Analisi basata su dati TCGA e dati a singola cella, prendendo TRPM4 come esempio

Summary

Qui presentiamo un protocollo per analizzare a fondo il ruolo di un singolo gene nel cancro della vescica (BLCA) basato sull'analisi del trascrittoma e sull'analisi a singola cellula, insieme all'utilizzo di 101 algoritmi di apprendimento automatico, per costruire un modello prognostico per il singolo gene menzionato.

Abstract

In questo articolo viene introdotto un metodo di analisi basato su dataset trascrivomici pubblici e dataset monocellulari, che potrebbe essere utilizzato per descrivere in modo completo il ruolo di singoli geni nei tumori, inclusa la modellazione del microambiente immunitario tumorale, la modellazione dei sottotipi molecolari tumorali e la previsione della prognosi dei pazienti tumorali. Allo stesso tempo, l'introduzione di dati su un singolo gene può non solo evitare la casualità e l'eterogeneità causate dall'analisi di un singolo trascritoma, ma permettere anche un'esplorazione più approfondita di quali specifici cluster di cellule si esprime il gene, oltre a ulteriori ricerche sul ruolo che il gene svolge all'interno della via. Considerando che molti ricercatori potrebbero non essere competenti nell'analisi a singola cellula, in questo articolo metodico viene introdotto un sito web chiamato TISCH2 (http://tisch.compbio.cn/), aiutando così tutti a completare l'analisi a singola cellula. Inoltre, l'applicazione dei metodi 101 di apprendimento automatico ha svolto un ruolo indispensabile nella costruzione del modello prognostico più accurato. In conclusione, si ritiene che questo metodo integrato di analisi a singolo gene, che combina analisi bioinformatica, apprendimento automatico e analisi a singola cellula, possa svolgere un ruolo indispensabile e cruciale nello studio delle funzioni dei singoli geni nella progressione tumorale, così come nello studio delle funzioni dei singoli geni nelle vie di navigazione.

Introduction

Come tutti sappiamo, il cancro alla vescica (BLCA) è uno dei tumori maligni più aggressivi e metastatici al mondo, e ci sono ancora problemi con i biomarcatori attuali del cancro alla vescica, come l'imprecisione e^{così via.} Per identificare la prognosi dei pazienti BLCA e prevedere gli esiti dei pazienti BLCA, la ricerca di biomarcatori per il cancro della vescica e l'istituzione di modelli prognostici sono di grande importanza. Sebbene si siano sviluppati alcuni metodi di ricerca per i biomarcatori, la maggior parte di questi metodi è attualmente limitata alla trascrittomica, il che inevitabilmente porta a un'eterogeneità nei^{campioni 2}. Inoltre, lo studio dei dati trasscrittomici da solo spesso non riesce a indagare i ruoli svolti dalle diverse sottopopolazioni cellulari, così come le funzioni dei geni in diversi percorsi a livello di singola cellula, il che rende le ricerche passate meno precise ed^{efficaci 3}. Considerando che l'analisi a singola cellula potrebbe essere impegnativa per i principianti, è stata introdotta una piattaforma online per l'analisi a singola cellula per aiutarli ad apprendere rapidamente le competenze⁴. Infine, anche se un singolo gene viene trovato come biomarcatore adatto tramite analisi trascrictomica e analisi a singola cellula, non vi è alcuna garanzia che il biomarcatore sia applicabile a tutte le coorti, quindi è necessario costruire modelli prognostici associati al biomarcatore per rendere le conclusioni più universalmente^{applicabili 5}. L'algoritmo 101 di apprendimento automatico si riferisce alla costruzione di modelli di prognosi 101 utilizzando una combinazione di 10 diversi algoritmi di apprendimento automatico, con l'obiettivo di identificare il modello di prognosi ottimale. L'inclusione di algoritmi come random forest, XGBoost e SVM, più capaci di gestire dati complessi e di maggiore stabilità, ha portato a questo algoritmo combinato a dimostrare una stabilità notevole. Per rendere questo modello prognostico più accurato e rilevante per il biomarcatore, viene prima condotta un'analisi di correlazione tra tutti i geni e il biomarcatore, poi si selezionano circa 20-30 geni in base ai requisiti, e successivamente si utilizza un algoritmo di apprendimento automatico 101 per costruire il modello prognostico, seguito da una serie di analisi per finalizzare i risultati.

