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Articolo di ricerca
L'acido lipoico attiva la via citoprotettiva Nrf2/HO-1 nella cheratite fungina, riducendo i livelli di citochine infiammatorie e danni corneali. Questa terapia guidata dall'ospite dimostra profili di sicurezza superiori rispetto agli antifungini convenzionali, fornendo al contempo intuizioni meccanicistiche sul trattamento delle malattie oculari causate dallo stress ossidativo attraverso il potenziamento endogeno delle vie antiossidanti.
L'acido lipoico (LA), un antiossidante ditiol con un profilo di sicurezza oculare esemplare, è stato studiato per la sua capacità di temperare l'ambiente ossido-infiammatorio che alimenta la cheratite fungina. Le cellule epiteliali corneali umane tolleravano LA fino a 60 μM senza perdita di vitalità e, dopo la sfida con Aspergillus fumigatus , LA ha indotto un'escalation triplice della traslocazione nucleare del fattore eritroide 2 (Nrf2) e un aumento di cinque volte nel suo effettore a valle eme ossigenasi-1 (HO-1). Il silenziamento farmacologico di Nrf2 con ML385 o il blocco catalitico di HO-1 con lo stagno protoporfirina IX hanno abrogato questi eventi molecolari e ripristinato l'espressione di interleucina-1β e fattore di necrosi tumorale α, confermando una dipendenza stretta da Nrf2/HO-1. Esperimenti paralleli in un modello di cheratite murina hanno confermato le osservazioni in vitro : LA topica ha ridotto l'opacità corneale e i punteggi infiammatori del 47%, amplificando contemporaneamente l'espressione corneale di Nrf2 e HO-1 mentre dimezzava i trascriti di citochine; la co-somministrazione di SnPPIX annullava questi benefici. Collettivamente, i dati delineano una gerarchia meccanicistica coerente in cui LA, a concentrazioni clinicamente raggiungibili, aumenta i livelli di proteine Nrf2 e aumenta la traslocazione nucleare, potenzia l'attività di HO-1 e quindi placa la turbolenza citocineica indotta dai patogeni. Questi risultati posizionano LA come un aggiunto facilmente traducibile e diretto dall'ospite, capace di integrare la chemioterapia antifungina e suggeriscono prospettive terapeutiche più ampie per la modulazione Nrf-centrica dell'infiammazione corneale che minaccia la vista.
La cheratite fungina (FK) è ora riconosciuta come un'emergenza oftalmica diffusa, responsabile di oltre 1 milione di casi dimostrati in coltura ogni anno e di una quota sproporzionata di cecità corneale nelle regioni tropicali esubtropicali 1,2. Le stime di incidenza che si avvicinano a 6-8 ogni 100.000 abitanti negli Stati Uniti e ancora più alte nelle economie agrarie sottolineano una minaccia globale crescente che colpisce preferenzialmente le popolazioni in età lavorativa dopo traumi vegetali o usura delle lentia contatto 3,4. I funghi filamentosi, in particolare specie di Fusarium e Aspergillus, dominano il paesaggio eziologico, prosperando in climi caldi e umidi e sfruttando microlesioni oculari per innescare infezioni5.
Nonostante mezzo secolo di utilizzo clinico, la natamicina 5% rimane l'unico agente topico approvato specificamente per la FK; tuttavia, la sua chimica poliene conferisce una scarsa penetrazione corneale, richiede dosaggi frequenti e non è universalmentedisponibile 6,7. Allarmante, uno studio di sorveglianza successivo dal Sud Asia ha rivelato aumenti incrementali delle concentrazioni inibitorie minime sia di natamicina che di triazoli, con isolati di Fusarium che mostrano un aumento annuo del ≥6% della resistenza alla natamicina e una tendenza parallela per voriconazolo8. Questi dati sono in linea con i rapporti clinici di fallimenti terapeutici e rafforzano le previsioni secondo cui il mercato dei farmaci FK si espanderà da 0,9 miliardi di dollari nel 2023 a 1,48 miliardi di dollari entro il 2033, dovuti in gran parte alle carenze della farmacoterapia attuale. Le misure chirurgiche ad hoc, come i lembi congiuntivali o la cheratoplastica penetrante, salvano l'anatomia nelle ulcere recalcitranti, ma richiedono molte risorse e limitano lavista 9. Collettivamente, queste carenze sottolineano la necessità di strategie dirette dall'ospite o multitarget che vadano oltre la sola azione fungistatica.
