Un flusso di lavoro completo per la proteomica del plasma tramite spettrometria di massa: una strategia per la scoperta di biomarcatori nelle malattie umane sistemiche

Sommario

La proteomica plasmalogica consente la scoperta di biomarcatori per le malattie sistemiche tramite campionamenti minimamente invasivi. Nonostante le sfide analitiche poste dalla complessità del plasma, questo studio presenta un flusso di lavoro ottimizzato per cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS/MS) che migliora la copertura proteomica, riduce la variabilità e migliora la riproducibilità, consentendo confronti accurati tra campioni di malattia e di controllo.

Abstract

Il plasma, la componente priva di cellule del sangue, offre una fonte di informazioni biomolecolari minimamente invasiva e ricca, rendendolo ideale per l'indagine sulle malattie sistemiche. L'avvento delle tecnologie proteomiche ad alto rendimento ha rivoluzionato l'analisi del plasma permettendo l'identificazione e la quantificazione su larga scala delle proteine circolanti. Questi progressi hanno facilitato la scoperta di biomarcatori per la diagnosi precoce, la prognosi e il targeting terapeutico di vari disturbi, inclusi tumori e malattie infiammatorie. Tuttavia, la complessità intrinseca del plasma, insieme a metodi incoerenti di preparazione e analisi del campione, ha storicamente limitato la copertura proteomica e la riproducibilità. Gli approcci iniziali basati sull'analisi del plasma grezza spesso soffrivano di scarsa coerenza e di significativi effetti di lotto, ostacolando studi comparativi affidabili tra le coorti cliniche.

Per superare queste limitazioni, lo studio attuale introduce un flusso di lavoro proteomico al plasma robusto e scalabile. Il protocollo integra fasi preparatorie chiave come l'immunodeplezione, la filtrazione a taglio del peso molecolare, la liofilizzazione, la quantificazione e normalizzazione delle proteine, la digestione enzimatica e la profilazione LC-MS/MS. Questa strategia ottimizzata aumenta significativamente la profondità del proteoma e riduce la variabilità, consentendo così un'analisi dell'espressione proteica differenziale più accurata e riproducibile tra casi di malattia e controlli sani. Il flusso di lavoro offre una piattaforma preziosa per i ricercatori che mirano a generare dati proteomici di alta qualità dal plasma, contribuendo infine all'avanzamento della diagnostica guidata dai biomarcatori e della medicina personalizzata.

Introduzione

Il plasma, la componente senza cellule del sangue, sta guadagnando sempre più riconoscimento come serbatoio di informazioni biologiche rilevanti per gli studi sulle malattie. Trasporta una moltitudine di biomolecole circolanti diverse, che vanno da proteine e metaboliti a lipidi e acidi nucleici, che sono uno specchio dello stato fisiologico e patologico dell'organismo. Questa natura sistemica del plasma lo rende un biocampione ideale per l'indagine sulla fisiopatologia delle malattie, che va dal cancro ai disturbi metabolici e infiammatori. Un grande vantaggio dell'utilizzo del plasma come campione risiede nel suo metodo di raccolta minimamente invasivo, che consente un campionamento ripetuto in contesti clinici, cosa importante per l'osservazione della progressione della malattia o della risposta terapeutica. Tuttavia, il plasma presenta una matrice proteomica estremamente complessa, in cui proteine come albumine e livelli di immunoglobuline si estendono su oltre dieci ordini di grandezza, mascherando^{l'identificazione 1}.

Negli ultimi due decenni, la proteomica plasmalogica ha permesso l'identificazione di biomarcatori clinicamente rilevanti come la gonadotropina corionica beta-umana (β-hCG) e la troponina I, guidati dai progressi nelle tecnologie di analisi proteica^{su larga scala 2}. Questi strumenti accettano, come input, informazioni altamente sensibili e, grazie alla loro natura ad alto rendimento, forniscono una profilazione su larga scala delle proteine plasmatiche. Con l'avvento delle piattaforme di cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS/MS), è ora possibile analizzare migliaia di specie proteiche utilizzando solo 10-50 μL di plasma in input, con un intervallo dinamico di rilevamento che copre diversi ordini di^{grandezza 3,4}. Ciò ha aumentato l'uso della proteomica plasmalogica nella ricerca traslazionale: diagnosi precoce della malattia, modelli prognostici migliorati e scoperta di nuovi bersagli terapeutici⁵.

