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Articolo di ricerca

Protezione cardio-cerebrale tramite elettroagopuntura in un modello murino di ipossia cronica

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DOI:

10.3791/69329

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31 marzo 2026

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1Heilongjiang University of Chinese Medicine, 2Hebei Medical University, 3Chengde Medical University, 4Hebei Province Key Lab. of Research and Development for Chinese Medicine, Chinese Medicine Research Institute, Chengde Medical University, 5Hebei University of Chinese Medicine, 6The Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine, 7State Key Laboratory for Innovation and Transformation of Luobing Theory

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo studio ha stabilito un modello murino per ipossia cronica di 12 settimane per indagare la protezione cardio-cerebrale dell'elettroagopuntura. I risultati hanno dimostrato che la stimolazione elettroagopuntura nei punti di agopuntura comunemente usati per migliorare la funzione cognitiva non solo ha aumentato la funzione cognitiva, ma anche alleviato la disfunzione cardiaca e ridotto i danni patologici nel tessuto miocardico.

Abstract

Questo studio ha stabilito un modello murino per ipossia cronica di 12 settimane per indagare gli effetti protettivi cardio-cerebrali dell'elettroagopuntura. Gli approcci terapeutici esistenti per i disturbi correlati all'ipossia, come la terapia con ossigeno iperbarico e alcuni farmaci, sono spesso limitati da scarsa accessibilità o da meccanismi a bersaglio singolo. Per colmare questa lacuna, abbiamo ipotizzato che la stimolazione dell'EA nei punti di agopuntura tradizionalmente impiegati per il miglioramento cognitivo potesse migliorare contemporaneamente sia le funzioni cognitive che cardiache in condizioni ipossiche croniche. Trenta maschi di topi C57BL/6J sono stati assegnati casualmente in tre gruppi: gruppo di controllo (Con), gruppo modello per ipossia cronica (CH) e gruppo per ipossia cronica più trattamento elettroagopuntura (CH+EA). I gruppi CH e CH+EA sono stati esposti a un ambiente ipossico (10,0% ± 0,5% O₂) per 8 ore al giorno in 12 settimane, mentre il gruppo CH+EA ha inoltre subito stimolazione giornaliera EA a GV20, GV24 e ST36 bilaterale nelle ultime 2 settimane. Test comportamentali, valutazione ecocardiografica e analisi istopatologiche hanno rivelato che l'EA non solo alleviava significativamente i comportamenti simili all'ansia e migliorava la memoria spaziale, ma migliorava anche molteplici parametri della funzione cardiaca, riducendo al contempo i danni neuronali dell'ippocampo e il rimodellamento miocardico. Questi risultati dimostrano che l'EA conferisce effetti protettivi cardio-cerebrali, che si allineano con il "concetto olistico" della Medicina Tradizionale Cinese, fornendo così una nuova strategia di intervento non farmacologico per le comorbidità cardiocerebrali correlate all'ipossia.

Introduzione

L'ipossia rappresenta una sfida patologica comune in varie condizioni, inclusi ambienti ad alta quota, broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), malattie cardiocerebrovascolari, oltre a scenari specializzati come operazioni aerospaziali e subacquee, potenzialmente portando a compromissioni funzionali multiorganiche. Essendo gli organi con il maggior consumo di ossigeno nel corpo, cervello e cuore sono particolarmente vulnerabili ai danni ipossici. Gli studi dimostrano che la prevalenza del deficit cognitivo nei pazienti con BPCO varia dal 32% all'88%1,2, mentre l'incidenza di disfunzione cardiaca raggiunge fino al 70%. Gli studi hanno dimostrato che l'ipossia cronica induce disfunzioni mitocondriali cerebrali, provocando successivamente stress ossidativo, sovraccarico di calcio e neuroinfiammazione, che alla fine provoca danni neuronali nell'ippocampo e nella corteccia cerebrale e compromette le funzioni di apprendimento e memoria 4,5,6. Contemporaneamente, l'ipossia attiva sia il sistema nervoso simpatico sia il sistema renina-angiotensina-aldosterone (RAAS), causando vasocostrizione, pressione alta del sangue, aumento del carico cardiaco e favorendo ipertrofia miocardica e fibrosi, portando infine a insufficienzacardiaca 7,8,9. Questa lesione cardio-cerebrale concomitante aumenta significativamente la difficoltà della gestione clinica per i pazienti, rendendo lo sviluppo di strategie terapeutiche efficaci e accessibili un bisogno clinico critico e insoddisfatto.