Lo stress ossidativo e la conseguente cascata infiammatoria sono ora riconosciuti come determinanti fondamentali della patogenesi fungina e delle cicatrici corneali. In caso di invasione fungina, le cellule epiteliali corneali e le popolazioni immunitarie residenti, inclusi mastociti congiuntivali, cellule dendritiche limbali e cheratociti stromali, avviano risposte immunitarie innate tramite recettori di riconoscimento di pattern, come Dectin-1 e recettoriToll-like 10. Le specie reattive di ossigeno derivate dai neutrofili (ROS) si accumulano nello stroma infetto come parte dell'esplosione ossidativa antimicrobica, mentre macrofagi infiltrati e linfociti T perpetuano l'infiammazione cronica tramite amplificazione dellecitochine 11. Paradossalmente, i funghi filamentosi regolano al massimo i propri circuiti antiossidanti (ad esempio, le dismutasi superosside regolate da Yap1) per sopravvivere a questo ambiente ostile. L'eccesso di ROS attiva a sua volta la trascrizione dipendente da NF-κB di IL-1β, TNF-α e altri mediatori pro-infiammatori che favoriscono la distruzione dei tessuti e l'opacizzazionecorneale 12. Al centro della citoprotezione endogena si trova il fattore eritroide 2 (Nrf2), la cui traslocazione al nucleo orchestra l'espressione dell'eme ossigenasi-1 (HO-1) e di una serie di enzimi detossicanti in molteplici tipi cellulari corneali, incluse cellule epiteliali, cheratociti e celluleendoteliali 13,14. L'invecchiamento, il diabete e l'infiammazione cronica riducono questo asse, rendendo i tessuti oculari vulnerabili a insulti ossidativi, mentre il potenziamento genetico o farmacologico di Nrf2 accelera la chiusura della ferita epiteliale e sopprime l'aumento delle citochine in diverse lesionicorneali 15.
Studi proof-of-concept hanno iniziato a sfruttare questo percorso nella FK. Piccole molecole naturali come il perillaldeide16, l'acidogallico 17, l'idrossitirosolo18 e il composto organoselenico ebselen19 ottengono effetti antifungini e antinfiammatori potenziando la segnalazione di Nrf2-HO-1 compromettendo direttamente la vitalità fungina. Le piattaforme di nanomedicina che co-erogano antifungini e antiossidanti illustrano ulteriormente la promessa terapeutica di combinare la rimozione dei patogeni con il rinforzo della difesadell'ospite 20,21. Tuttavia, molti di questi candidati affrontano ostacoli traslazionali legati alla complessità della formulazione o alla sicurezza oculare non comprovata.
L'acido lipoico (LA) è un antiossidante ditiolo onnipresente con una solida storia di sicurezza sistemica e un'eccezionale versatilità farmacodinamica. Sulla base di studi su tessuti epatici e neurali, 10,12 LA è proposto di modificare direttamente i residui di cisteina (in particolare Cys151, Cys273 e Cys288) sulla proteina ECH-associata simile al kelch (Keap1), interrompendo la sua interazione con Nrf2 e prevenendo così l'ubiquitinazione e la degradazione proteasomica, che porta a un aumento dei livelli di proteine Nrf2, un aumento della traslocazione nucleare e un aumento della trascrizione di HO-1. Tuttavia, una dimostrazione diretta dell'interazione Keap1-LA nelle cellule epiteliali corneali richiede indagini future. LA ha dimostrato benefici citoprotettivi nei modelli epatici, neurali e oculari di lesioni ossidative13,15. La sua natura anfipatica facilita la penetrazione dei tessuti senza la tossicità di membrana osservata con i poliene, e già esistono formulazioni cliniche per indicazioni topiche e sistemiche. Tuttavia, la capacità di LA di modulare il microambiente infiammatorio corneale e quindi migliorare la FK non è stata esaminata in modo rigoroso.