Una tappa importante in questo ambito fu l'istituzione del Human Plasma Proteome Project (HUPO-HPPP), che catalogò sistemicamente le proteine plasmatiche e dimostrò la fattibilità della proteomica plasmalogica come campo^{consolidato 6}. Successivamente, il Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) ha adottato protocolli rigorosamente validati e studi interlaboratoriali per affrontare questioni di riproducibilità che in precedenza avevano sfidato la ricerca^{proteomica 7}. Queste iniziative hanno sottolineato la necessità di standardizzazione e hanno evidenziato procedure chiave, tra cui la gestione uniforme del plasma, l'esaurimento delle proteine abbondanti, la digestione enzimatica e parametri coerenti LC-MS/MS. Studi recenti di Geyer e colleghi hanno dimostrato che le firme proteomiche plasmatiche possono essere generate in modo affidabile su molti individui quando vengono utilizzate metodologie standardizzate, fornendo una base per studi a livello di popolazione e processi di validazione dei^{biomarcatori 8}.

La progressione della proteomica al plasma è stata notevolmente influenzata dal riconoscimento del controllo qualità (QC) e delle metriche di performance come componenti critici della progettazione sperimentale. Convenzionalmente, differenze nell'efficienza della digestione, nei tassi di identificazione dei peptidi e nelle prestazioni degli strumenti hanno portato a incongruenze tra gli studi di ricerca, influenzando così la riproducibilità. Sono stati condotti molti studi per affrontare questi problemi. Gawor et al. hanno delineato indicatori di qualità misurabili per la preparazione del campione e le prestazioni della spettrometria di massa, fornendo così un metodo sistematico per valutare la robustezza della pipeline di profilazione^{proteica 9}. Tsantilas et al. hanno presentato strumenti di benchmarking computerizzati che permettono ai ricercatori di confrontare dataset tra piattaforme e laboratori, aumentando così la trasparenza nella presentazione dei dati proteomici¹⁰. Inoltre, i progressi metodologici, come l'immunodeplezione, la frazionazione per dimensione-esclusione e l'acquisizione indipendente dai dati (DIA), hanno aumentato la copertura proteomica e ridotto il bias^{tecnico 11,12}. Tali misure di garanzia di qualità garantiscono che i dati proteomici del plasma siano riproducibili e fungano da impalcatura per futuri studi di traduzione clinica.

Nonostante questi significativi progressi, la complessità intrinseca del plasma continua a presentare delle sfide. È comune che l'analisi diretta del plasma grezzo produca una copertura proteomica subottimale, poiché proteine molto abbondanti soprafverano gli analiti a bassa abbondanza, molti dei quali sono i candidati biomarcatori più promettenti. Inoltre, la variazione tecnica derivante dalla quantificazione variabile delle proteine, dalla digestione incompleta e dalla pulizia inadeguata può contribuire ad artefatti di batch e a una diminuzione della comparabilità delle^coorti. Queste limitazioni sottolineano la necessità di flussi di lavoro altamente ottimizzati che bilancino profondità proteoma, riproducibilità e scalabilità. Questo protocollo di studio risponde a questa esigenza dimostrando un flusso di lavoro ottimizzato per la proteomica plasmatica che combina immunodeplezione, filtrazione a taglio a peso molecolare, liofilizzazione, normalizzazione e quantificazione delle proteine, digestione enzimatica e profilazione LC-MS/MS. Aumentando la copertura proteoma e riducendo la variazione tecnica, il quadro metodologico consente una quantificazione relativa coerente tra gruppi colpiti dalla malattia e gruppi di controllo. Introducendo scalabilità e accogliendo analisi a valle, il flusso di lavoro fornisce un metodo utilizzabile e riproducibile per estrarre informazioni clinicamente significative dalla proteomica del plasma.

Protocollo

Questo protocollo delinea un flusso di lavoro semplificato progettato per migliorare la proteomica plasmalogica per la scoperta di biomarcatori nelle malattie infiammatorie^{sistemiche 14,15}. Lo studio è stato condotto in conformità con il Comitato Etico Istituzionale e la Dichiarazione di Helsinki del 1975, come rivista nel 2000. È stato ottenuto il consenso informato dai partecipanti. Inizialmente, i campioni di plasma subiscono immunodeplezione per rimuovere proteine ad alta abbondanza, seguita da una filtrazione basata sul peso molecolare per ridurre la complessità del campione. I campioni vengono poi liofilizzati e quantificati per garantire che la concentrazione proteica sia adeguata per il processamento a valle. Dopo la normalizzazione, le proteine vengono sottoposte a digestione triptica per generare peptidi adatti all'analisi. Infine, la spettrometria di massa viene impiegata per rilevare e quantificare proteine a bassa abbondanza, facilitando confronti affidabili tra condizioni sane e patologiche (la Figura 1) mostra la pipeline della proteomica del sangue.

