-NSUniversal 10 & micro; Punte a L pipette
Punte per pipette PR1MA (1000 & micro; L)Midwest ScientificPR-1000RK-FLUniversal 1000 & micro; Punte a L pipette
Punte per pipette PR1MA (200 & micro; L)Midwest ScientificPR-200RK-NSUniversal 200 & micro; Punte a L pipette
Rodamina-FaloidinaInvitrogen, Sonde MolecolariR415
Nastro adesivo scozzese doppio fronteScotch/3M (Graffette)649280Entrambi i lati rivestiti con adesivo, 0,5" x 7 yard, disponibili presso la maggior parte dei manipolatori di forniture per ufficio
Diidrogeno fosfato diidrato di sodio (NaH2PO4)Fisher ScientificAAA1131636
Software: GraphPad PrismGraphPad Prismwww.graphpad.com
Software: Infinity Analyze 7Teledyne (Visual Dynamix)https://www.teledynevisionsolutions.com/products/infinity-analyze/
Software: Microscoft ExcelMicrosofthttps://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
Tergicristalli delicati Kimwipes Kimwipes Kimwipes, 1 filoFisher Scientific06-666Salviette standard
Pipetta a trasferimentoFisher Scientific13-711-9AMMDPipetta di plastica
Trition X-100Millipore SigmaT9284-100ML
Forbici a molla VannasStrumenti scientifici di qualità15000-00Bordo da taglio da 3 mm, diametro della punta 0,05 mm, lunghezza 8 cm
Vectashield con DAPILaboratori VectorH-2000
Vectashield senza DAPILaboratori VectorH-1900
Carta WhatmanMillipore SigmaWHA1004070Cerchi per carta filtro, Grado 4, 70 mm
Microscopio stereo fluorescente Z10Visual Dynamix (Midwest Scientific)http://www.visualdynamix.net/
Microscopio stereo ergonomico z850 con zoom disseccantoVisual Dynamix (Midwest Scientific)http://www.visualdynamix.net/

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