Amiloid e l'architettura Cross-Beta

Sommario

Le fibrille amiloidi sono formate da numerose proteine, e le fibrille risultanti condividono una struttura a "foglio β incrociato". Qui descriviamo come i campioni di fibrilla amiloide possono essere preparati per la diffrazione delle fibre a raggi X e come i pattern possono essere analizzati.

Abstract

Le fibrille amiloidi sono costituite da una proteina mal ripiegata e autoassemblata, organizzata in una struttura ben definita e ripetitiva. Sono ben noti per il loro ruolo importante nelle malattie da dispiegamento delle proteine, tra cui il morbo di Alzheimer e il diabete di tipo 2, in cui le fibrille amiloidi insolubili si depositano nei tessuti. Inoltre, è stato riscontrato che svolgono un ruolo funzionale importante in molti organismi, fornendo resistenza, impalcatura e protezione. I primi modelli strutturali dell'amiloide sono stati informati dalla raccolta di dati di diffrazione delle fibre a raggi X da fasci di fibrille amiloidi allineate. Questo ha portato ai primi modelli della struttura generica cross-β che è stata sostituita da un'analisi di diffrazione più dettagliata da campioni altamente orientati e semicristallini, portando a dettagli sull'organizzazione dei peptidi in un'architettura ripetitiva. Qui ci siamo concentrati sulla descrizione dei metodi per determinare l'architettura sottostante di queste fibrille, e abbiamo descritto le caratteristiche comuni delle fibrille amiloidi provenienti da diverse fonti patogene, funzionali e sintetiche. Descriviamo la preparazione dei campioni, la raccolta dei dati e la successiva analisi dei dati per produrre una struttura del modello che possa essere confrontata con i dati sperimentali.

Introduzione

Le fibrille amiloidi sono state identificate per la prima volta all'interno di un gruppo di malattie note come Amiloidosi, in cui le fibrille proteiche si accumulano negli spazi extracellulari dei^{tessuti 1}. Ogni malattia è caratterizzata da una particolare proteina precursore che subisce un cambiamento conformazionale formando fibrille proteiche altamente ordinate^{e stabili 2,3}. La definizione più recente di fibrille amiloidi ora incorpora fibrille che si accumulano nell'ambiente cellulare. Più recentemente, sono stati identificati diversi sistemi funzionali che utilizzano la struttura amiloide per garantire stabilità, adesione o addirittura archiviazione delle informazioni. Nonostante l'ampia gamma di strutture proteiche che possono auto-assemblarsi per formare fibrille amiloidi, tutte condividono una struttura incrociata^{β 4}. Questa disposizione a β incrociata fu descritta per la prima volta da Astbury per albume d'uovo^{di gallina 5} e successivamente spiegata ulteriormente da Geddes per la seta incrociata^{β 6}. In questa architettura proteica, le fibrille sono composte da filamenti β che corrono perpendicolarmente all'asse della fibrilla, che vengono poi disposti in fogli di β che si associano tramite le catene laterali per formare quelle che in seguito furono definite cerniere^{steriche 7}. Questo crea un'organizzazione altamente stabile tenuta insieme da legami a idrogeno che corrono paralleli alla fibra, insieme a interazioni idrofobiche, elettrostatiche e polari tramite catene^{laterali 8}.

I primi studi strutturali utilizzarono la diffrazione delle fibre a raggi X per esaminare la struttura delle fibrille amiloidi, per cui le fibrille venivano allineate e orientate per formare un fascio di fibrille amiloidi che potevano essere inserite nel fascio di raggi X di un diffractometro ^9,10. È stata generata una struttura generica di fibrille amiloidi per adattarsi ai modelli di diffrazione di diverse fibrille amiloidi estratte da tessuto umano o coltivate in vitro^4, e ciò ha fornito una base per ulteriori descrizioni^{strutturali 11}. Negli ultimi anni, i progressi nella risonanza magnetica nucleare a stato solido (ssNMR), nella cristallografia a raggi X con microcristalli e nella microscopia elettronica criogenica (CryoEM) hanno fornito dettagli atomici per la struttura incrociata^{β 11}. Tuttavia, il metodo di diffrazione delle fibre a raggi X rimane importante e utile, e fornisce informazioni sull'organizzazione ripetitiva delle proteine. Inoltre, in alcuni casi, possono essere accessibili informazioni relative a un ordine a lungo termine. Fondamentalmente, la diffrazione delle fibre a raggi X è spesso utilizzata per confermare la presenza di fibrille amiloidi formate da proteine diverse, e il pattern cross-β è uno dei requisiti principali affinché un assemblaggio fibroso venga classificato come^{amiloide 12}.

