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Articolo metodologico

Esplorazione dell'applicazione del biosensing basato su scattering Raman potenziato su superficie di singoli sEVs nella diagnosi e nelle terapie delle malattie

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DOI:

10.3791/69258

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13 marzo 2026

 ,  ,  , 
1Department of Materials Science and Engineering, University of California Los Angeles, 2Cornea Division, Stein Eye Institute, University of California Los Angeles

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per analizzare singole piccole vescicole extracellulari (sEV) utilizzando spettroscopia Raman potenziata superficiale senza etichettatura (SERS), consentendo diagnostiche e valutazioni minimamente invasive delle malattie come veicoli di somministrazione terapeutica.

Abstract

Questo protocollo delinea una piattaforma completa e priva di etichette che integra la spettroscopia Raman potenziata in superficie (SERS) con il machine learning (ML) per rilevare e profilare molecolarmente le singole piccole vescicole extracellulari (sEV) per applicazioni diagnostiche e terapeutiche. Il metodo inizia con l'isolamento sEV utilizzando cromatografia a esclusione di dimensione o ultracentrifugazione. Le vescicole isolate vengono quindi analizzate su substrati ingegnerizzati in nanopiramide plasmonica d'oro 2D capaci di sensibilità a una singola vescicola. Sfruttando impronte biochimiche intrinseche Raman, il protocollo consente una rilevazione ad alta specificità senza etichette esterne. Dopo l'acquisizione spettrale, i dati vengono pre-elaborati e analizzati utilizzando algoritmi di machine learning addestrati (ad esempio, LDA, SVC) per classificare gli stati patologici, distinguendo con successo il cancro gastrico dai controlli sani utilizzando sEVs provenienti da tessuto, plasma e saliva con rispettive accuratezze di classificazione del 90,1%, 70,9% e 60,7%. Inoltre, la sua applicazione terapeutica è dimostrata dalla quantificazione del carico di dossorubicina in singoli sEV, una misura migliorata dall'uso di substrati rivestiti di grafene come standard interno. Questo approccio consente un'analisi ad alto rendimento che cattura l'eterogeneità della popolazione essenziale per la diagnosi precoce della malattia e la comprensione dell'efficienza del carico dei farmaci a livello di vescicola singola.

Introduzione

Piccole vescicole extracellulari (sEV), tipicamente con un diametro compreso tra 30 e 200 nm, vengono naturalmente secrete dalle cellule nei fluidi biologici e trasportano proteine, lipidi e acidi nucleici indicatori della loro cellula diorigine 1,2,3. Poiché biomarcatori non invasivi sono presenti in saliva, urina e altri fluidicorporei, rappresentano potenziali per una diagnosi precoce della malattia, la prognosi e il monitoraggio terapeutico, specialmente inoncologia 5,6,7. Tuttavia, la loro traduzione clinica è ostacolata dalla loro alta eterogeneità e dalla bassa abbondanza nelle matrici biologichecomplesse 8. Per superare tali sfide, questo protocollo sfrutta la spettroscopia Raman potenziata in superficie (SERS), un potente metodo analitico capace di amplificare la diffusione Raman fino a10, 10-10 11 volte tramite substrati plasmonici9, 10, 11. SERS cattura gli spettri "impronte digitali" molecolari intrinseci dei singoli sEV in pochi secondi, consentendo un'analisi ultra-sensibile a vescicola singola evitando lunghi tempi di analisi.