Le strategie terapeutiche attuali per il deficit cognitivo indotto dall'ipossia e la disfunzione cardiaca includono principalmente la terapia con ossigeno iperbarica, gli esaltatori metabolici cerebrali (ad esempio, piracetam, ossiracetam), la terapia con fattori neurotrofici10,11 e i β-bloccanti (ad esempio, metoprololo)12. Tuttavia, questi approcci presentano limitazioni significative: la terapia con ossigeno iperbarica richiede attrezzature specializzate e manca di accessibilità; Gli interventi farmacologici spesso causano effetti collaterali e tipicamente mirano a singoli percorsi patologici; mentre la terapia con fattori neurotrofici affronta sfide legate alla penetrazione e stabilità della barriera emato-encefalica. Pertanto, l'identificazione di strategie efficienti e accessibili per il trattamento cardio-cerebrale simultaneo è diventata una direzione chiave della ricerca.

L'agopuntura, componente fondamentale della Medicina Tradizionale Cinese (MTC), enfatizza una prospettiva terapeutica olistica che si allinea con la richiesta di una regolamentazione multimirata. Dimostra un potenziale terapeutico unico sia per disturbi neurologici che cardiovascolari. L'elettroagopuntura (EA), un'evoluzione moderna dell'agopuntura che integra il needling tradizionale con la stimolazione elettrica, consente una modulazione più precisa dell'attività elettrofisiologicaneurale 13,14. L'EA migliora efficacemente la lesione da ischemia-reperfusione cerebrale, riduce il rilascio di enzimi miocardici (GPBB, H-FABP) ed esercita una cardioprotezione significativa15,16. In sintesi, come innovazione moderna dell'agopuntura tradizionale, l'elettroagopuntura esercita una regolazione multimeccanicistica e multi-mirata, dimostrando un chiaro valore applicativo e potenziale clinico nel trattamento delle malattie neurologiche e cardiovascolari, e collegando la MTC con la medicina moderna.

Tuttavia, gli studi attuali sull'EA per il deficit cognitivo ipossico e la lesione cardiaca sono per lo più limitati agli effetti su un singolo organo/sistema, non esplorandone il potenziale nel trattamento cardio-cerebrale simultaneo. Basandosi sul "concetto olistico" della MTC e sulla realtà clinica della comorbidità cardio-polmonare-cerebrale indotta da ipossia cronica a lungo termine, questo studio mira a indagare l'effetto dell'EA nel "trattamento cardio-cerebrale simultaneo", a chiarire il suo ruolo nel migliorare sincronamente i danni neuronali indotti da ipossia, l'ipertrofia/fibrosi miocardica e i correlati deficit funzionali, e fornisce un regime olistico, mirato e non farmacologico per i danni cardio-polmonari-cerebrali associati malattie.