1. Raccolta di campioni:

1. Ottenere 3 mL di sangue dai partecipanti ai tubi Vacutainer con acido etilendediaminetetraacetico (EDTA) tramite venipuntura dalla vena antecubitale in condizioni asettiche. Questo viene eseguito da un flebotomista qualificato.
2. Per separare il plasma, centrifugare i campioni (rotore ad angolo fisso con 12 × 15 mL) per 10 minuti a 704 g. Conservare i campioni di plasma in conservazione a -80 °C fino a un successivo esame.

2. Immunodeplezione

NOTA: L'immunodeplezione è un metodo basato sulla cromatografia di affinità utilizzato per rimuovere selettivamente proteine ad alta abbondanza da fluidi biologici come siero, plasma e liquido cerebrospinale (LCR). Una cartuccia spin contenente anticorpi immobilizzati prende di mira e cattura 14 proteine comuni ad alta abbondanza, tra cui albumina, immunoglobuline (IgG, IgA, IgM), transferrina e complemento C3. Queste proteine vengono trattenute nella cartuccia mentre le proteine a bassa abbondanza passano per ulteriori analisi. La tecnica migliora il profiling proteomico riducendo la complessità del campione e migliorando la rilevazione di potenziali biomarcatori. Questo approccio è ampiamente adottato nella proteomica del plasma per migliorare sensibilità e riproducibilità^16,17.

1. Preparazione della cartuccia
   1. Rimuovi la cartuccia spin da 0,45 mL dal frigorifero. Lascialo equilibrare con la temperatura ambiente.
   2. Preparare l'eluzione Buffer A Equil/Load/Wash e Buffer B Elution in base al numero di campioni processati. Applicare circa 5 mL di Buffer A e 2 mL di Buffer B per ogni campione di plasma da 10 μL. Decant in tubi centrifughe sterili da 50 mL.
   3. Etichetta due siringhe sterili Luer-Lok da 5 mL come A per il tampone A e B per il tampone B.
2. Preparazione del campione di plasma
   1. Diluire ogni 10 μL di campione di plasma con 190 μL di Buffer A fino a un volume finale di 200 μL.
      NOTA: Aggiungere inibitori della proteasi al tampone A per evitare la degradazione delle proteine plasmatiche durante il lavoramento.
   2. Un campione di plasma può contenere particella. Potrebbe ostruire la cartuccia. Per evitare l'ostruzione e migliorare la nitidezza del campione, centrifugare il campione diluito attraverso un filtro a spin da 0,22 μm per 1 minuto a 16.000 ×g a 4 °C.
3. Configurazione della cartuccia
   1. Rimuovi il tappo della cartuccia e quello inferiore e conservali per usarli in seguito.
   2. Metti un adattatore Luer-Lok sulla cartuccia spin.
   3. Preleva 4 mL di Buffer A nella siringa etichettata "A" e collega la siringa all'adattatore Luer-Lok.
   4. Fai fluire gradualmente il buffer A attraverso la cartuccia per permettere alla resina di equilibrarsi e spostare l'aria intrappolata.
   5. Aspira il buffer in eccesso dalla parte superiore della cartuccia con una micropipetta sterile.
   6. Rimuovi l'adattatore Luer-Lok e deposita la cartuccia di rotazione in un tubo di raccolta a tappo a vite contrassegnato F1.
4. Carico del campione e raccolta delle frazioni
   1. Aggiungi 200 μL di plasma filtrato e diluito direttamente sul letto di resina.
   2. Centrifuga la cartuccia a 100 × g per 1 minuto a 4 °C. Lascia la cartuccia senza tappo o con un tappo morbido per permettere un flusso regolare.
   3. Raccogli la frazione di flusso F1 nel tubo di raccolta etichettato. Assicurati che il letto di resina e la fritta rimangano umidi dopo la centrifugazione.
   4. Lascia riposare la cartuccia a temperatura ambiente per 5 minuti.
5. Lavaggio e recupero delle frazioni a flusso diretto
   1. Aggiungi 400 μL di Buffer A sul letto di resina e centrifuga a 100 × g per 2,5 minuti a 4 °C. Aggiungi questo eluate al tubo di raccolta F1.
   2. Trasferisci la cartuccia in un nuovo tubo di raccolta etichettato F2.
   3. Aggiungi altri 400 μL di tampone A e centrifuga a 100 × g per 2,5 minuti a 4 °C. Raccogli l'eluate nel tubo F2.
6. Eluzione delle proteine legate
   1. Rimuovi la cartuccia dal tubo F2 e collega l'adattatore Luer-Lok.
   2. Riempi la siringa etichettata "B" con 2,5 mL di Buffer B e attaccala alla cartuccia.
   3. Spingi lentamente il Buffer B attraverso la cartuccia per eluire le proteine ad alta abbondanza legate in un nuovo tubo di raccolta.
      NOTA: Salvare la frazione legata se è necessaria un'ulteriore analisi; altrimenti, scartare in modo appropriato.
7. Riequilibrio delle cartucce
   1. Rimuovere la siringa contenente il tampone B dalla cartuccia e attaccare la siringa etichettata "A" contenente 5 mL di tampone A.
   2. Spingi lentamente il buffer A attraverso il letto di resina per riequilibrare la cartuccia a una portata di 0,5 mL al minuto.
      NOTA: Non permettere che il letto in resina o la fritta si asciughino. Lascia una piccola quantità di buffer sopra la fritta durante la conservazione.
   3. Una volta bilanciata, la cartuccia è pronta per il campione successivo.
8. Utilizzo a valle
   1. Per il massimo recupero di proteine a bassa abbondanza, si combinano le frazioni di flusso F1 e F2.
      NOTA: F1 e F2 possono essere analizzati separatamente se è richiesta un'analisi differenziale. Il buffer aggiunto è di 1 mL, quindi la frazione combinata F1 può essere di ~850 μL per garantire un buon recupero. Analizzare il plasma grezzo, il flusso attraverso e l'eluato tramite elettroforesi in gel di dodecil-solfato di sodio e poliacrilammide (SDS-PAGE) per confermare la rimozione delle prime 14 proteine ad alta abbondanza dal flusso attraverso il canale. 12,5 μL di flusso attraverso F1, plasma grezzo ed eluati saranno utilizzati per il carico in gel e ottenere un volume di pozzo di 25 μL (tampone campione Laemmli: rapporto campione 2:1)