Il presente studio, quindi, ha indagato se LA potesse mitigare la cheratopatia indotta da A. fumigatus attivando l'asse Nrf2/HO-1 mentre sopprimeva le citochine pro-infiammatorie. Utilizzando cellule epiteliali corneali umane e un modello FK murino validato, abbiamo delineato le caratteristiche dose-risposta, analizzato le dipendenze meccanicistiche con inibitori selettivi e confrontato gli esiti terapeutici contro gruppi di controllo non infetti e gruppi trattati con veicoli infetti. Per quanto ne sappiamo, questa rappresenta la prima indagine sistematica per stabilire l'efficacia terapeutica dell'acido lipoico nella cheratite fungina attraverso una caratterizzazione completa dose-risposta, la dissezione meccanicistica tramite inibitori farmacologici selettivi sia di Nrf2 che di HO-1, e la validazione sia in modelli cellulari che animali. Questo lavoro integra in modo unico letture molecolari, cellulari e traslazionali per fornire prove definitive della dipendenza dalla via Nrf2/HO-1 alla base degli effetti antinfiammatori della LA. Integrando letture molecolari, cellulari e in vivo , abbiamo cercato di fornire una valutazione completa di LA come terapia facilmente traducibile e diretta dall'ospite che affronta i due imperativi gemelli dell'eradicazione dei patogeni e della contenzione infiammatoria nella FK.
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Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali Istituzionali (Numero di protocollo: IACUC-2024-FK-007) e condotte in conformità con la Dichiarazione dell'Association for Research in Vision and Ophthalmology for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. I maschi C57BL/6 topi, di età compresa tra 8 e 10 settimane e con un peso di 20-25 g, sono stati alloggiati in gabbie ventilate individualmente in condizioni ambientali controllate di 22 ± 2 °C e umidità relativa del 50%-60% con un ciclo chiaro-buio di 12:12 ore. Questi animali specifici privi di patogeni sono stati ottenuti dai Charles River Laboratories (vedi Tabella dei Materiali). Tutti i topi hanno subito un periodo di acclimatazione di 1 settimana per adattarsi al nuovo ambiente prima delle procedure sperimentali, con accesso illimitato al cibo e all'acqua standard per roditori.
ATTENZIONE: Aspergillus fumigatus è un organismo patogeno che richiede un contenimento di livello di biosicurezza 2. Tutte le colture fungine devono essere manipolate in un armadietto di sicurezza biologica certificato utilizzando dispositivi di protezione individuale appropriati, inclusi guanti, camice da laboratorio e protezione per gli occhi. Il dimetilsolfosidismo (DMSO) è infiammabile e può penetrare nella pelle; Maneggiare in aree ben ventilate ed evitare il contatto diretto. Ketamina e xilazina sono sostanze controllate che richiedono conservazione sicura e documentazione adeguata secondo le normative istituzionali.
Preparazione sperimentale
Tutti i reagenti, farmaci e materiali necessari sono stati preparati secondo il flusso di lavoro sperimentale (vedi Tabella dei Materiali e Figura Supplementare 1 per lo schema). Soluzioni stock racemiche (±)-α-acido lipoico (LA) sono state preparate utilizzando acido racemico α-lipoico (1,2-ditiolano-3-pentanoico) disciolto in DMSO fino a una concentrazione di 60 mM e conservato in aliquote monouso a -80 °C per prevenire la degradazione ossidativa. L'inibitore di Nrf2 ML385 e l'inibitore HO-1 SnPPIX sono stati preparati e aliquotati in modo simile per uso singolo per evitare cicli di gelo-disgelo. Tutti i mezzi di coltura cellulare e gli integratori venivano preparati in condizioni sterili e preriscaldati a 37 °C prima dell'uso.