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Protocollo

Trenta maschi di topi C57BL/6J, di età compresa tra 7 e 8 settimane e dal peso 18-22 g (vedi Tabella dei Materiali), sono stati ospitati in una struttura SPF presso il New Drug Evaluation Center dell'Istituto di Ricerca Farmaceutica Yiling dell'Hebei. La temperatura ambiente è stata mantenuta tra 20 e 26 °C con un'umidità relativa del 40%-70%, in un ciclo chiaro/buio di 12/12 ore. I topi avevano accesso ad libitum al cibo standard per roditori da laboratorio e ad acqua pulita. Dopo un periodo di acclimatazione di una settimana, i topi sono stati distribuiti casualmente in tre gruppi (n = 10): il gruppo di controllo normale (Con), il gruppo modello per ipossia cronica (CH) e il gruppo per il trattamento per ipossia cronica più elettroagopuntura (CH+EA). Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato Etico della Ricerca Animale dell'Istituto di Ricerca Farmaceutica Yiling dell'Hebei (Numero di Approvazione: TTN-2025001) e sono state condotte rigorosamente in conformità con le linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

Stabilimento di un modello topino per ipossia cronica (Figura 1)

Il modello topino per ipossia cronica è stato stabilito basandosi su un metodo precedentemente descritto con modifiche17. Un sistema automatizzato di controllo e distribuzione del gas veniva utilizzato per generare e mantenere un ambiente ipossico. Questo sistema era programmato per regolare con precisione valvole solenoidi che mescolavano ossigeno puro e azoto in un rapporto specifico, consegnando la miscela in una camera per ipossia in acciaio inox su misura. Questa configurazione permetteva un controllo accurato sia del tempismo che della concentrazione della fornitura del gas. La concentrazione di ossigeno all'interno della camera veniva monitorata continuamente tramite un analizzatore digitale di ossigeno e mantenuta al 10,0% ± allo 0,5% tramite un meccanismo di retroazione che regolava di conseguenza la portata del gas. I topi nei gruppi CH e CH+EA sono stati co-ospitati nella camera dell'ipossia e sottoposti a condizioni ipossiche per 8 ore al giorno (dalle 9:00 alle 17:00), dopo di che sono stati riportati a condizioni normossiche per il resto della giornata. Questo protocollo è stato ripetuto ogni giorno per 12 settimane. Durante tutta l'esposizione all'ipossico, gli animali avevano accesso ad libitum a cibo e acqua. Durante l'infusione iniziale di azoto veniva posta particolare attenzione per ridurre la concentrazione di ossigeno; Questo processo veniva eseguito gradualmente per prevenire la morte acuta degli animali dovuta a un rapido calo dei livelli di ossigeno. I topi del gruppo Con erano ospitati in condizioni normossiche in una camera adiacente, con tutte le altre condizioni di alloggio identiche a quelle dei gruppi sperimentali.

Anestesia (Figura 2)

Per garantire la stabilità animale durante l'intervento elettroagopuntura e minimizzare l'interferenza dello stress fisiologico sugli esiti, in questo studio è stato utilizzato isoflurano inalato per anestesia17. Durante le procedure è stata somministrata anestesia a tutti i topi dei gruppi sperimentali per garantire condizioni operative coerenti. Prima dell'anestesia, sono state preparate una macchina per l'anestesia per piccoli animali (vedi Tabella dei Materiali) e una borsa termica termostatica impostata a 37 °C per prevenire l'ipotermia negli animali durante la procedura. L'induzione anestesica è stata effettuata in una camera sigillata utilizzando isoflurano dal 2%-2,5% (vedi Tabella dei Materiali) per circa 1 minuto. Dopo la perdita del movimento spontaneo e una significativa riduzione del tono muscolare, ogni topo è stato trasferito nella borsa riscaldante. Una maschera in miniatura appositamente progettata veniva posta delicatamente sopra il muso per mantenere l'anestesia con lo 0,5%-1,2% di isoflurano. La profondità effettiva dell'anestesia era determinata dall'assenza del riflesso di battito di ciglia e dalla mancanza di un riflesso di astinenza significativo in risposta alla stimolazione plantare. Questo protocollo anestesiario ha mantenuto uno stato anestetico stabile nei topi per oltre 30 minuti, sufficiente per completare tutte le procedure successive.