3. Concentrazione proteica usando un concentratore di spin da 5 kDa

NOTA: La concentrazione di un campione utilizzando un concentratore di spin da 5 kDa si basa sul principio di esclusione della dimensione e filtrazione molecolare per ottenere una rapida concentrazione e un alto recupero delle biomolecole target in un unico tubo. Questo consente la concentrazione delle proteine tramite la rimozione dello scambio di solvente e tampone o la desalinizzazione della soluzione proteica.

1. Riempi il concentratore di centrifuga con fino a 4 mL del campione proteico.
2. Metti il concentratore di centrifuga in una centrifuga refrigerata.
3. Centrifugare a 5.000 × g a 10 °C per 30 minuti, o fino a raggiungere la riduzione volubile (ad esempio, 30× concentrazione).
4. Rimuovere il concentratore di spin dalla centrifuga e recuperare il campione concentrato dal fondo della camera di retento usando una micropipetta. Per garantire un buon recupero, prevedetevi un concentrato di ~150 μL recuperato da un campione totale di 850 μL di proteine.
   NOTA: Assicurarsi che la membrana non si secchi durante la centrifugazione per mantenere l'integrità proteica e l'efficienza del recupero.

4. Desalinizzazione e scambio del tampone

1. Scartare il filtrato dalla camera inferiore del concentratore.
2. Riempi il tubo della centrifuga con un volume uguale di 50 mM di buffer bicarbonato di ammonio (pH 7,2-7,4). (Ad esempio, se il retentate è di 150 μL, si aggiungono 150 μL di buffer)
3. Centrifugare di nuovo a 5.000 × g a 10 °C fino a raggiungere la concentrazione originale.
4. Ripeti questo processo di scambio tampone tre volte per rimuovere circa il 99% dei contaminanti da piccole molecole come sali o urea.
5. Concentrare i campioni proteici liofilizzandoli con un liofilizzatore a vuoto veloce.
   NOTA: Regolare il numero di cicli in base al grado di desalinizzazione necessario per le applicazioni a valle.

5. Quantificazione delle proteine tramite saggio sull'acido bicinconinico (BCA)

NOTA: La concentrazione proteica dei campioni è stata determinata utilizzando il test proteico BCA, con albumina sierica bovina (BSA) come standard. Il saggio BCA è un metodo colorimetrico compatibile con il detergente e basato sull'acido bicinconinico per rilevare e quantificare la proteina totale. Si basa sulla riduzione di Cu²⁺ a Cu⁺ da parte delle proteine in un ambiente alcalino (la reazione di Biuret), seguita da una rilevazione colorimetrica altamente sensibile e selettiva dello ione cuproso (Cu⁺) tramite un reagente contenente acido bicinconinico. Il saggio produce un complesso di colore viola formato dalla chelazione di uno ione cuproso con due molecole di BCA. Il saggio BCA produce una risposta coerente e lineare con la BSA, garantendo un riferimento standard affidabile per la curva. Sebbene sia noto che proteine diverse producono risposte differenti nel saggio BCA, l'uso della BSA fornisce una quantificazione relativa riproducibile tra campioni diversi. Poiché il nostro obiettivo era la normalizzazione per un carico proteico uguale piuttosto che la quantificazione assoluta di ogni specie, la calibrazione basata su BSA offriva l'approccio più robusto e riproducibile.