Rispetto ai biomarcatori previsti dall'analisi semplice di trascritomica degli^{ultimi 6}, i biomarcatori dell'analisi monocellulare e trascricomica permettono una scomposizione imparziale di tessuti o campioni nei loro componenti cellulari di base. Permette la chiara differenziazione di diversi tipi cellulari (come cellule T, cellule B e macrofagi) e la scoperta di nuove sottopopolazioni (come le cellule T esaurite e le cellule T regolatorie), oltre alla cattura di processi dinamici continui (come le traiettorie di differenziazione cellulare⁾⁴. È simile a disporre frutta e latte separatamente, permettendo una visualizzazione chiara di ogni componente e della sua quantità. Rispetto ai modelli^{Cox a coorte singola 7}, il modello prognostico costruito utilizzando il machine learning 101 è anch'esso più accurato e scientificamente valido, poiché può apprendere automaticamente le complesse interazioni non lineari tra variabili dai dati. Ad esempio, l'impatto di una specifica mutazione genetica potrebbe essere significativo solo in pazienti di determinate edi età e dimensioni tumorali. Modelli di machine learning come foreste casuali e reti neurali possono catturare automaticamente queste interazioni di alto ordine senza la necessità di una specifica^{manuale 8}. I vincoli chiave di applicabilità della segnalazione che il dataset utilizzato per l'analisi devono includere la stragrande maggioranza dei geni, senza che il numero di geni sia troppo basso e il numero di geni usati per costruire modelli prognostici non troppo elevato, generalmente mantenuto intorno a 20-30, essendo ottimale. Lo standard di controllo qualità del set di singole cellule dovrebbe essere superiore a 1000, il conteggio di UMI per cellula dovrebbe essere superiore a 1000 e il numero di geni per cellula dovrebbe essere superiore a 500⁹.

Qui viene fornito un approccio passo dopo passo per l'identificazione di nuovi biomarcatori da dataset trascrivomici pubblici e da dataset monocellulari, prendendo come esempio il ruolo di TRPM4 nel BLCA. Vengono impiegati molteplici metodi di ricerca e dataset diversificati — tra cui il dataset Cancer Genome Atlas-Bladder Cancer (TCGA-BLCA), il dataset monocellulare GSE145281 e i dataset BLCA GSE32894 e GSE31684 — per migliorare la precisione e l'applicabilità dei biomarcatori in oncologia da molteplici prospettive e per far avanzare lo studio del TRPM4 in BLCA. Il dataset TCGA-BLCA è stato ottenuto dal sito web Xena dell'Università della California, Santa Cruz (UCSC Xena). GSE32894 e GSE31684 sono stati scaricati dall'Omnibus di Espressione Genica (GEO), e i dati a cellula singola GSE145281 sono stati ottenuti dal Tumor Immune Single-Cell Hub 2 (TISCH2). Inoltre, sono stati estratti dati sui sottotipi molecolari BLCA e sulle risposte al trattamento da file supplementari di fogli di calcolo di un articolo pertinente. Vengono quindi condotte analisi bioinformatiche, analisi a cellula singola e apprendimento automatico, stabilendo una metodologia integrata di ricerca su un singolo gene.

Protocol

NOTA: Tutti i codici utilizzati in questo articolo sono disponibili sul sito web https://github.com/YaoGeng-nmu/Analysis-of-TRPM4-based-on-TCGA-data-and-single-cell-data-in-BLCA/blob/main/code.