Tutti i materiali contaminati da colture fungine, inclusi piatti di agar, tubetti di coltura e plastiche usa e getta, sono stati autoclavati a 121 °C per 30 minuti prima di essere smaltiti in contenitori di rifiuti biologici. I rifiuti chimici contenenti solventi organici venivano raccolti separatamente e smaltiti tramite protocolli istituzionali di salute e sicurezza ambientale. Tessuti e carcasse animali sono stati inceneriti tramite servizi di rifiuti biomedici approvati.
Coltura fungina e preparazione delle infezioni
Aspergillus fumigatus è stato coltivato su agar di destrosio Sabouraud a 37 °C per 5-7 giorni fino a quando non è stata osservata la formazione matura di conidi. I conidi sono stati raccolti allagando colture mature con soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) contenente lo 0,05% di Tween-80, e le sospensioni conidiali sono state filtrate attraverso garze sterili per rimuovere frammenti di ifali. La concentrazione di conidii è stata determinata tramite un emocitometro e regolata alle concentrazioni stabilite basandosi su modelli di cheratite fungina pubblicati. Per gli esperimenti in vitro, è stato selezionato 1 x 106 conidi/mL (molteplicità di infezione di 10:1) sulla base di studi precedenti che dimostravano che questa concentrazione induce risposte infiammatorie robuste nelle cellule epiteliali corneali, mantenendo al contempo un'adeguata vitalità cellulare per le analisi avalle 16,17. Per gli studi in vivo, è stato scelto 1 x 107 conidi/mL poiché questo inoculo produce cheratite di gravità moderata e costante con punteggi di malattia riproducibili entro il quinto giorno post-infezione, fornendo un intervallo dinamico sufficiente per valutare l'efficacia terapeutica senza mortalitàeccessiva 16,19.
Trattamento animale e infezione corneale
In anestesia generale (iniezione intraperitoneale di ketamina 100 mg/kg e xilazina 10 mg/kg), la cheratite fungina è stata indotta creando tre graffi lineari di 1 mm sulla cornea centrale utilizzando un ago sterile da 25G, seguiti dall'applicazione topica di 5 μL di sospensione conidiale di A. fumigatus . I topi sono stati assegnati casualmente ai gruppi di trattamento (n=8 per gruppo): controllo (non infetti), controllo infetto, trattamento infetto + LA (60 μmol/L topicamente 4 volte al giorno) e infetti + trattamento LA + SnPPIX (LA più 5 mg/kg SnPPIX intraperitonealmente al giorno). La valutazione clinica e la raccolta dei tessuti sono state effettuate al quinto giorno dopo l'infezione.
Precauzioni sulla gestione degli animali: Tutte le procedure che coinvolgono animali anestetizzati devono essere eseguite in condizioni asettiche. Monitorare continuamente gli animali durante l'anestesia per la depressione respiratoria. Smaltire la biancheria contaminata, i rifiuti chirurgici e i tessuti infetti tramite autoclaving seguito dall'incenerimento secondo i protocolli istituzionali di gestione dei rifiuti biologici.