Trattamento con elettroagopuntura

L'intervento elettroagopuntura è iniziato per il gruppo CH+EA di topi nell'undicesima settimana di esposizione all'ipossia cronica. I punti di agopuntura selezionati erano Baihui (GV20) e Shenting (GV24) sulla testa, insieme a Zusanli bilaterale (ST36). GV20 si trova sulla linea mediana del vertice cranico, approssimativamente nel punto medio tra i due apili dell'orecchio18. GV24 si trova sulla linea centrale della fronte, circa 1-2 mm sopra il punto medio della linea che collega il canto interno degli occhi19. ST36 si trova sull'arto posteriore, inferiore e lateralmente all'articolazione del ginocchio, in una depressione circa 2 mm sotto il bordo inferiore della testafibulare 20,21. Dopo che i topi raggiungevano uno stato anestetico stabile, l'operatore teneva nella mano destra un ago di agopuntura sterile in acciaio inox usa e getta (specifica: 0,18 × 7 mm; vedi Tabella dei Materiali). Per i punti di agopuntura della testa (GV24 e GV20), il cuoio capelluto veniva sollevato delicatamente con la mano sinistra e l'ago veniva inserito sottocutaneamente con un angolo di 15-30°, avanzando posteriormente fino a una profondità di circa 2 mm. Per l'agopunto ST36 sull'arto inferiore, l'ago è stato inserito perpendicolarmente a una profondità di circa 3-4 mm. Gli elettrodi di uscita del dispositivo di elettroagopuntura (vedi Tabella dei materiali) venivano quindi collegati ai manici degli aghi: un paio di cavi collegava GV20 e quello sinistro ST36, mentre l'altro set collegava GV24 e destro ST36. La stimolazione simultanea tramite elettroagopuntura veniva applicata tramite due set di fili. I parametri EA erano impostati come segue: onda continua, frequenza 2 Hz22,23. L'intensità attuale è aumentata gradualmente da 0,1 mA fino a quando si è osservato un leggero spasmo ritmico dell'arto locale (tipicamente mantenuto intorno a 2 mA). L'elettroagopuntura è stata eseguita una volta al giorno per 30 minuti, ininterrottamente per 6 giorni con 1 giorno di riposo, per un corso totale di 2 settimane. Nel frattempo, i topi dei gruppi Con e CH hanno subito anestesia e istrizione di durata e condizioni identiche, ma senza inserimento di ago o attivazione del dispositivo di elettroagopuntura.

Test in campo aperto

Il Test Open Field (OFT) è stato condotto per valutare l'attività locomotoria spontanea, il comportamento esplorativo e le risposte ansiose dei topi in un ambiente nuovo24. L'apparato OFT era un cubicolo bianco (50 cm 50 cm 30 cm), il cui pavimento era praticamente diviso in una griglia di 25 quadrati (ciascuno 10 cm 10 cm) per l'analisi comportamentale. Prima del test formale, tutti i topi sono stati acclimatati alla sala di test per 1 ora per minimizzare l'impatto dello stress indotto dal cambiamento ambientale sugli esiti comportamentali. Durante i test, ogni topo veniva delicatamente posizionato al centro dell'apparecchio. Dopo un periodo di abituazione di 2 minuti, il suo comportamento è stato formalmente registrato per 10 minuti. L'intera sessione è stata registrata utilizzando un sistema di tracciamento video (vedi Tabella dei Materiali) per tracciare automaticamente la traiettoria del movimento. I parametri analizzati includevano la distanza totale percorsa, il tempo trascorso nella zona centrale, la velocità nella zona centrale e il numero di ingressi nella zona centrale. Tutti i topi hanno iniziato l'esplorazione dalla stessa posizione centrale, e ogni topo è stato testato una sola volta. Per prevenire interferenze olfattive, l'apparecchio è stato accuratamente pulito con etanolo al 75% dopo i test su ciascun topo