Il nostro metodo combina sinergicamente SERS basati su etichetta senza etichetta per ottenere una caratterizzazione rapida e ultrasensibile dei singoli sEVs 12,13,14,15,16. Il SERS senza etichettatura cattura firme biochimiche intrinseche e, quando abbinato a modelli di apprendimento automatico come LDA, SVC, ha dimostrato di distinguere i sEV derivati da cellule sane da quelle malate con altaspecificità 13. Per migliorare ulteriormente la riproducibilità e la capacità quantitativa della nostra piattaforma, il nostro metodo è pienamente compatibile con i substrati Raman ricoperti digrafene 16. Il grafene a strato singolo offre una superficie chimicamente uniforme che stabilizza i punti caldi plasmonici e potenzia l'adsorbimentomolecolare 17,18, e cosa più importante, il grafene a strato singolo funge da indicatore "incorporato" dei segnaliSERS 12,19, che consente la capacità di quantificare le molecole rilevate. Nonostante il diametro del fascio laser Raman (~ 1 μm) sia maggiore rispetto al tipico sEV, la nostra piattaforma raggiunge una risoluzione efficace a vescicola singola grazie all'interazione unica tra meccanismi fisici e statistici. Il substrato quasi-periodico della nanopiramide d'oro genera "punti caldi" plasmonici altamente localizzati di dimensioni inferiori a 100 nm che amplificano i segnali Raman in modo superlineare 12. Di conseguenza, il segnale proveniente dal sEV stocasticamente più vicino al punto caldo più intenso all'interno del fascio domina lo spettro. Inoltre, l'imaging SEM conferma che i sEV sono ben distanziati (> 1 μm di distanza), minimizzando la sovrapposizione spettrale, mentre le mappe di intensità Raman rivelano una localizzazione del segnale che corrisponde alla dimensione delle singolevescicole 13,14. Insieme, queste caratteristiche garantiscono che ogni spettro raccolto corrisponda prevalentemente a un singolo sEV, permettendo un'analisi a vescicola singola statisticamente robusta e priva di etichette. Rispetto agli approcci convenzionali, come western blot, spettrometria di massa o scattering Raman regolare che richiedono grandi volumi di campioni e non possono risolvere le singolevescicole 20, la nostra piattaforma SERS a vescicola singola offre sensibilità, capacità e risoluzione molecolare superiori. Questo flusso di lavoro è appropriato per i ricercatori che mirano a sviluppare strumenti diagnostici minimamente invasivi e ad alta risoluzione o a esplorare l'eterogeneità del sEV e l'efficienza del carico dei farmaci in studi terapeutici individualizzati. In questo protocollo, dimostriamo come la nostra piattaforma SERS utilizzi singoli sEV per consentire la rilevazione di malattie e applicazioni terapeutiche, in particolare nel cancro, inclusi l'intero flusso di lavoro di isolamento delle vescicoline, preparazione del substrato plasmonico, acquisizione Raman e analisi dei dati con machine learning.

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Protocollo

La raccolta di esemplari umani è stata condotta in conformità con la Dichiarazione di Helsinki ed è stata approvata dal Consiglio di Revisione Istituzionale (IRB) dell'UCLA. Tutti i donatori hanno fornito un consenso informato scritto prima della loro partecipazione allo studio.

NOTA: In questo studio sono state utilizzate in totale 4 linee cellulari, AGS (CRL-1739), A549 (CCL-185), NCI-N87 (CRL-5822), Hs 738.St/Int (CRL-7869), tutte acquistate da un fornitore commerciale. Queste linee cellulari venivano coltivate e spedite rigorosamente secondo le istruzioni e i reagenti del fornitore. I mezzi condizionati venivano raccolti e conservati a -20 °C prima di essere lavorati. Al Samsung Medical Center in Corea, i donatori hanno donato volontariamente tessuti, plasma e campioni di saliva. Durante la resezione chirurgica è stato prelevato tessuto per il cancro gastrico, mentre biopsie dei controlli non oncologici sono state prelevate tramite endoscopia. Il plasma veniva raccolto in tubi EDTA secondo i protocolli clinici standard. Circa 5 mL di saliva intera non stimolata sono stati raccolti da ciascun soggetto, poi centrifugati a 2.600 × g per 15 minuti a 4 °C. Per preservare l'RNA extracellulare, il soprantantante è stato integrato con inibitore SUPERase-In RNase a 20 U/mL. Tutti gli esemplari sono stati conservati a -80 °C fino a ulteriori lavorazioni. i sEV sono stati isolati da mezzi condizionati e campioni clinici seguendo i protocollistabiliti 21.