Qui descriviamo la metodologia utilizzata per preparare le fibrille amiloidi e le allineiamo per la raccolta dei dati sulla diffrazione delle fibre di raggi X. Inoltre, forniamo dettagli su come i dati di diffrazione possano essere ulteriormente analizzati per generare una struttura del modello, il suo schema di diffrazione previsto e confrontati con i dati di diffrazione provenienti da fibrille derivate ex vivo.

Protocollo

1. Preparazione di campioni fibrillari per la diffrazione delle fibre a raggi X

1. Dissolvere proteine o peptidi di interesse in condizioni ottimali per la formazione di fibrille del peptide amiloidogenico selezionato e valutare la formazione di fibrille utilizzando microscopia elettronica o microscopia a forza atomica. I dettagli su come preparare i campioni e condurre l'imaging sono disponibili^{altrove 13}. Assicurati che le fibrille siano lunghe, dritte e non ramificate come mostrato nella Figura 1. Ad esempio, le fibrille mostrate nella Figura 1 sono state fotografate tramite microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Posizionare una goccia contenente fibrille su una griglia del microscopio elettronico e poi colorare negativamente usando acetato di^{uranile 14}.
   NOTA: È auspicabile un ricoprimento e una distribuzione uniforme delle fibrille sulla griglia.
2. Allinearsi per produrre un fascio di fibrille i cui assi delle fibre sono idealmente tutti paralleli (Figura 2A).
   1. Scioglie la cera di candela finché non diventa liquida usando una piastra calda. Utilizzando un tagliavetro come una penna diamantata, taglia capillari di vetro borosilicato di 1 mm a una lunghezza di circa 2-3 cm e immergili brevemente nella cera liquida. Ritira la cera di candela con azione capillare (circa 1-2 mm di lunghezza all'interno del capillare). Assicurati che la superficie della cera sia piatta in modo che la sospensione delle fibrille possa appoggiarsi in modo uniforme.
   2. Usa plastilina per fissare orizzontalmente i capillari sigillati in una piastra di Petri con uno spazio da 0,5 mm a 2 mm tra le estremità riempite di cera (Figura 2A).
   3. Utilizzando una pipetta, sospendi con cura una goccia di soluzione da 10 μL tra le estremità riempite di cera dei due capillari. Assicurati che la soluzione entri in contatto con entrambe le estremità della cera ma non si estenda sul vetro.
   4. Proteggi il campione dalla polvere coprendo la piastra di Petri. Lascia evaporare il campione durante la notte, risultando nell'allineamento delle fibrille ( vedi Figura 2A).
      NOTA: Potrebbero volerci diversi giorni perché il campione si asciughi completamente, e questo dipenderà dalla temperatura e umidità ambientale, oltre che dalla viscosità del campione.
   5. Sigilla la placca; incubare a temperature più basse in frigorifero oppure incubare utilizzando umidità in una scatola sigillata per rallentare l'asciugatura, il che può portare a un migliore allineamento del campione.
3. Allineare le fibrille amiloidi in un capillare vetroso (Figura 2B).
   1. Fissare una siringa da 1 mL dotata di un piccolo pezzo di tubo di gomma all'estremità larga a un capillare di vetro siliconato di 0,7 mm di diametro e aspirare fino a 2-3 cm di sospensione fibrillica.
   2. Sigilla un'estremità del capillare usando cera fusa e lascia che l'altra estremità rimanga aperta per permettere l'evaporazione. Disponi il capillare verticalmente e lascialo asciugare per diversi giorni o settimane finché non avrà formato un disco secco nel tubo capillare (Figura 2B).
4. Allineare le fibrille come un "mat" o film sottile (Figura 2C).
   1. Applicare un campione ad alta concentrazione (ad esempio, >10 mg/mL) di fibrilla su un vetrino di vetro, parafilm o pezzo di Teflon, coprire e lasciarlo asciugare all'aria per almeno 24 ore. Questo dovrebbe asciugarsi formando un film sottile e piatto sulla superficie. Sollevalo con attenzione con un bisturi e poi attaccalo a un tubo capillare di vetro usando colla o plastilina.
   2. Il tappeto avrà una disposizione casuale di fibrille (vedi Figura 2C). Montare con cura il campione su una testa goniometrica in modo che il fascio di raggi X passi attraverso il bordo del campione e sia parallelo al piano del film (Figura 2C).
      NOTA: La diffrazione attraverso la faccia della pellicola produrrà anelli di diffrazione a causa dell'allineamento casuale (vedi Figura 2C).
5. Esamina il campione.
   1. Indaga su quanto bene è allineato il campione esaminandolo attraverso un polarizzatore incrociato sotto un microscopio ottico. Se è presente la birifrangenza, può suggerire che il fascio fibrilino è un buon allineamento.
   2. Attacca il campione di fibra capillare su una testa goniometrica usando plastilina. Considera se il campione sia un fascio di fibre, un tappetino o un disco quando lo posizioni nel fascio di raggi X.
      1. Si noti che l'asse di rotazione del campione sarà attorno all'asse della fibra per un fibrato (Figura 2A), mentre nei dischi le fibre tendono ad allinearsi attraverso il diametro del tubo (Figura 2B). Un tappetino avrà due direzioni distinte (parallele al piano della pellicola e perpendicolari ad esso) (Figura 2C).
   3. Raccogli un pattern di diffrazione (come mostrato nella Figura 3A) utilizzando apparecchiature a raggi X interne (CuKα per cristallografia proteica) o con radiazione di sincrotrone. I tempi di esposizione variano a seconda dell'intensità del fascio di raggi X; Regola questo in base ai tempi di raccolta raccomandati per la sorgente di diffrazione.