1. Preparazione dei dati di trascrivomica

1. Preparazione del dataset TCGA-BLCA
   1. Scarica tutti i dataset TCGA dal sito UCSC Xena (https://xenabrowser.net/datapages/)¹⁰. I dataset scaricati sono pre-elaborati, eliminando la necessità di lavori aggiuntivi come l'annotazione^{genica 11}.
   2. Seleziona il dataset TCGA e poi clicca sul dataset TCGA-BLCAt. Poi, vai alla pagina del dataset TCGA-BLCA, clicca su RNA-seq di espressione genica e scarica i dati clinici e i profili di espressione genica dal dataset TCGA-BLCA. In questo dataset, assicurati che ci siano dati sull'espressione dell'mRNA di 400 pazienti BLCA.
   3. Per differenziare i campioni tumorali da quelli di tessuto normale adiacenti, si separano i campioni con le terminazioni 01 e 11 poiché i campioni con 01 indicano campioni tumorali, mentre i campioni con 11 indicano tessuti adiacenti al cancro (campioni normali).
2. Preparazione di GSE32894 e GSE31684
   1. Clicca sul sito web del GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) per scaricare il dataset BLCA GSE32894 e GSE31684^12,13.
   2. Dopo aver cliccato sulle Voci Rispettive nell'angolo in alto a destra, assicurati di spostarti nelle pagine per i dataset GSE32894 e GSE31684.
   3. Successivamente, scarica i rispettivi dati sull'mRNA, i dati clinici e i dati di sopravvivenza per GSE32894. Clicca sul pulsante http del dataset GSE32894. Inoltre, scarica i dati GPL6947 della piattaforma usando il pulsante della piattaforma. Clicca sul pulsante della matrice serie e scarica GSE32894 dopo aver cliccato sul pulsante GSE32894_series_matrix.txt.gz quando si scaricano i dati mRNA, i dati clinici e i dati di sopravvivenza per GSE32894.
   4. Scarica i rispettivi dati sull'mRNA, i dati clinici e i dati di sopravvivenza per GSE31684. Clicca sul pulsante http del dataset GSE31684. Inoltre, scarica i dati della piattaforma GPL570 usando il pulsante della piattaforma. Clicca sul pulsante File/i della Matrice Serie e scarica GSE31684 dopo aver cliccato sul pulsante GSE31684_series_matrix.txt.gz quando scarica dati di mRNA, dati clinici e dati di sopravvivenza per GSE31684.
   5. Nel passaggio di filtraggio, rimuovere geni privi di significato, come quelli con un livello di espressione pari a zero o vicino a zero. Impiega il metodo ComBat, basato sul pacchetto^{SVA 14}, per la correzione batch.

2. Preparazione dell'analisi a singola cellula

1. Preparazione di GSE145281
   1. Per condurre ricerche a livello di singola cellula, trovare il dataset BLCA di singola cellula, considerando che i dati trascricomici da soli non sono sufficienti per determinare quale cluster cellulare esprima TRPM4 in modo più significativo.
   2. Qui, vai su TISCH2 (http://tisch.compbio.cn/), un sito web dedicato all'analisi monocellulare dei tumori.
   3. Secondo le esigenze sperimentali, si seleziona il tipo di cancro necessario, usando BLCA come esempio in questo caso.
   4. Clicca sul pulsante BLCA , scegliendo il dataset chiamato GSE145281.

3. Preparazione dei sottotipi molecolari del BLCA e risposta ai dati sulle scelte terapeutiche

1. Scarica i dati sui sottotipi molecolari del BLCA e sulla risposta alle scelte terapeutiche dall'articolo citato^{qui 15}.
2. Apri il sito web di PubMed (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/). Cerca l'articolo e clicca su Tabelle Supplementari. In questo pacchetto di file compressi sono presenti in totale 18 file.