1. isolamento e caratterizzazione del sEV

  1. Prepara campioni di sEV
    1. Scongelare completamente il supernatant cellulare sparso a temperatura ambiente.
    2. Far passare il soprantantante attraverso un filtro sterile a siringa da 0,22 μm per rimuovere detriti e contaminanti più grandi.
    3. Bilanciare una colonna di cromatografia a esclusione di dimensione (SEC) di 35 nm con una soluzione PBS di 1×.
    4. Applicare 500 μL del campione filtrato alla colonna.
    5. Elula il campione con 1x PBS secondo le istruzioni del produttore.
    6. Raccogli le frazioni arricchite con EV e conservale in fiale pulite a −20 °C.
  2. Determinare la concentrazione e la dimensione delle particelle
    1. Diluire i campioni di sEVs in DPBS sterile fino a una concentrazione finale di 10 7-10 9 particelle/mL.
    2. Utilizzando uno strumento di analisi per il tracciamento delle nanoparticelle, registra cinque video da 60 secondi per campione. Usa un livello della telecamera di 14 e una portata costante di 25.
    3. Analizza i video con il software dello strumento, applicando il fattore di diluizione per determinare la concentrazione finale delle particelle (particelle/mL) e il diametro medio (nm).
  3. Caratterizzare l'espressione della tetraspanina
    1. Chip di tetraspanin umani pre-scansione (1 cm × 1 cm, pre-rivestiti con anti-CD9, anti-CD63 e anti-CD81) per stabilire un segnale di base.
    2. Carica i campioni di sEV diluiti sui chip in una piastra sigillata a 24 pozzi e incuba durante la notte a temperatura ambiente.
    3. Aggiungere 35 μL di anticorpi di rilevamento (anti-CD9 CF488, anti-CD63 CF647, anti-CD81 CF555) e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
    4. Lava le patatine secondo il protocollo del produttore.
    5. Misurare l'espressione della tetraspanina vesicolare utilizzando un lettore di caratterizzazione di biomarcatori e il software di scansione associato.
  4. Conferma la morfologia del sEV con TEM
    1. Fissare i sEV di ~100 μL con ~100 μL di paraformaldeide al 4% per 30 minuti.
    2. Caricare circa 100 μL di sEV fissi su griglie di rame a 300 mesh e incubare per 5 minuti.
    3. Sciacquare le griglie con acqua deionizzata.
    4. Tingere le griglie con una soluzione all'1% di acetato di uranyle (~ 20 μL) in acqua distillata.
    5. Esegui un ultimo risciacquo con acqua e lascia asciugare completamente le griglie all'aria.
    6. Immagini dei campioni tramite microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per confermare la dimensione e la morfologia del sEV.

2. Fabbricazione di substrati plasmonici SERS 12,18,19

  1. Crea un monostrato di nanosfera
    1. Spargere sfere di polistirene di 500 nm di diametro su una superficie d'acqua all'interno di una vasca Langmuir-Blodgett.
    2. Comprimere delicatamente le sfere per formare uno strato esagonale compatto.
    3. Trasferire il monostrato sferico su un wafer di sili da 4 pollici (con ~50 nm termicoSiO 2) immergendo il wafer nella vasca e tirandolo lentamente verso l'alto.
  2. Array di nanosfere di incisione
    1. Ridurre il diametro della sfera da 500 nm a ~250 nm utilizzando un sistema di incisione a ioni reattivi con plasma di ossigeno (flusso di gasO2 a 100 sccm, 50 s, 200 W di potenza). Per maggiori dettagli sul processo di fabbricazione, si prega di consultare la pubblicazione del nostro lavoroprecedente 12,18,19.
    2. Depositare uno strato di Cr da 50 nm sulla matrice di sfere ridotte tramite evaporazione a fascio di elettroni a 1,5 Å per s.
    3. Sollevare le sfere di polistirene usando acetone per lasciare una maschera di Cr perforata sulla superficie diSiO 2 .
    4. Incisci lo strato diSiO 2 esposto nelle aperture Cr usando una miscela di 25 sccm Ar, 25 sccm CHF3, con potenza RIE a 200W per 2 minuti.
  3. Fabbricazione di piramidi rovesciate
    1. Immergi la wafer in KOH al 60% in peso a 60 °C per 2 minuti per incidere le fosse piramidali invertite nel silicio.
    2. Rimuovi la maschera Cr usando un incisivo Cr per 5 minuti.
    3. Rimuovere lo stratoSiO 2 con l'incisione ossida tamponata 6:1 fino a quando non è completamente pulita.
    4. Depositare un film Au da 200 nm conformemente sopra le piramidi invertite usando l'evaporazione tramite fascio di elettroni.
  4. Finalizzare il substrato plasmonico
    1. Applicare resina epossidica a polimerizzazione rapida (~1 mL) su un substrato separato diSiO 2/Si. Premere la wafer rivestita d'oro sull'epossidica per formare una struttura a sandwich con lo strato d'oro al centro.
    2. Speggi l'epossidica dallo stampo di silicio per formare un substrato Au plasmonico indipendente dopo che l'epossidica si è completamente indurita.