2. Analisi dei dati

1. Uso di CLEARER per l'analisi dei^{dati 15}.
   NOTA: Il programma di analisi dei pattern di diffrazione delle fibre a raggi X è disponibile gratuitamente per gli utenti accademici tramite l'autore corrispondente. Altri metodi per l'analisi della diffrazione sono disponibili^16,17 (www.esrf.fr/computing/expg/subgroups/data_analysis/FIT2D)¹⁸. Il corsivo tra parentesi indica i comandi del menu.
   1. Converti il pattern di diffrazione in un file .tiff e carica il file in CLEARER (Figura 4).
   2. Inserisci le impostazioni di diffrazione (Diagramma di diffrazione: impostazioni di diffrazione), inclusi la dimensione dei pixel nell'immagine TIFF, la sorgente a raggi X e la distanza campione-rilevatore.
   3. Assicurarsi che il pattern di diffrazione sia orientato in modo che il meridiano sia verticale (Elaborazione immagini: Ruota). Usa il modulo di centramento (Diagramma di diffrazione: Immagine al centro) per centrare l'immagine. Definisci i due assi principali (meridiano ed equatore): Questo modulo confronta l'intensità lungo questi due assi del pattern. Una volta completato il centraggio, salva l'immagine e assicurati che venga utilizzata nei passaggi successivi.
   4. Specificare un angolo adatto (impostato lungo i due assi principali [meridiano ed equatore]) e produrre un grafico che mostri la posizione del segnale di diffrazione rispetto all'intensità usando il modulo Media Radiale (Schema di Diffrazione: Media Radiale) (Figura 4A).
   5. Misurare e fornire automaticamente le posizioni dei segnali di diffrazione utilizzando il modulo Peak Find (Pattern di diffrazione: Media radiale: Peak Find) (Figura 4B). Assicurarsi che tutti i segnali di diffrazione vengano rilevati con precisione regolando la larghezza di ricerca di picco e assicurandosi che il rumore non venga rilevato.
   6. Controlla le posizioni dei segnali emessi da Peak Find utilizzando il modulo Zoom & Measure (Diagramma di diffrazione: Zoom & Misura). Verifica che tutte le posizioni dei segnali siano elencate e assegnate all'asse corretto.
   7. Esplora le dimensioni delle celle unitarie (b e c) che genereranno i segnali di diffrazione osservati utilizzando il modulo di ottimizzazione delle celle unitarie (Schema di diffrazione: ottimizzazione a celle unitarie) (Figura 5A). Esaminare i segnali forti trovati sull'equatore per generare una stima iniziale da inserire nella tabella di ingresso delle celle unitarie e specificare gli indici minimo e massimo [hkl] su cui CLEARER cerca celle potenziali (una dimensione è meridionale e predefinita è 4,76 Å).
   8. Calcola le dimensioni potenziali delle celle unitarie e confronta le posizioni previste dei segnali di diffrazione con le riflessioni osservate. Le celle unitarie sono punteggiate in base al grado di accordo tra i segnali previsti e quelli sperimentali. Vengono poi mostrate le migliori venti partite. Considera la lunghezza del precursore peptidico e altre informazioni provenienti da microscopia elettronica, AFM o risonanza magnetica nucleare a stato solido (ssNMR) per aiutare a selezionare le migliori celle unitarie possibili per adattarsi ai dati e al campione.