Coltura cellulare e trattamento
Le cellule epiteliali corneali umane (HCEC) sono state prelevate dall'ATCC e mantenute in mezzo DMEM/F-12 integrato con siero bovino fetale al 10%, 1% di penicillina-streptomicina e 1% di L-glutamina a concentrazioni equimolari a 37 °C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO₂. Le cellule venivano subcolture ogni 3-4 giorni al raggiungimento dell'80%-90% di confluenza e utilizzate tra i passaggi 3-8 per garantire la coerenza. Per i trattamenti sperimentali, le cellule sono state seminate a 5 x 10⁴ cellule per pozzo in placche appropriate e lasciate aderire per 24 ore prima del trattamento. Per tutti gli esperimenti meccanicistici in vitro , le cellule sono state esposte per la prima volta a conidi di Aspergillus fumigatus con una molteplicità di infezione (MOI) di 10:1 per 4 ore per stabilire l'infezione, seguita dall'aggiunta di LA (60 μM), ML385 (5 μM) o SnPPIX (1 μM) da sola o in combinazione per ulteriori 24 ore prima della raccolta del campione. Questo disegno sequenziale consente la valutazione degli effetti terapeutici degli LA sulla sfida fungina consolidata piuttosto che sul trattamento profilattico.
Valutazione della vitalità cellulare (analisi CCK-8)
La vitalità cellulare è stata valutata utilizzando il Kit di Conteggio Cellulare-8 (CCK-8). Le cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzi a 5 x 104 cellule per pozzo e incubate per 24 ore prima del trattamento. Dopo l'esposizione al farmaco, sono stati aggiunti 10 μL di soluzione di CCK-8 a ciascun pozzo e le piastre sono state incubate per 2 ore a 37 °C. L'assorbanza è stata misurata a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre multimodale. Ogni condizione sperimentale è stata eseguita in ottuplicata, e gli esperimenti sono stati ripetuti tre volte indipendentemente. La concentrazione di controllo del veicolo (DMSO) è stata mantenuta sotto lo 0,1% per evitare effetti citotossici.
Estrazione di RNA e PCR quantitativa in tempo reale
L'RNA totale è stato isolato da cellule coltivate e tessuti corneali utilizzando il RNeasy Mini Kit secondo il protocollo del produttore. I campioni di tessuto sono stati omogeneizzati in tampone RLT utilizzando un omogeneizzatore tissutale per 2 minuti a 50 Hz. La qualità e la concentrazione di RNA sono state valutate con uno spettrofotometro, con campioni con rapporti 260/280 di 1,8-2,0 utilizzati per l'analisi a valle. La sintesi del cDNA a primo filamento è stata eseguita utilizzando il Kit di Trascrizione Inversa di CDNA ad Alta Capacità con 1 μg di RNA totale per ogni reazione. La PCR quantitativa è stata condotta utilizzando il master mix qPCR basato su SYBR Green su un sistema PCR in tempo reale con denaturazione iniziale a 95 °C per 2 minuti, seguita da 40 cicli a 95 °C per 15 secondi e 60 °C per 1 minuto. È stata eseguita un'analisi della curva di fusione per verificare la specificità degli amplicon. Tutti gli innesco sono stati convalidati per efficienza (90%-110%) e specificità prima dell'uso. L'espressione relativa dell'mRNA è stata calcolata utilizzando il metodo 2(-ΔΔCT) con GAPDH come gene di riferimento.
Estrazione proteica e analisi del Western blot
Per l'estrazione totale delle proteine, cellule e tessuti sono stati lisati in un tampone RIPA integrato con cocktail inibitori di proteasi e fosfatasi. Le frazioni proteiche nucleari e citoplasmatiche sono state preparate utilizzando i reagenti di estrazione nucleare e citoplasmatica NE-PER secondo il protocollo del produttore. Le concentrazioni proteiche sono state determinate utilizzando il saggio di Bradford. Quantità uguali di proteine (30-50 μg) sono state separate da SDS-PAGE e trasferite alle membrane PVDF. Dopo il blocco con latte scremato al 5% in soluzione salina Tris-buffer contenente 0,1% Tween-20 per 1 ora, le membrane sono state incubate con anticorpi primari durante la notte a 4 °C, seguite da anticorpi secondari coniugati HRP per 1 ora a temperatura ambiente. Le bande proteiche sono state visualizzate utilizzando reagenti chemiluminescenze potenziati con tempi di esposizione di 30-180 s a seconda dell'intensità del segnale. Le bande sono state quantificate utilizzando il software ImageJ, con β-actina che funge da controllo del carico per le proteine totali e lamina B1 per le proteine nucleari.