3. Trasferimento del grafene al substrato plasmonico

  1. Prepara la pellicola di grafene
    1. Preparare una soluzione diFeCl 3 da 1 M (una soluzione stock di 1 M di cloruro ferrico anidro è stata preparata dissolvendo 81 g diFeCl 3 in acqua deionizzata e diluendola fino a un volume finale di 500 mL) per incidere il substrato di rame da un foglio monostrato di grafene rivestito con PMMA.
    2. Posizionare il foglio di rame rivestito di grafene faccia in giù sulla superficie della soluzione di FeCl3 finché il rame non è completamente disciolto.
  2. Risciacquare la pellicola di grafene
    1. Utilizzando un vetrino di vetro pulito, trasferisci con cura la pellicola di grafene galleggiante in un bagno d'acqua deionizzato per risciacquare i residui di incisione.
    2. Ripeti questo passo di risciacquo tre volte.
  3. Trasferire il grafene al substrato
    1. Far galleggiare il substrato plasmonico SERS sotto il film di grafene nel bagno d'acqua DI finale.
    2. Solleva delicatamente il substrato per far sedimentare il grafene in modo uniforme sulla sua superficie.
    3. Asciugare all'aria il substrato rivestito di grafene a temperatura ambiente per 1 ora.
    4. Trasferiscilo in una camera a vuoto e asciugarlo a pressione ridotta a 180 °C per 1 ora.
  4. Pulire il substrato finale
    1. Immergi il substrato essiccato in un bagno di acetone a 50 °C per 1 ora per sciogliere il PMMA.
    2. Risciacqua il substrato tre volte con alcol isopropilico.
    3. Asciugare il substrato plasmonico pulito e trasferito con grafene in un essiccatore prima dell'uso.

4. Preparazione del campione SERS e acquisizione degli spettri

  1. Prepara il campione sul substrato
    1. Pipetta circa 5 μL del campione di sEV sul substrato plasmonico appropriato.
      NOTA: Per la quantificazione delle sEV cariche da farmaci, applicare vescicole al substrato oro-grafene. Per tutti gli altri esperimenti, usa un substrato plasmonico dorato semplice.
    2. Metti il substrato in un essiccatore e lascia asciugare completamente la goccia (~15 min).
  2. Calibrare il sistema Raman
    1. Trasferire il substrato su un microscopio Raman confocale.
    2. Avviare la raccolta dati utilizzando il software dello strumento (WiRE versione 4.4).
    3. Imposta il laser di eccitazione a 785 nm a 5 mW.
    4. Calibrare il sistema allineando il picco di riferimento del silicio a 520 cm-1.
  3. Acquisire spettri da substrato d'oro (diagnostica)
    1. Eseguire una scansione di ricognizione su un'area di 300 μm × 300 μm per localizzare singole vescicole usando la modalità statica con le seguenti impostazioni: 50% di potenza, esposizione di 0,1 s, dimensione di passo di 10 μm.
    2. Dopo aver individuato i sEV, esegui una mappatura ad alta risoluzione in modalità statica all'interno di una griglia 5 × 5 utilizzando le seguenti impostazioni: passo di 1 μm, 50% di potenza, 0,2 s di esposizione per punto.
  4. Acquisire spettri da substrato di grafene (terapeutici)
    1. Eseguire una scansione di ricognizione su un'area di 300 μm × 300 μm per individuare singole vescicole in modalità statica con le seguenti impostazioni: 50% potenza laser, esposizione 0,1 s, dimensione di passo di 10 μm.
    2. Eseguire mappatura ad alta risoluzione in modalità estesa con una griglia 2 × 2 utilizzando le seguenti impostazioni: passo di 1 μm, potenza laser dell'1%, esposizione a 10 secondi.