3. Modellazione strutturale e test del modello usando CLEARER

1. Costruire modelli molecolari (formato PDB).
   NOTA: Utilizzare programmi di modellazione proteica come Pymol (DeLano)¹⁹ o Insight II (Accelerys) e altri, per generare coordinate PDB del peptide precursore in conformazione β-filamento e in una disposizione a foglio β. Questa sezione descrive un processo semplice utilizzato per una cella unitaria ortorombica (tutte con angoli di 90°). Sono possibili organizzazioni non ortogonali dove è richiesta una conoscenza più esperta della diffrazione. Questi possono essere esplorati in CLEARER per celle unitarie più complesse.
   1. Costruire disposizioni tridimensionali dei peptidi in una disposizione a β-foglio per adattarla alla cella unitaria determinata. Assicurati che questo modello contenga tutti gli oggetti correlati alla simmetria all'interno della cella.
   2. Carica il modello PDB nel modulo Generatore di Catena Strutturale (Simulazione di Diffrazione: Strutture: Generatore di Catena Strutturale) per verificare le coordinate strutturali costruite. Assicurati che l'asse della fibra e l'asse della trave siano assegnati correttamente. Inserisci le dimensioni determinate della cella unitaria. Controlla se si verificano scontri per le dimensioni delle celle selezionate (Figura 5B).
   3. Carica le coordinate del modello PDB nel modulo Fiber Diffraction Simulation (Fiber Diffraction Simulation: Fiber Diffraction Simulation).
      1. Inserisci la direzione dell'asse della fibra, l'orientamento del fascio, le dimensioni della cella unitaria selezionate dal passaggio 3.1.2, le impostazioni della sorgente a raggi X e del rivelatore, e clicca su simulazione. Per una simulazione a celle unitarie ortorombiche, l'asse della fibra è definito dall'asse cartesiano relativo all'orientamento dell'asse della fibra nel modello utilizzato.
      2. Assicurarsi che gli assi del fascio siano perpendicolari all'asse della fibra, cioè su uno degli altri due possibili assi. Salva le impostazioni della simulazione come file .html (File: Salva come). Questi possono essere caricati e modificati successivamente per esplorare iterativamente la struttura ottimale del modello.
      3. Salva il motivo simulato risultante in un formato grezzo, che può essere caricato successivamente per ulteriori analisi, oppure come .tiff (in questo formato vengono eliminate ulteriori informazioni di contrasto) (Simulazione: salva immagine visibile come TIFF). Poi, confronta questi con il modello sperimentale.
2. Confrontare i pattern simulati di diffrazione con quelli sperimentali per la presentazione.
   1. Utilizzare i passaggi 2.1.5-2.1.6 per misurare i segnali simulati di diffrazione e confrontare con quelli misurati da pattern sperimentali (Figura 6). Annota questi in una tabella.
   2. Utilizzare un modulo chiamato Layers (Difffraction Pattern: Layers) per sovrapporre pattern simulati e sperimentali e confrontare le posizioni dei segnali ( Figura 6C).
   3. Confronta le posizioni dei segnali e le intensità relative tra i pattern sperimentali e quelli simulati disponendo un quadrante del pattern simulato accanto a quello sperimentale (come mostrato nella Figura 6B)^8,20,21.
   4. Valutare la validità di una cella unitaria e di un modello suggeriti, poi modificare iterativamente il modello e la cella per migliorare la somiglianza tra il pattern simulato e quello sperimentale di diffrazione.
   5. Confronta in modo approfondito i risultati di diversi modelli e cellule utilizzando la procedura descritta nel passo 3.1 per testare diverse alternative. Assicurarsi che le informazioni raccolte da altre tecniche, come TEM, AFM e NMR, siano considerate vincoli nella modellazione e per arrivare alla migliore rappresentazione strutturale possibile che si adatti ai^dati 8,21,22,23.

Risultati

Esempio²⁴ di CcbMet: la Figura 1 mostra micrografie elettroniche che mostrano un'alta densità di fibrille amiloidi su una griglia adatta per la preparazione di un campione di fibra a raggi X. La Figura 2 descrive le diverse texture che possono essere generate dal fibrato fibroso (Figura 2A), disco (Figura 2B), mat...

Discussione

La diffrazione delle fibre a raggi X può essere utilizzata per valutare se un campione sta formando una struttura amiloide e per ottenere ulteriori informazioni sull'organizzazione molecolare della proteina precursore o del peptide all'interno delle fibre. Qui abbiamo descritto i metodi con cui i campioni fibrosi possono essere preparati per la diffrazione delle fibre a raggi X, ottenere dati e poi analizzare. In modo cruciale, la qualità dei dati ottenuti dipenderà sia dall'ordine all'i...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0.7 mm diameter X-ray  capillari di quarzglass	GLAS, W. Muller, D-13503, Berlin, Germany	Q-07-001-80
Capillari di vetro borosilicato da 1,5 mm	Harvard appatus Ltd, (Edenbridge, Kent, UK)	BS4 30-0074	esempio, disponibile presso altri produttori
Diffrattometro a raggi X per cristallografia delle proteine	Vari		Vari produttori