4. Analisi del microambiente immunitario BLCA di TRPM4

1. Grafico di mappa termica dell'espressione di 133 immunomodulatori in diversi gruppi TRPM4
   1. Secondo l'espressione di TRPM4, si dividono tutti i campioni di BLCA in gruppo ad alto TRPM4 e gruppo a basso TRPM4 .
   2. Copiare separatamente tutti i nomi dei campioni e i dati di espressione TRPM4 , poi ordinarli in ordine decrescente di espressione TRPM4 e categorizzare la prima metà dei campioni nel gruppo ad alto TRPM4 e la seconda metà nel gruppo a basso TRPM4 nella colonna del gruppo secondo l'espressione TRPM4 . Tutte le identificazioni dei pazienti TCGA-BLCA sono elencate nella Tabella Supplementare 1.
   3. Installare i pacchetti R necessari per l'analisi dei dati trascridemici. Apporta piccole modifiche al codice fornito, come cambiare la posizione del file, e poi eseguire il codice. Controlla attentamente se gli ID geni e quelli degli immunomodulatori siano correttamente corrispondenti, assicurandoti che non ci siano spazi o altri fattori poco appariscenti dopo gli ID genici, poiché questi sono le cause principali della fallita generazione della mappa termica.
2. Analisi stromale e immunologica di campioni tumorali utilizzando il pacchetto ESTIMATE R
   1. Assicurati che tutti i pacchetti R necessari per l'analisi dei dati trascritomici siano installati. Secondo i requisiti del codice, si nominino i dati richiesti con i nomi corrispondenti, poi clicca sul pulsante Run .
      NOTA: È importante ricordare che questo sito offre anche funzionalità di analisi online. Sebbene sia possibile ottenere i risultati desiderati visitando il sito web (https://bioinformatics.mdanderson.org/estimate/rpackage.html), questo metodo non è adatto per analizzare dati raccolti da loro stessi.
   2. Clicca sul pulsante Malattia e scegli l'opzione Carcinoma uroteliale della vescica . Poi, seleziona il pulsante RNA-seq-V2 della piattaforma. Scarica il punteggio stromal, immunitario e stima di tutti i campioni.
3. Grafico per violino dell'espressione tra diversi gruppi TRPM4
   1. Installa tutti i pacchetti R necessari per l'analisi dei dati trasscrittomici. Tutti i pacchetti R necessari sono elencati nella Tabella Supplementare 2. Secondo i requisiti del codice, si nominino i dati richiesti con i nomi corrispondenti, poi clicca sul pulsante Run.
   2. Assicurati di verificare attentamente che gli ID geni siano inseriti correttamente, assicurandoti che non ci siano spazi o altri fattori poco appariscenti alla fine degli ID genici, poiché questi sono le principali cause di fallimento nella creazione dei grafici di violino.
4. Grafico di mappa termica triangolare tra diversi gruppi TRPM4
   1. Installa tutti i pacchetti R necessari per l'analisi dei dati trasscrittomi. Assicurati di preparare i dati di espressione di diversi geni dei checkpoint immunitari, come TIGIT e CD80. Apri i dati del trascritoma TCGA-BLCA e poi cerca ogni voce singolarmente, dato che il numero di geni dei checkpoint immunitari non è esteso.
   2. Secondo i requisiti del codice, si nominino i dati richiesti con i nomi corrispondenti, poi clicca sul pulsante Run .
5. Grafico di correlazione tra geni diversi e TRPM4
   1. Installa tutti i pacchetti R necessari per l'analisi dei dati trasscrittomi. Compila TRPM4 come primo gene e aggiungi il gene in fase di ricerca come secondo gene, che in questo caso è CD3E .
   2. Dopo aver cliccato sul pulsante Run , assicurati di cambiare CD3E con altri geni da analizzare, come CTLA4.