Valutazione clinica e analisi istologica
La gravità della malattia corneale è stata valutata utilizzando un sistema di punteggio clinico standardizzato basato su protocolli consolidati per la cheratite funginamurina 22. Il sistema di punteggio valuta tre parametri su scala 0-4: opacità corneale (0 = limpida, 4 = completamente opaca), irregolarità superficiale (0 = liscia, 4 = ulcera grave con perforazione) e risposta infiammatoria (0 = nessun infiltrato, 4 = infiltrazione densa con ipopione), che danno punteggi totali da 0 a 12. Tutte le valutazioni cliniche sono state effettuate da due osservatori indipendenti che sono stati mascherati per assegnazioni di gruppo terapeutico, con un accordo tra osservatori superiore al 90%. Le fotografie corneali sono state catturate utilizzando un biomicroscopio a lampada a fessura dotato di una fotocamera digitale. Per l'analisi istologica, gli occhi sono stati enucleati, fissati in paraformaldeide al 4%, incorporati in paraffina e sezionati a uno spessore di 5 μm. Le sezioni sono state colorate con ematossilina ed eosina per una valutazione morfologica generale.
Saggio immunoenzimatico legato (ELISA)
I livelli secreti di IL-1β e TNF-α nei supernatanti di colture cellulari e negli omogeneati del tessuto corneale sono stati quantificati utilizzando kit ELISA commerciali secondo le istruzioni del produttore. I soprantativi in coltura cellulare sono stati raccolti dopo 24 ore di trattamento, mentre i tessuti corneali sono stati omogeneizzati in inibitori della proteasi contenenti PBS. I campioni sono stati centrifugati a 12.000 x g per 10 minuti a 4 °C, e sono stati utilizzati i surnatanti per l'analisi ELISA. Tutti i campioni sono stati analizzati in duplicato e le concentrazioni di citochine sono state calcolate a partire da curve standard.
Analisi statistica
Tutti gli esperimenti sono stati condotti con repliche biologiche appropriate (n ≥6 per gli studi in vitro , n = 8 per gli studi su animali) e ripetuti almeno 3 volte in modo indipendente. I dati sono presentati come media ± errore standard della media (SEM). L'analisi dei dati è stata effettuata utilizzando GraphPad Prism versione 9.0. In particolare, abbiamo utilizzato la funzione del test di normalità (Shapiro-Wilk) per valutare la distribuzione dei dati, l'ANOVA unidirezionale con il test di confronti multipli di Tukey per esperimenti con più di due gruppi, e il test t di Student non accoppiato per confronti a due gruppi. I grafici venivano generati come grafici a barre raggruppati con i singoli punti dati sovrapposti come diagrammi a scatter, con barre di errore che rappresentavano l'errore standard della media.
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Il flusso di lavoro sperimentale ha dimostrato che il trattamento con acidi lipoici modula efficacemente la via di segnalazione Nrf2/HO-1 per sopprimere l'infiammazione nei modelli di cheratite fungina.
Valutazione della citotossicità dell'acido lipoico e degli inibitori specifici delle vie
Sono stati condotti studi iniziali dose-risposta per stabilire le concentrazioni ottimali per ciascun composto utilizzato in questa indagine. LA ha dimostrato un'eccellente biocompatibil...
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I risultati attuali confermano che l'acido lipoico (LA) è un potente induttore dell'asse Nrf2/HO-1 che mitiga la cheratite fungina (FK) riducendo l'espressione delle citochine pro-infiammatorie e preservando l'architettura corneale. In linea con i recenti studi che mostrano una robusta attivazione di Nrf2 da parte di composti di ditiolane nei disturbiossidativi 15, LA ha prodotto un aumento di cinque volte nei trascritti di HO-1 e ha dimezzato la secrezione di IL-...