Labirinto d'acqua Morris (MWM)

Il test Morris water maze (MWM), un metodo standard per valutare la funzione della memoria, è stato utilizzato principalmente per valutare l'apprendimento spaziale e le capacità di memoria neitopi 25. L'apparato consisteva in una piscina circolare, di 120 cm di diametro e profonda 30 cm, che era concettualmente suddivisa in quattro quadranti uguali (I, II, III, IV). Per minimizzare le distrazioni esterne, sono state appese tende oscuranti intorno alla piscina e sono stati fissati segnali visivi distinti sulle pareti sopra di essa, rimanendo costanti per tutto l'esperimento. La piscina veniva riempita con acqua mantenuta a 22-24 °C, e il livello dell'acqua era mantenuto circa 1 cm sopra la superficie della piattaforma. Una polvere di anidride di titanio non tossica veniva aggiunta all'acqua a una concentrazione del 20% per renderla opaca, aumentando così il contrasto tra il mouse e lo sfondo per un tracciamento video più accurato. La procedura sperimentale è durata 6 giorni consecutivi, comprendendo una fase di addestramento all'acquisizione spaziale di 5 giorni seguita da una prova di sonda spaziale di 1 giorno. Durante la fase di addestramento, una piattaforma circolare con un diametro di 10 cm fu posizionata nel quadrante III, che fungeva da località bersaglio. Il primo giorno, la piattaforma fu posizionata leggermente sopra la superficie dell'acqua (~1 cm) per familiarizzare i topi con l'obiettivo di fuga. Dal secondo al quinto giorno, la piattaforma è stata sommersa a circa 1 cm sotto la superficie dell'acqua per valutare l'apprendimento spaziale. Ogni giorno, ogni topo veniva posizionato sequencialmente nell'acqua rivolto verso la parete della piscina da ciascuno dei quattro quadranti in un ordine prestabilito. L'espertore ha subito lasciato la stanza dopo aver posizionato l'animale per evitare di diventare un segnale spaziale non voluto. Il tempo impiegato per localizzare la piattaforma nascosta (latenza di fuga) veniva registrato per ogni prova. Se un topo non trovava la piattaforma entro il tempo limite di 90 secondi, veniva guidato delicatamente verso la piattaforma e lasciato rimanere lì per 30 secondi per rafforzare l'apprendimento spaziale, e la sua latenza veniva registrata come 90 secondi. Se il topo trovava la piattaforma entro 90 secondi, poteva rimanere sopra per 10 secondi. Dopo ogni sessione di addestramento, il topo veniva asciugato con un asciugamano e riportato nella sua gabbia di casa. La sequenza del quadrante iniziale era variata sistematicamente, con un intervallo inter-prova di circa 20 minuti per ciascun topo. Un sistema di tracciamento video (vedi Tabella dei materiali) registrava automaticamente parametri come distanza di nuoto, velocità e latenza di fuga. Il sesto giorno è stata condotta una prova con sonda per valutare la memoria spaziale. La piattaforma veniva rimossa dal quadrante bersaglio (quadrante III), e ogni topo veniva rilasciato dal quadrante opposto alla precedente posizione del bersaglio (quadrante I) e lasciato nuotare liberamente per 90 secondi. Venivano registrati il tempo trascorso nel quadrante bersaglio (dove si trovava precedentemente la piattaforma), il numero di attraversamenti sulla posizione esatta della piattaforma precedente e la traiettoria di nuoto. Immediatamente dopo la prova con la sonda, il topo è stato completamente essiccato e riportato nella gabbia di casa sotto una fonte di calore per prevenire l'ipotermia. Durante tutto l'esperimento, la posizione di tutti gli indizi visivi intorno al labirinto è rimasta invariata per garantire la coerenza nelle condizioni sperimentali.