5. Analisi a singola cella di TRPM4 nel dataset GSE145281

1. BLCA GSE145281 analisi di dataset utilizzando l'analisi a singola cellula
   1. Entra nel sito web e clicca su BLCA. L'analisi a singola cellula consente un'esplorazione più approfondita di quale cluster cellulare presenta un'alta espressione di TRPM4 rispetto all'analisi trasscrittomica. Assicurati che i dati di analisi delle singole cellule siano raccolti da GSE130001 e confrontati con lo standard di controllo qualità che il numero di cellule per dataset debba essere superiore a 1000, il conteggio UMI per cellula debba essere superiore a 1000 e il numero genico per cellula superiore a 500. I geni espressi differenzialmente di ciascun cluster rispetto a tutte le altre cellule sono identificati in base al cambiamento della piega trasformata log-in (|logFC| >= 0,25), e la risoluzione di clustering dovrebbe essere 0,5.
2. Annotazione delle celle per diversi cluster di celle
   1. Assicurati che tutti i cluster di celle siano annotati. Ad esempio, le cellule B possono essere annotate da CD19, MS4A1, CD27, IGHD, IGHM, TCL1A e FCRL5. Tutti i geni utilizzati per l'annotazione cellulare si trovano nella Tabella Supplementare 3.
   2. Poi, scegli GSE145281 e scarica tutti i risultati di TRPM4. Clicca sul pulsante Generale e scarica il grafico UMAP di GSE145281 di diversi cluster e tipi di cellule.
   3. Clicca sul pulsante Gene e scegli il singolo gene da analizzare. Clicca sul pulsante GSEA e osserva le funzioni di questo singolo gene attraverso varie vie di contatto, come la via KEGG e la via^{Hallmark 16,17}.
   4. Clicca sul pulsante CCI e trova il grafico della chat cellulare e il grafico della bolla del cluster che esprimono fortemente un singolo gene.
   5. Clicca sul pulsante di arricchimento TF per vedere il Facteur di Trascrizione arricchito per ogni cluster.

6. 101 Apprendimento automatico per costruire un modello prognostico relativo a TRPM4

1. Installa tutti i pacchetti R necessari per l'analisi dei dati trasscrittomici. Considerando che un singolo approccio di machine learning potrebbe non essere sempre il metodo ottimale per prevedere la prognosi, un modello di prognosi può essere costruito utilizzando tecniche di machine learning 101. Condurre un'analisi di correlazione tra tutti i geni della coorte TCGA-BLCA e le GSE32894 e GSE31684 coorti e TRPM4.
2. In base al numero di geni fortemente associati a TRPM4, si selezionano tutti i geni con correlazione maggiore o uguale a 0,6 o inferiore o uguale a -0,6 con TRPM4. Seleziona tutti i geni fortemente associati a TRPM4 in tutte le coorti.
3. Combina tutti i dati provenienti da GSE32894 e GSE31684 coorti per formare un set di validazione e utilizzare TCGA-BLCA come set di addestramento.
4. Secondo i requisiti del codice, si nominino i dati richiesti con i nomi corrispondenti, poi clicca sul pulsante Run .

Results

È noto che il beneficio principale dell'uso della trascritomica per analizzare il microambiente immunitario dei singoli geni è che consente una correlazione diretta tra i singoli geni e le interazioni dinamiche con cellule e molecole immunitarie a livello di espressione genica, consentendo l'osservazione diretta delle caratteristiche immunitarie e l'identificazione delle differenze nella proporzione di cellule immunitarie che si infiltrano tra gruppi con alta o bassa espressione di singo...

Discussion

In studi precedenti, l'analisi bioinformatica di singoli geni spesso incontrava problemi come superficialità, imprecisione e applicabilità^{limitata 19}. Inoltre, le ricerche precedenti su singoli geni si sono solitamente limitate ai dati trascritomico. Inoltre, concentrandosi esclusivamente sui dati trascrivistivi, possono sorgere problemi come l'eterogeneità del campione e la casualità, rendendo difficile identificare schemi^{universali 20}. Pe...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
R 4.3.3	nessuna	nessuna	nessuna