5. Preprocessing dei dati

  1. Eseguire il controllo spettrale della qualità
    1. Schermare gli spettri grezzi iniziali per escludere segnali altamente rumorosi o spettri con forme anomale.
    2. Rimuovere picchi isolati di raggi cosmici utilizzando rilevamento basato su soglia o filtraggio a deviazione locale.
  2. Filtrare e normalizzare gli spettri
    1. Applicare un filtro Savitzky-Golay a ciascun spettro per ridurre il fondo di fluorescenza e uniformare i dati.
    2. Calcola il rapporto segnale-rumore (SNR) di ogni spettro, tipicamente utilizzando il metodo del rapporto picco-base o il metodo della deviazione standard. Per spiegare meglio, tipicamente il SNR per ogni spettro veniva calcolato come il rapporto tra l'intensità di picco (dopo la sottrazione di base) a una banda Raman rappresentativa e la deviazione standard del rumore. Il rumore è stato stimato dallo spettro residuo ottenuto sottraendo una versione dello spettro smussata da Savitzky-Golay (dimensione della finestra = 11, ordine polinomiale = 3) dallo spettro originale, isolando così le fluttuazioni ad alta frequenza. Per determinare empiricamente una soglia SNR appropriata, tutti gli spettri sono stati classificati in ordine crescente di SNR, e la persistenza di picchi biochimici caratteristici - in particolare la banda della fenilalanina (~1002 cm-1 , amminoacido), la banda ammidica I (~1650 cm-1 , proteina) e la banda di deformazioneCH-2 (~1440 cm-1 , lipidi) - è stata valutata attraverso gli spettri classificati. La soglia era fissata nel punto in cui uno qualsiasi di questi picchi diagnostici scompariva costantemente nel rumore di base. Per il nostro substrato SERS a nanopiramide d'oro e i parametri di acquisizione (eccitazione di 785 nm, potenza laser di 5 mW, integrazione di 0,2 s), ciò corrispondeva empiricamente a una soglia SNR di 28.
    3. Escludere qualsiasi spettro che si scenda sotto la soglia SNR come deciso secondo la 5.2.2 sopra. Nel nostro flusso di lavoro, gli spettri con SNR inferiore a 28 sono stati esclusi dal dataset di addestramento, poiché fissare la soglia a questo livello garantisce che vengano mantenuti solo spettri di alta qualità per l'analisi a valle e il miglioramento della robustezza del modello.
    4. Normalizzare ogni spettro sia all'intensità massima di picco sia all'area totale sotto la curva.

6. Analisi spettrale con apprendimento automatico

  1. Allena il modello
    1. Assegnare un'etichetta a ogni misura spettrale corrispondente alla sua origine (ad esempio, paziente con cancro gastrico vs. controllo sano).
    2. Inserire i dati spettrali in un Support Vector Classifier (SVC) con un kernel lineare.
    3. Usa una divisione stratificata per la validazione incrociata a 5 volte.
    4. Mediare le metriche di accuratezza di ogni piega per valutare le prestazioni del modello.
  2. Ridurre la dimensionalità e classificare
    1. Utilizzare l'Analisi Discriminante Lineare (LDA) per visualizzare dati SERS ad alta dimensione in dimensioni ridotte.
    2. Utilizzare il modello LDA per la classificazione diretta tra gruppi campionari.
  3. Valutare il modello
    1. Valutare i modelli addestrati su un set di campioni di pazienti ciechi per simulare uno scenario diagnostico reale. Per maggiori informazioni, si prega di consultare queste pubblicazioni del nostro gruppo13, 15, 22.
      NOTA: Esegui tutti i passaggi con utensili puliti in un ambiente privo di polvere. Il grafene monostrato è stato coltivato o ottenuto su un substrato di rame e rivestito con uno strato di PMMA per proteggerlo durante il trasferimento.