1. Procedura
   1. Aggiungere 25 μL di ciascun standard BSA (intervallo operativo 20-2000 μg/mL) e il campione proteico sconosciuto in pozzi designati di una piastra da 96 pozzi.
   2. Aggiungi 200 μL di reagente BCA funzionante in ogni pozzo.
   3. Mescola accuratamente usando uno shaker a micropiastre per 30 secondi.
   4. Copri il piatto e incuba a 37 °C per 30 minuti.
   5. Porta il piatto a temperatura ambiente.
   6. Misura l'assorbenza a 562 nm usando un lettore di microplacche.
2. Analisi dei dati
   1. Sottrai l'assorbanza media del blank (proteina zero) da tutti i valori di assorbenza campione e standard.
   2. Traccia una curva standard di assorbanza rispetto alla concentrazione di BSA (microgrammo/microlitro).
   3. Usa l'equazione di regressione dalla curva per calcolare le concentrazioni proteiche in campioni sconosciuti.

6. Normalizzazione della concentrazione proteica

1. Procedura
   1. Misurare la concentrazione proteica di ogni campione plasmatico utilizzando un metodo di quantificazione appropriato.
   2. Annota la concentrazione e il volume totale di ogni campione.
   3. Prepara 50 mM di bicarbonato di ammonio (pH 7,8) come diluente.
   4. Calcola la diluizione richiesta usando la formula C₁V₁ = C₂V₂.
   5. Per un campione con una concentrazione di 1,3 mg/mL e un volume di 100 μL, calcola il volume finale necessario per raggiungere 1 mg/mL:[V₂ = \frac{1,3 \x 100}{1} = 130\ \mu L]
   6. Calcola il volume del buffer da sommare sottraendo il volume iniziale dal volume finale: Volume del buffer = 130 μL − 100 μL = 30 μL.
   7. Aggiungere 30 μL di bicarbonato di ammonio da 50 mM (pH 7,8) al campione di plasma da 100 μL.
   8. Mescola delicatamente il campione tramite pipetto o vortice breve.
   9. Confermare che il volume finale è di 130 μL a una concentrazione normalizzata di 1 mg/mL.
   10. Procedere con la preparazione del campione proteomico a valle.
       NOTA: Garantire un aggiustamento accurato della concentrazione calcolando il fattore di diluizione richiesto basandosi sui risultati del test BCA. Ogni passaggio viene validato e i dati sono forniti come dati supplementari (Tabella Supplementare 1).