Ecocardiografia

L'ecocardiografia nei topi è una tecnica di imaging non invasiva e in tempo reale, fondamentale per valutare la struttura e la funzione cardiaca, ed è stata ampiamente applicata nella ricerca sui modelli di malattie cardiovascolari. L'esame viene eseguito in anestesia generale, mantenendo lo stato anestetico per tutta la durata della procedura seguendo il protocollo descritto in precedenza. Il topo è posizionato supino su una piattaforma termostatica mantenuta a 37 °C. Dopo che gli arti sono stati delicatamente fissati, si applica uniformemente una crema depilatoria sulla regione toracica e addominale. Tutti i capelli e le creme residue vengono rimossi accuratamente dopo 1-2 minuti per garantire la migliore qualità della trasmissione dell'ecografia. Per il monitoraggio fisiologico in tempo reale, vengono utilizzati cerotti di elettrodi collegati agli arti tramite gel conduttivo per registrare continuamente l'elettrocardiogramma e la frequenza respiratoria. Per ottenere viste standard a ecografia, la posizione del topo viene regolata in modo che la testa sia leggermente più alta della coda, assicurando che l'asse lungo del cuore sia parallelo alla piattaforma. Si presta particolare attenzione a evitare di applicare una pressione eccessiva sulla parete toracica con la sonda, poiché ciò può alterare la geometria cardiaca e influenzare la precisione delle misurazioni. Una generosa quantità di gel ecografico senza bolle (spesso 2-5 mm) viene applicata sulla zona rasata. Si utilizza una sonda ad array lineare ad alta frequenza (30-50 MHz), con il marcatore di orientamento della sonda che punta costantemente verso la testa del mouse. La sonda viene inizialmente posizionata parallela all'asse lungo del corpo del mouse e poi ruotata in senso antiorario di circa 30°-45°. Vengono effettuate piccole modifiche per ottenere una visione chiara del ventricolo sinistro sul lungo asse parasternale. L'acquisizione dinamica dell'immagine inizia quando l'immagine ecografica mostra chiaramente la camera ventricolare sinistra, le valvole aortiche e mitrali, e mostra l'allineamento orizzontale dell'apice cardiaco con il tratto di uscita aortico. Tutte le immagini vengono acquisite da un operatore esperto utilizzando impostazioni di parametri coerenti per garantire la comparabilità dei dati. Dopo l'esame, la sonda a ultrasuoni viene pulita secondo le procedure standard e eventuali residui di gel viene rimosso dal corpo del topo. Il topo viene quindi trasferito in una gabbia calda per un monitoraggio ravvicinato finché non si riprende completamente dall'anestesia e riacquista la normale deambulazione.

Preparazione delle sezioni a paraffina

Dopo il completamento dei test comportamentali, i topi sono stati anestetizzati tramite iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodio (20 mg/kg). La fissazione sistemica è stata poi raggiunta tramite perfusione transcardica con soluzione salina, seguita dal 10% di paraformaldeide (vedi Tabella dei materiali). Dopo che i tessuti cerebrali sono stati accuratamente estratti, sono stati immersi nel paraformaldeide al 10% per 72 ore di fissazione a temperatura ambiente. È importante notare che, poiché la perfusione cardiaca altera la microstruttura miocardica, i campioni cardiaci utilizzati per l'analisi istologica in questo studio sono stati specificamente prelevati da topi che non hanno subito la procedura di perfusione, mentre tutte le altre condizioni di gestione sono rimaste identiche. Al termine della fissazione, i fazzoletti sono stati risciacquati con acqua corrente per 6 ore. La successiva disidratazione in gradiente è stata eseguita utilizzando un processore di tessuti automatizzato (vedi Tabella dei Materiali), che prevedeva immersione sequenziale in etanolo del 60%, 70% e 90% per 1 ora ciascuno, seguita dal 95% e dal 100% di etanolo per 2 ore ciascuno. I campioni disidratati venivano poi eliminati nello xilene per 2 ore e infiltrati con paraffina a 60°C per 3 ore. Infine, i tessuti venivano incorporati nella paraffina tramite una macchina di incorporamento, garantendo un orientamento anatomico standard. Dopo che i blocchi incorporati si solidificavano completamente, le sezioni seriali di spessore 4 μm venivano tagliate con un microtomo rotante, montate su vetrini di vetro rivestite di poli-L-lisina, asciugate all'aria e conservate per la successiva tintura e analisi.