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Risultati

L'implementazione con successo del protocollo SERS a vescicola singola produce spettri Raman distinti rispetto ai singoli sEV, permettendo la classificazione diagnostica a valle e il monitoraggio del carico terapeutico dei farmaci. La Figura 1 mostra rispettivamente il flusso di lavoro dello studio diagnostico per il cancro gastrico e dell'applicazione di monitoraggio delle sEVs caricate di farmaci utilizzando il nostro protocollo riportato qui.

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Discussione

Un aspetto fondamentale di questo protocollo è la preparazione del substrato e la purificazione del sEV. Le prestazioni del SERS senza etichettatura dipendono fortemente dalla produzione di substrati plasmonici uniformi e ad alto contenuto conformale con un forte "punto caldo" di potenziamento. Allo stesso modo, l'isolamento di sEV ad alta purezza tramite cromatografia a esclusione di dimensione è essenziale per rendere spettri SERS affidabili e riproducibili. Impurità come aggr...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse legati a quest'opera.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Center for Advancing Translational Sciences dei National Institutes of Health con i numeri di assegnazione 4UH3TR002978-03 e 1U18TR003778-01, e da una sovvenzione del California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (Grant Number TRAN1-14649).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1x PBSThermo Fisher ScientificJ61196. AP
Griglia di rame a 300 meshScienze della microscopia elettronicaEMS200-Cu
Soluzione paraformaldeide al 4%Sigma Aldrich1004960700
4″ Si wafers MSE SuppliesWA0810(100) orientato 
Linea cellulare A549ATCCCCL-185 
Linea cellulare AGSATCCCRL-1739
Rotore centrifuga F-35-6-30, 5430Eppendorf22654306
CHA Mark 40CHA Mark 40https://chaindustries.com/mark-40-system/Evaporazione a fascio elettronico
Soluzione con cr etchantSigma Aldrich651826-500ML
Doxorubicina  D-4000LC LaboratoriesD-4000_3g
Sistema ExoView R100 e kit ExoView Human TetraspaninNanoView Bioscienceshttps://www.nowmedicalstudios.
com/portfolio/nanoview-
biosciences-3d-product-illustrations
Soluzione FeCl3Sigma Aldrich451649
Soluzione HFSigma Aldrich695068-500ML
Linea cellulare Hs 738.St/IntATCCCRL-7869
in Microscopio Raman confocaleRenishawhttps://www.renishaw.com/en/
invia-confocal-raman-microscope
--6260?srsltid=AfmBOoqbZlyW
qv2KDdcXV0UZnp8tdLNgYZ0
GbZvGOWI6z1OKi48rg5-b
Soluzione KOHSigma Aldrich417661
Shaker da banco MaxQ 4000 per incubazione/refrigerazioneThermo ScientificSHKA4000 (4320)
Incubatore MCO-19AICSANYO8380-30-0035
Filtro Millex-GPMilliporeSigmaSLGPM33RS  0,22 & micro; m
Microscopio NanoSEM 230FEISEM-FEI-014 
Nanosight NS300Malvern Panalyticalhttps://www.malvernpanalytical
.com/en/support/supportoprodotto
/nanosight-range/nanosight-ns300
Linea cellulare NCI-N87ATCCCRL-5822
Optima TLX UltracentrifugaBeckman Coulter8043-30-1197
Oxford Plasmalab 80 PlusOxford Plasmalabhttps://plasma.oxinst.com/
Prodotti/RIE/Plasmapro-800-RIE
Sfere di polistireneAlfa AesarAA42711AB500 nm
qEVoriginale/35 nmIzonICO-35
Grafene a strato singoloMSE SuppliesME0408
Fiaschetta T-75VWR156800
TF20 EM ad alta risoluzioneFEIhttps://eicn.cnsi.ucla.edu/project/fei-tf20-tem/
Soluzione di acetato di uranileScienze della microscopia elettronica22400-1

Riferimenti

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