7. Preparazione del campione e digestione triptica

1. Riduzione delle proteine
   1. Aggiungere un agente riducente appropriato (ad esempio, 1,4-ditiotreitolo [DTT]) alla soluzione proteica nel tampone di bicarbonato di ammonio fino a una concentrazione finale di 100 mM.
   2. Incuba la miscela a 60 °C per 30 minuti in un termomiscelatore o blocco riscaldante.
      ATTENZIONE: Il DTT è un irritante e va gestito con guanti all'interno di una cappa fumi.
      NOTA: Ulteriori informazioni sulla tripsina utilizzata per la digestione sono state fornite nella Tabella dei Materiali. In breve, è stata utilizzata la tripsina trattata con tosil fenilalanile clorometil chetone (TPCK) di grado sequenziante (per eliminare l'attività chimotripttica) per garantire un'elevata specificità di clivagatura ai residui di lisina e arginina. L'attività enzimatica è stata verificata sulla base delle specifiche del produttore, corrispondenti a un'attività di N-Benzoil-L-Arginine Ethyl Ester (BAEE) di circa 1 unità per mg di proteina. Per quanto riguarda le concentrazioni di DTT e acetamide di iodo (IAA), confermiamo che i 100 mM di DTT e i 200 mM di IAA si riferiscono alle soluzioni standard, non alle concentrazioni finali utilizzate nella reazione. Le concentrazioni finali di lavoro durante la riduzione e l'alchilazione rientravano nell'intervallo standard (tipicamente 5-10 mM DTT e 10-20 mM IAA, rispettivamente).
2. Alchilazione dei residui di cisteina
   1. Lascia raffreddare il campione a temperatura ambiente per 5 minuti dopo la riduzione.
   2. Centrifuga brevemente per raccogliere condensa sul fondo del tubo.
   3. Aggiungere 200 mM di IAA preparati in un tampone di 50 mM di bicarbonato di ammonio (ABC) per alchilare i residui ridotti di cisteina.
   4. Incubare il campione al buio a temperatura ambiente per 30 minuti per evitare il degrado dell'IAA.
      NOTA: L'iodoacetamide è fotosensibile e potenzialmente tossica; Evita l'esposizione e la maneggia in luce fioca.
3. Digestione enzimatica
   1. Preparare la tripsina modificata di grado sequenziante in un buffer ABC da 50 mM immediatamente prima dell'uso.
   2. Aggiungi tripsina a ogni campione con un rapporto tripsina/proteina di 1:25 (a settimana).
   3. Incubare la reazione a 37 °C per 17 ore per consentire una completa digestione enzimatica.
      NOTA: Tempi di digestione prolungati possono portare a una digestione eccessiva; Garantire la stabilità della temperatura durante tutta l'incubazione.
4. Soffocare la reazione
   1. Fermare la reazione enzimatica aggiungendo acido formico a ogni campione per ottenere una concentrazione finale dell'1,0% (v/v).
   2. Incubare a 37 °C per 20 minuti per denaturare la tripsina residua e stabilizzare la miscela peptidica.
      ATTENZIONE: L'acido formico è corrosivo; Utilizzare dispositivi di protezione individuale (DPI) appropriati e lavorare in una cappa chimica.
5. Recupero peptidico
   1. Centrifuga la miscela di peptidi digeriti a 3500 g per 12 minuti a temperatura ambiente per rimuovere il materiale insolubile.
   2. Trasferire con cura il sovrandanante trasparente contenente peptidi digeriti nelle fiale dell'autocampionatore senza disturbare il pellet.
   3. Conservare le soluzioni peptidiche a -20 °C fino a ulteriori analisi LC-MS/MS.
6. Preparazione per l'analisi LC-MS
   1. Carica i campioni peptidici direttamente sul sistema LC-MS dotato di mobilità ionica per la separazione e l'analisi dei peptidi.
   2. Assicurati che tutte le fiale siano correttamente sigillate per prevenire evaporazione e contaminazione.