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Gli autori dichiarano che non ci sono conflitti di interesse relativi a quest'opera. Nessun finanziamento esterno o relazioni commerciali ha influenzato la progettazione, l'esecuzione o l'interpretazione dello studio.
Questa ricerca è stata sostenuta da finanziamenti interni del Dipartimento di Oftalmologia del Jinan 2nd People's Hospital. Gli autori ringrazionano con gratitudine l'assistenza tecnica fornita dal personale di laboratorio per la manutenzione delle colture cellulari e le procedure dei modelli animali. Un ringraziamento speciale al Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali Istituzionali per la revisione e l'approvazione del protocollo.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Anti-HO-1 | Tecnologia di segnalazione cellulare, Danvers, MA, USA | #8803 | |
| Anti-β-actin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A5441 | |
| Anti-lamina B1 | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab16048 | |
| Anti-Nrf2 | Abcam, Cambridge, MA, USA | AB62352 | |
| Aspergillus fumigatus | 204305 ATCC | N/A | |
| Kit per il saggio Bradford | Laboratori Bio-Rad | 5000006 | |
| Mouse C57BL/6 | Laboratori Charles River | N/A | |
| Kit di conteggio delle celle-8 (CCK-8) | Laboratori Dojindo, Kumamoto, Giappone | 343-07623 | |
| DMEM/F-12 medio | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Reagente ECL | Thermo Fisher Scientific | 32106 | |
| Siero bovino fetale | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Primer avanti GAPDH | Sintesi personalizzata | Consuetudine | |
| GlutaMAX | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Kit di trascrizione inversa cDNA ad alta capacità | Biosistemi applicati, Thermo Fisher Scientific | 4368814 | |
| Primer anteriore HO-1 | Sintesi personalizzata | Consuetudine | |
| Primer inverso HO-1 | Sintesi personalizzata | Consuetudine | |
| IgG anti-topo coniugata con HRP | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab205718 | |
| IgG anti-coniglio coniugata HRP | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab205719 | |
| Cellule epiteliali corneali umane (HCEC) | ATCC, Manassas, VA, USA | CRL-11135 | |
| IL-1 e beta; ELISA Kit | R& D Systems, Minneapolis, MN, USA | DY201 | |
| Acido lipoico (LA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T1395 | |
| ML385 (inibitore di Nrf2) | MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA | HY-100523 | |
| Spettrofotometro NanoDrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Reagenti di estrazione nucleare e citoplasmatica NE-PER | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| Innesco avanti Nrf2 | Sintesi personalizzata | Consuetudine | |
| Innesco inverso Nrf2 | Sintesi personalizzata | Consuetudine | |
| PBS con 0,05% Tween-80 | Preparazione personalizzata | Consuetudine | |
| Penicillina-streptomicina | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Biosistemi applicati, Thermo Fisher Scientific | A25741 | |
| Sistema PCR in tempo reale QuantStudio 5 | Thermo Fisher Scientific | A28140 | |
| Buffer RIPA | Preparazione personalizzata | Consuetudine | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germania | 74104 | |
| Agar di destrosio Sabouraud | Preparazione personalizzata | Consuetudine | |
| Biomicroscopio a lampada a fessura | Equipaggiamento personalizzato | N/A | |
| SnPPIX (inibitore di HO-1) | Frontier Scientific, Logan, UT, USA | F6140 | |
| Lettore di micropiastre multimodalità Synergy HTX | BioTek Instruments, Winooski, VT, USA | SYNHXTTR | |
| TBS-T (0,1% Tween-20) | Preparazione personalizzata | Consuetudine | |
| TissueLyser LT | Qiagen | 69980 | |
| TNF-α ELISA Kit | R& D Systems, Minneapolis, MN, USA | DY210 |
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