Colorazione dell'ematossilina-eosina

L'esame istologico dei tessuti cerebrali e cardiaci è stato eseguito utilizzando colorazione di ematossilina ed eosina (HE) per valutare la lesione ipossica e valutare gli effetti terapeutici dell'intervento elettroagopuntura. Le sezioni di tessuto, spesse 4 μm, sono state prima deparaffinate in xilene I e xilene II (10 min ciascuna) e poi reidratate attraverso una serie di etanolo gradato (100%, 95% e 80%, 2 min ciascuna), seguita da un risciacquo finale con acqua distillata. Per la colorazione, le sezioni venivano immerse in una soluzione di ematossilina per 3-8 minuti fino a ottenere una colorazione nucleare chiara, sciacquate con acqua corrente per indurre l'inbluzionamento e successivamente controcolorate con eosina per 1-3 minuti per ottenere la colorazione rosa appropriata nel citoplasma. Infine, le sezioni colorate venivano disidratate in alcol assoluto, pulite con xilene e montate con balsamo neutro.

Colorazione Nissl

Per valutare lo stato di sopravvivenza dei neuroni nella regione dell'ippocampo, è stata impiegata la colorazione di Nissl per osservare la distribuzione dei corpi Nissl e la morfologia cellulare all'interno dei neuroni. Dopo la deparaffinizzazione e la reidratazione delle sezioni di paraffina del tessuto cerebrale, le fette sono state immerse in una soluzione preriscaldata di colorazione con toluidina blu e incubate a 56 °C in un incubatore a temperatura costante per 1 ora. Dopo la tintura, le sezioni sono state delicatamente risciacquate con acqua distillata e poi trasferite in una soluzione di differenziazione Nissl per diversi secondi fino a 2 minuti. Il processo di differenziazione veniva monitorato attentamente al microscopio fino a quando lo sfondo divenne quasi incolore. Successivamente, le sezioni differenziate venivano rapidamente disidratate tramite una serie di etanolo assoluto, eliminate con xilene e infine montate con resina neutra per una conservazione e osservazione permanente.

Colorazione tricroma di Masson

La colorazione tricroma di Masson, una tecnica classica di colorazione del tessuto connettivo, è stata impiegata principalmente per distinguere le fibre di collagene da quelle muscolari nel tessuto cardiaco. Dopo la deparaffinizzazione e la reidratazione delle sezioni cardiache in paraffina, la procedura di colorazione è stata eseguita secondo le istruzioni del produttore fornite con il kit di colorazione trichrome di Masson (vedi Tabella dei Materiali). Il protocollo di colorazione fu eseguito come segue. Inizialmente, le sezioni venivano immerse per 4 minuti in una soluzione lavorativa di ferro ematossilina di Weigert appena preparata per colorare i nuclei, con una delicata agitazione applicata per garantire una colorazione uniforme. Successivamente, le sezioni venivano risciacquate con acqua corrente, differenziate in alcol acido all'1% per 5-10 secondi, e poi trattate con una soluzione blu per 4 minuti per ottenere una colorazione nucleare blu-viola chiara. Le sezioni sono state successivamente colorate con soluzione di fucsina acida Ponceau per 5 minuti, seguite da differenziazione in soluzione acida fosfomolibdica allo 0,2% per 1 minuto. Dopo un breve risciacquo in una soluzione di lavoro acida debole per 1 minuto, le sezioni sono state controcolorate con una soluzione blu di anilina allo 0,2% (pH 6,8) per 2 minuti per evidenziare le fibre di collagene. Al termine delle fasi di colorazione, le sezioni venivano disidratate tramite una serie di etanolo classificato, ripulite con xilene e infine montate con balsamo neutro. Tutte le sezioni montate sono state catturate digitalmente utilizzando un sistema di scansione completamente automatizzato delle vetrine (vedi Tabella dei materiali) per analisi successive.