8. Analisi LC MS-MS

1. Carico peptidico e desalinizzazione
   1. Carica 1 μg del campione peptidico in un anello del campione in modalità iniezione a anello parziale.
   2. Desalinizzare i peptidi utilizzando una colonna di trappola C18 lavando con solvente acquoso contenente lo 0,1% di acido formico a una portata di 15 μL/min per 1 minuto.
      NOTA: Usa acqua con acido formico allo 0,1% come solvente A e acetonitrile con acido formico allo 0,1% come solvente B durante tutta la produzione.
2. Separazione peptidica
   1. Collega la colonna del trapone in linea con una colonna C18 analitica a fase inversa.
   2. Peptidi eluti utilizzando un gradiente lineare dal 3% al 40% di Solvente B in 55 minuti a una portata di 300 nL/min.
   3. Risciacqua la colonna con il Solvente B all'80% per 7,5 minuti per rimuovere i componenti trattenuti.
   4. Riequilibrare la colonna con il 3% di Solvente B prima della successiva iniezione.
   5. Mantieni il forno a colonna a 35 °C e l'autocampionatore a 4 °C durante la funzione.
      NOTA: Includere iniezioni a vuoto tra i campioni e i campioni per minimizzare il trasferimento.
3. Impostazioni di acquisizione della spettrometria di massa
   1. Analisi spettrale di massa dei peptidi eluzionanti
      1. Configura il sistema UPLC e accoppialo direttamente all'High-Definition MS.
      2. Controlla il sistema usando il software Microsoft.
      3. Assicurarsi che lo spettrometro di massa sia configurato come uno strumento ibrido a quadrupoli ioni-mobilità-accelerazione-tempo di volo ortogonale (oa-TOF).
      4. Verifica che tutte le connessioni di azoto e gas di spruzzo siano sicure e prive di perdite prima di iniziare l'operazione.
         ATTENZIONE: Maneggiare connessioni ad alta tensione e gas pressurizzati in conformità con gli standard di sicurezza di laboratorio.
   2. Configurazione di ionizzazione
      1. Azionare lo spettrometro di massa in modalità ionizzazione elettrospray positiva (ESI) utilizzando una sorgente di ioni elettrospray doppia.
      2. Imposta la tensione capillare nano-ESI a 3,4 kV.
      3. Regolare la tensione del cono di campione a 40 V e quella del cono di estrazione a 4 V.
      4. Imposta il flusso di gas azoto della spettrometria della mobilità ionica (IMS) a 90 mL/min.
      5. Ispeziona la stabilità dello spruzzo e assicurati che la corrente ionica sia costante prima di procedere.
   3. Separazione della mobilità ionica
      1. Imposta l'altezza dell'impulso guida ionica IMS a 40 V durante la trasmissione ionica.
      2. Regola la velocità della guida ionica IMS a 800 m/s.
      3. Aumentare linearmente l'altezza dell'onda di movimento da 8 V a 20 V durante l'intero ciclo IMS per ottenere una separazione ottimale degli ioni tramite mobilità.
         ATTENZIONE: Garantire un flusso stabile di gas IMS; le fluttuazioni possono influenzare la separazione degli ioni e la riproducibilità temporale di deriva.
   4. Calibrazione della massa del blocco
      1. Calibrare l'analizzatore di tempo di volo (TOF) utilizzando una soluzione di iodio di sodio (NaI) da 2 μg/μL.
      2. Imposta il raggio di calibrazione per rilevare ioni tra 50 m/z e 2000 m/z.
      3. Acquisire spettri di riferimento di massa lock ogni 45 secondi utilizzando il canale sorgente di ioni elettrospruzzi doppio per la correzione di massa in tempo reale.
      4. Verifica che la curva di calibrazione raggiunga una precisione di massa entro ±5 ppm prima di procedere all'acquisizione dei dati.
4. Acquisizione dati
   1. Acquisire dati in modalità continuo, alternando due funzioni:
      1. Funzione 1 (MS a bassa energia): Registrare spettri ionici precursori a bassa energia.
      2. Funzione 2 (HDMSE ad alta energia): Registrare spettri di ioni frammentati a energia di collisione elevata con separazione della mobilità degli ioni.
   2. Nella Funzione 2, imposta l'energia di collisione nella regione Trappola a 4 eV.
   3. Aumentare l'energia di collisione nella regione di trasferimento da 20 eV a 45 eV per ottenere una frammentazione peptidica controllata.
   4. Imposta il tempo di acquisizione spettrale per funzione a 0,9 s e il ritardo interscan a 0,024 s.
   5. Monitorare il cromatogramma ionico totale (TIC) per confermare la risposta consistente dello strumento durante tutta la corsa.
   6. Importare dati grezzi in software di analisi proteomica (ad esempio, Progenesis QI o equivalente).
   7. Allinea i cromatogrammi tra le sequenze usando il riferimento predefinito dell'allineamento o una sequenza di riferimento selezionata manualmente.
   8. Identificare peptidi e proteine utilizzando un database curato (ad esempio, UniProt Human - solo voci revisionate).
   9. Imposta i seguenti parametri di ricerca:
      Enzima: tripsina
      Modifica fissa: Carbamidilazione (C)
      Modifica variabile: ossidazione (M)
      Tolleranza ai peptidi: Secondo la risoluzione dello strumento
      Scollature mancate consentite: 1
      Tasso di false scoperte (FDR): ≤ 1%
   10. Esegui la normalizzazione utilizzando il metodo di normalizzare a tutte le proteine .
   11. Applicare soglie di filtraggio: ≥2 peptidi per proteina, ≥1 peptide unico, variazione di piegatura ≥1,5 e valore p aggiustato <0,05.
       NOTA: Questa è una guida generale sulla sicurezza dei laboratorio: segui sempre le normative EHS (Salute e Sicurezza Ambientale) dell'istituzione e i requisiti legali locali.
5. Controllo qualità
   1. Eseguire controlli di calibrazione pre e post esecuzione utilizzando lo standard NaI per confermare l'accuratezza di massa.
   2. Assicurarsi che il riferimento di massa del blocco rimanga stabile durante tutta l'analisi.
   3. Valutare le iniezioni replicate per confermare la riproducibilità nel tempo di ritenzione, nel tempo di deriva e nell'intensità spettrale.
      ATTENZIONE: Lo ioduro di sodio è un irritante. Durante la maneggiazione, usa i guanti ed evita l'inalazione o il contatto con la pelle.
      NOTA: Consulta il File Supplementare 1 per indicazioni sullo smaltimento dei rifiuti. Lavora sempre in un ambiente freddo o su ghiaccio quando manipolassi campioni di plasma per prevenire la degradazione delle proteine. Indossa guanti Nitryl, camice da laboratorio e protezione oculare mentre maneggi campioni biologici e buffer. Eseguire i passaggi di centrifugazione utilizzando una centrifuga refrigerata pre-raffreddata a 4 °C. Assicurati che tutti i tubi delle centrifughe e le siringhe utilizzate siano sterili e correttamente etichettati per evitare contaminazioni incrociate. Usa sempre acqua di grado proteomico per preparare i tamponi.

