Esplorazione dell'applicazione del biosensing basato su scattering Raman potenziato su superficie di singoli sEVs nella diagnosi e nelle terapie delle malattie

Summary

Qui presentiamo un protocollo per analizzare singole piccole vescicole extracellulari (sEV) utilizzando spettroscopia Raman potenziata superficiale senza etichettatura (SERS), consentendo diagnostiche e valutazioni minimamente invasive delle malattie come veicoli di somministrazione terapeutica.

Abstract

Questo protocollo delinea una piattaforma completa e priva di etichette che integra la spettroscopia Raman potenziata in superficie (SERS) con il machine learning (ML) per rilevare e profilare molecolarmente le singole piccole vescicole extracellulari (sEV) per applicazioni diagnostiche e terapeutiche. Il metodo inizia con l'isolamento sEV utilizzando cromatografia a esclusione di dimensione o ultracentrifugazione. Le vescicole isolate vengono quindi analizzate su substrati ingegnerizzati in nanopiramide plasmonica d'oro 2D capaci di sensibilità a una singola vescicola. Sfruttando impronte biochimiche intrinseche Raman, il protocollo consente una rilevazione ad alta specificità senza etichette esterne. Dopo l'acquisizione spettrale, i dati vengono pre-elaborati e analizzati utilizzando algoritmi di machine learning addestrati (ad esempio, LDA, SVC) per classificare gli stati patologici, distinguendo con successo il cancro gastrico dai controlli sani utilizzando sEVs provenienti da tessuto, plasma e saliva con rispettive accuratezze di classificazione del 90,1%, 70,9% e 60,7%. Inoltre, la sua applicazione terapeutica è dimostrata dalla quantificazione del carico di dossorubicina in singoli sEV, una misura migliorata dall'uso di substrati rivestiti di grafene come standard interno. Questo approccio consente un'analisi ad alto rendimento che cattura l'eterogeneità della popolazione essenziale per la diagnosi precoce della malattia e la comprensione dell'efficienza del carico dei farmaci a livello di vescicola singola.

Introduction

Piccole vescicole extracellulari (sEV), tipicamente con un diametro compreso tra 30 e 200 nm, vengono naturalmente secrete dalle cellule nei fluidi biologici e trasportano proteine, lipidi e acidi nucleici indicatori della loro cellula di^{origine 1,2,3}. Poiché biomarcatori non invasivi sono presenti in saliva, urina e altri fluidi^corporei, rappresentano potenziali per una diagnosi precoce della malattia, la prognosi e il monitoraggio terapeutico, specialmente in^oncologia

Protocol

La raccolta di esemplari umani è stata condotta in conformità con la Dichiarazione di Helsinki ed è stata approvata dal Consiglio di Revisione Istituzionale (IRB) dell'UCLA. Tutti i donatori hanno fornito un consenso informato scritto prima della loro partecipazione allo studio.

NOTA: In questo studio sono state utilizzate in totale 4 linee cellulari, AGS (CRL-1739), A549 (CCL-185), NCI-N87 (CRL-5822), Hs 738.St/Int (CRL-7869), tutte acquistate da un fornitore commerciale. Queste linee cellulari venivano coltivate e spedite rigorosamente secondo le istruzioni e i reagenti del fornitore. I mezzi condizionati....

Results

L'implementazione con successo del protocollo SERS a vescicola singola produce spettri Raman distinti rispetto ai singoli sEV, permettendo la classificazione diagnostica a valle e il monitoraggio del carico terapeutico dei farmaci. La Figura 1 mostra rispettivamente il flusso di lavoro dello studio diagnostico per il cancro gastrico e dell'applicazione di monitoraggio delle sEVs caricate di farmaci utilizzando il nostro protocollo riportato qui.

Discussion

Un aspetto fondamentale di questo protocollo è la preparazione del substrato e la purificazione del sEV. Le prestazioni del SERS senza etichettatura dipendono fortemente dalla produzione di substrati plasmonici uniformi e ad alto contenuto conformale con un forte "punto caldo" di potenziamento. Allo stesso modo, l'isolamento di sEV ad alta purezza tramite cromatografia a esclusione di dimensione è essenziale per rendere spettri SERS affidabili e riproducibili. Impurità come aggr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Thermo Fisher Scientific	J61196. AP
Griglia di rame a 300 mesh	Scienze della microscopia elettronica	EMS200-Cu
Soluzione paraformaldeide al 4%	Sigma Aldrich	1004960700
4″ Si wafers	MSE Supplies	WA0810	(100) orientato
Linea cellulare A549	ATCC	CCL-185
Linea cellulare AGS	ATCC	CRL-1739
Rotore centrifuga F-35-6-30, 5430	Eppendorf	22654306
CHA Mark 40	CHA Mark 40	https://chaindustries.com/mark-40-system/	Evaporazione a fascio elettronico
Soluzione con cr etchant	Sigma Aldrich	651826-500ML
Doxorubicina  D-4000	LC Laboratories	D-4000_3g
Sistema ExoView R100 e kit ExoView Human Tetraspanin	NanoView Biosciences	https://www.nowmedicalstudios. com/portfolio/nanoview- biosciences-3d-product-illustrations
Soluzione FeCl3	Sigma Aldrich	451649
Soluzione HF	Sigma Aldrich	695068-500ML
Linea cellulare Hs 738.St/Int	ATCC	CRL-7869
in Microscopio Raman confocale	Renishaw	https://www.renishaw.com/en/ invia-confocal-raman-microscope --6260?srsltid=AfmBOoqbZlyW qv2KDdcXV0UZnp8tdLNgYZ0 GbZvGOWI6z1OKi48rg5-b
Soluzione KOH	Sigma Aldrich	417661
Shaker da banco MaxQ 4000 per incubazione/refrigerazione	Thermo Scientific	SHKA4000 (4320)
Incubatore MCO-19AIC	SANYO	8380-30-0035
Filtro Millex-GP	MilliporeSigma	SLGPM33RS	0,22 & micro; m
Microscopio NanoSEM 230	FEI	SEM-FEI-014
Nanosight NS300	Malvern Panalytical	https://www.malvernpanalytical .com/en/support/supportoprodotto /nanosight-range/nanosight-ns300
Linea cellulare NCI-N87	ATCC	CRL-5822
Optima TLX Ultracentrifuga	Beckman Coulter	8043-30-1197
Oxford Plasmalab 80 Plus	Oxford Plasmalab	https://plasma.oxinst.com/ Prodotti/RIE/Plasmapro-800-RIE
Sfere di polistirene	Alfa Aesar	AA42711AB	500 nm
qEVoriginale/35 nm	Izon	ICO-35
Grafene a strato singolo	MSE Supplies	ME0408
Fiaschetta T-75	VWR	156800
TF20 EM ad alta risoluzione	FEI	https://eicn.cnsi.ucla.edu/project/fei-tf20-tem/
Soluzione di acetato di uranile	Scienze della microscopia elettronica	22400-1