Analisi statistica

I risultati ottenuti sono presentati come media ± SEM. I dati sono stati analizzati utilizzando ANOVA unidirezionale seguita dal test post hoc dell'LSD o t-test. L'ANOVA bidirezionale veniva utilizzata per analizzare i dati dell'OFT e del MWM. P < 0,05 era considerato il livello di significatività. L'analisi statistica e i grafici sono stati creati dal software GraphPad Prism 9.0.

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Risultati

L'elettroagopuntura allevia comportamenti simili all'ansia e disfunzioni cognitive indotte dall'ipossia cronica e sostenuta nei topi.

Il comportamento simile all'ansia nei topi sottoposti a CH è stato inizialmente valutato utilizzando OFT (Figura 3A). I diagrammi di traiettoria hanno rivelato schemi comportamentali distinti: i topi di controllo hanno mostrato robuste tendenze esplorative nell'ambiente nuovo, con s...

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Discussione

Questo studio conferma che l'ipossia cronica a lungo termine può indurre comportamenti simili all'ansia e compromissione della memoria spaziale nei topi, il che è coerente con i risultati delle ricercheprecedenti 26,27. Nel frattempo, abbiamo riscontrato che l'ipossia cronica a lungo termine può anche causare disfunzioni cardiache e danni strutturali miocardici. Tuttavia, attualmente mancano strategie terapeutiche che possano all...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione Provinciale delle Scienze Naturali della Heilongjiang della Cina (PL2025H264), dalla Yanzhao Golden Platform (A20240022) e dal Progetto di Supporto dell'Amministrazione Nazionale di Medicina Tradizionale Cinese (Progetto n.: 272 [2021] dell'Ufficio per il Personale e l'Istruzione, NAPTCM).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione di paraformaldeide al 10%Bioroyee (Pechino) Biotechnology Co.,
Ltd		RL3234
ANY-mazeScienzaSA201Sistema di tracciamento video
Topi C75BL/6JPECHINO HFK BIOSCIENZE
CO.,LTD		N.110322220103041767Sesso: Maschio,   Peso: 18 e nbsp; 22 g
Aghi usa e getta per agopunturaHuatuo246076Aghi sterili per agopuntura monouso (0,25 mm e acuti; 13 mm)
Dispositivo di elettroagopunturaGrande MuragliaKWD-808 I
HistoCore MULTICUT - Microtomo rotatorio semi-automatizzatoGermania, LeicaRM2245Slicer a paraffina
agopuntura Hwato  agoFabbrica di Apparecchi Medici di Suzhou2655519
IsofluranoRWD Life Science Co., LtdR510-22
Kit di colorazione tricroma di Masson' ssolarbioG1340Kit per la tintura in massone
Labirinto d'acqua MorrisSansbioSA201Dispositivo Morris water maze
Patologia digitale NanoZoomerHamamatsu Fotonica K. KC9600-01
NDP. Vista 2Giappone, SakuraSoftware per scanner di diapositive
Macchina per anestesia per piccoli animaliRWDYL-LE-A106
Tissue Tech Prisma PlusGiappone, Sakura20B2X00014000034Dispositivo completamente automatizzato progettato per colorare campioni come sezioni di tessuto incorporate in paraffina, sezioni congelate e cellule montate su vetrine.
Modulo di Incorporamento Tissue-Tek TEC 6Giappone, SakuraM01-021E-02Macchina di incorporamento a paraffina

Riferimenti

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