Risultati

I campioni di plasma sono stati processati utilizzando una cartuccia spin per rimuovere selettivamente 14 proteine ad alta abbondanza, ovvero albumina, IgG, IgA, transferrina, aptoglobina, antitripsina, fibrinogeno, alfa2-macroglobulina, glicoproteina alfa1-acida, IgM, apolipoproteina AI, apolipoproteina AI, complemento C3 e transtiretina. Questo passaggio di deplezione è stato fondamentale per migliorare la rilevazione di biomarcatori a bassa abbondanza nell'analisi proteomica a valle. ...

Discussione

La complessità intrinseca del plasma come matrice biologica rappresenta una sfida importante per l'analisi proteomica. L'enorme gamma dinamica delle concentrazioni proteiche, insieme alla predominanza di poche specie ad alta abbondanza, può mascherare la rilevazione di proteine clinicamente rilevanti e di abbondanza inferiore. Per questo studio attuale, abbiamo mitigato questi svantaggi utilizzando una pipeline standardizzata a più fasi per la preparazione del campione, progettata per ar...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Concentratore di spin a taglio di peso molecolare da 5 kDa	Tecnologie Agilent	5185 e meno; 5991	Utilizzato per lo scambio di tampone e la rimozione del sale; trattiene proteine superiori a 5 kDa
Bicarbonato di ammonio (ABC)	Sigma Aldrich	Numero di catalogo: T6567	Utilizzato per la digestione triptica
Buffer A Equil/Load/Wash	Tecnologie Agilent	5185-5987
Eluzione del tampone B	Tecnologie Agilent	5185-5988
Centrifuga fredda	Centrifuga refrigerata CPR-30 Plus	N/A	Utilizzato per centrifugare campioni di proteine a bassa temperatura
DTT	Sigma Aldrich	CASNo: 3483-12-3	Utilizzato per la digestione triptica
Apparecchio elettroforetico	BIO RAD	1658004	Utilizzato per SDS PAGE
IAA	Sigma Aldrich	Numero CAS: 144-48-9	Utilizzato per la digestione triptica
IMS T-Wave & nbsp;	Acque	https://www.waters.com/content/dam/waters/en/library/white-papers/2012/water-whitepapers-Triwav ePiùCaratterizzazione Completa di Mi xturesandMolecules-720004176.pdf	Separazione della mobilità ionica (IMS)
Lettore multimodalità Infinite M Plex	TECAN		Lettore multiplo
Sistema LC-MS	Acque	https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/liquid-chromatography-ms-systems.html
Software MassLynx 4.1 SCN781	Acque	https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/informatics-and-software/mass-spectrometry-software/masslynx-mass-spectrometry-software.html	Software per spettrometria di massa
Cartuccia di spin a rimozione multipla di affinità umana 14 (MARS Hu-14)	Tecnologie Agilent	5188 e meno; 6560	Utilizzato per esaurire 14 proteine plasmatiche ad alta abbondanza, tra cui albumina, IgG, IgA, transferrina, ecc.
Sistema nanoACQUITY UPLC	Acque	https://www.waters.com/nextgen/en/products/chromatography/chromatography-systems/acquity-uplc-m-class-system.html
NanoLockSpray	Acque	https://www.waters.com/nextgen/us/en/services/instrument-services/instrument-upgrades/mass-spectrometry-ms-upgrades/nanolockspray-exact-mass-ionization-source-upgrade.html
Operone FDU-7003	Operone	http://www.operon.co.kr/en/pro2-FDU.html	Liofilizzatore a vuoto di velocità
Kit di analisi proteica Pierce BCA	Thermo Scientific	23225	Utilizzato per quantificare la concentrazione proteica tramite saggio colorimetrico
Progenesi QI per Proteomica	Acque	V4.2
Centrifuga laboratorio R-8C BL, rotore ad angolo fisso con 12 e più volte; 15 mL	REMI		Centrifuga
SYNAPT G2 MS ad alta definizione	Sistema HDMSE, Waters Corporation	https://www.waters.com/content/dam/waters/en/app-notes/2009/720003057/720003057-en.pdf	Spettrometro di massa ibrido a quadrupolo IMS ortogonale accelerazione in volo (oa-Tof)
Fiala di recupero totale	Acque	https://www.waters.com/nextgen/us/en/shop/vials-containers--collection-plates/186004631-clear-glass-12-x-32-mm-screw-neck-total-recovery-vial-preassembl.html
Tripsina	Sigma Aldrich	Numero di catalogo: T6567	Utilizzato per la digestione triptica