Rilevamento di contaminazioni e disadattamenti interindividuali nei dati di sequenziamento di nuova generazione multiomics

Sommario

Questo protocollo descrive l'implementazione di un quadro di controllo qualità per rilevare contaminazioni e disallineamenti interindividuali nei dati di sequenziamento di nuova generazione, verificando l'identità genetica delle coppie di campioni all'interno degli individui.

Abstract

L'elaborazione ad alta produttività dei biocampioni dei pazienti tramite sequenziamento di nuova generazione e il confronto dei dati molecolari con quelli clinici a livello di paziente e campione richiedono un tracciamento preciso e l'abbinamento degli identificatori del campione lungo tutta la catena di custodia del biocampione e sono fondamentali per consentire un'interpretazione robusta dei risultati degli studi sui biomarcatori. Oltre a tracciare i singoli passaggi nei flussi di lavoro di elaborazione dei campioni e dei dati, le soluzioni bioinformatiche possono essere utilizzate per confermare che i campioni provengono dallo stesso paziente. Qui viene mostrato l'uso di un flusso di lavoro bioinformatico per identificare campioni abbinati provenienti dallo stesso individuo. Il flusso di lavoro di analisi è adatto per qualsiasi coppia di dataset NGS da confrontare e verificare per l'origine del campione del paziente. Un algoritmo di punteggio basato su confronti genomici di campioni permette all'utente di determinare se due campioni provengono dallo stesso individuo. In particolare, polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) all'interno di blocchi di disequilibrio di collegamento selezionati vengono utilizzati per identificare e confrontare campioni. Sono state identificate combinazioni di soglia per la selezione permissiva e rigorosa di campioni abbinati e non corrispondenti. L'utilità di questo protocollo è stata dimostrata attraverso la sua applicazione al controllo qualità e alla validazione di tessuti tumorali clinici e campioni di sangue, comprendendo molteplici modalità omiche provenienti da oltre 2.000 pazienti.

Introduzione

La raccolta e l'analisi su larga scala di campioni clinici richiedono il tracciamento esatto dei campioni lungo la loro catena di custodia, poiché il corretto abbinamento dei dati molecolari provenienti dalla stessa o di diverse modalità e dati clinici a livello di paziente e campione è essenziale per un'interpretazione accurata e un processo decisionale informato. Nonostante i rigorosi sforzi per semplificare i protocolli di elaborazione del campione secondo una buona pratica clinica, lo scambio o l'etichettatura errata del campione possono avvenire in varie fasi, dalla biopsia/estrazione del campione alle fasi di preparazione e lavorazione, fino alla fase di analisi dei dati (Figura 1). Con l'aumento del numero di campioni e delle fasi di lavorazione del campione, aumenta la probabilità di scambi di campioni e contaminazione incrociata. Ciò può portare all'analisi di dati con relazioni errate campione-paziente, influenzando analisi a valle e conclusioni, ed è quindi un aspetto importante da considerare nella ricerca genomica clinica. Negli studi clinici, l'identificazione errata dei campioni può influire fortemente sui risultati complessivi, specialmente per studi con dimensioni di campione^{ridotte 1}. La contaminazione tra individui può portare a una perdita di energia per l'identificazione delle differenze e a risultati falsi positivi confrontando più campioni dello stesso paziente. Gli scambi di campioni influenzano il potere di rilevamento delle associazioni genetiche e possono portare a sottostimare l'ereditabilità di tratti complessi nell'analisi di associazioni genomiche^{a livello genomico 2}.

La ricerca sul cancro è uno degli ambiti in cui vengono effettuate analisi genomiche e trascrittomiche su larga^scala, monitorando in particolare l'eterogeneità genomica e fenotipica inter- e intrapaziente. Un aspetto della ricerca sul cancro è che i campioni dello stesso paziente possono portare mutazioni diverse e alterazioni del numero di copie e quindi presentare frequenze alleli varianti^{indipendenti 4}. Soprattutto nell'interpretazione di dati provenienti da più tipi omici, la corretta integrazione di dataset multimodali degli stessi individui è importante e quindi richiede il monitoraggio della contaminazione^{inter-individuale} 5,6,7,8. Studi su dataset del programma Cancer Genome Atlas (TCGA) e del Lung Genomic Research Consortium (LGRC) hanno identificato tassi di errata identificazione del campione media del 3% e fino a ~20% in alcuni studi 2,9,10,11. Questi esempi mostrano l'importanza di monitorare l'avvento di scambi di campioni e contaminazione^incrociata. Oltre al monitoraggio di routine e al controllo qualità in ogni fase del processo, un'analisi comparativa dei risultati del sequenziamento funge da controllo finale di qualità. Questo garantisce un corrispondenza accurata dei campioni prima di passare all'analisi e all'interpretazione dei dati.

Sono stati sviluppati diversi approcci bioinformatici per identificare se i campioni provengono dallo stesso^individuo 1,4,13,14,15,16. Gli approcci iniziali sfruttavano brevi ripetizioni in tandem per verificare l'identità del^{campione 17}. I dati di sequenziamento di nuova generazione a livello di RNA e DNA ora permettono il confronto tra coppie di campioni basandosi sui polimorfismi a singolo^{nucleotide 18}. Differiscono per la loro applicabilità a diverse modalità di sequenziamento e dataset, ad esempio per il sequenziamento^{RNA 19} o per dati di sequenziamento dell'intero^{esoma 5}, la loro implementazione, ad esempio il controllo tra le corsie^{di sequenziamento 20}, e la facilità d'uso. Sebbene campioni dello stesso individuo possano essere identificati basandosi su 20–45 polimorfismi a singolo nucleotide, gli approcci di sequenziamento a copertura bassa o media tipicamente utilizzati nella ricerca sul cancro richiedono l'integrazione di un gran numero di^{SNP 1}.

Qui vengono descritte l'implementazione e gli aggiustamenti di uno di questi approccio, utilizzando blocchi di squilibrio di collegamento degli SNP¹⁵, utilizzati per il controllo qualità dei campioni abbinati. È stato dimostrato che l'approccio ha un basso tasso di false flag e di false match, e il flusso di lavoro consente il confronto tra modalità, ad esempio tra campioni di sequenziamento dell'intero esoma e RNA-sequencing, oltre che per l'uso con diversi formati di dati. Per l'applicabilità su larga scala del metodo tra i dataset nei campioni di studi clinici, la pipeline bioinformatica è stata implementata nel common workflow language (CWL)^21,22. Grazie alla sua leggibilità e alla sintassi simile a quella di YAML, gli scienziati con poca esperienza di programmazione possono facilmente interpretare la struttura generale del flusso di lavoro e dei risultati dell'analisi. Un'altra caratteristica chiave del CWL è la sua funzionalità scatter/raccolta, che consente la parallelizzazione dei processi per sfruttare appieno le risorse computazionali allocate. Gli utenti possono specificare le condizioni in cui vengono eseguiti determinati passaggi, aumentando così la flessibilità delle analisi risultanti. Il CWL può essere integrato con altri componenti di un sistema completo di gestione dei flussi di lavoro, come l'archiviazione di database, un'interfaccia grafica utente e un dispatcher di lavoro, formando una potente piattaforma per creare, eseguire e mantenere un insieme riproducibile di analisi scientifiche. Pertanto, questa implementazione consente un accesso facilitato al flusso di lavoro e l'elaborazione ad alta velocità dei dataset nel contesto di sistemi di gestione dei flussi di lavoro definiti.

Inoltre, sono stati indagati gli effetti della soglia dei parametri di selezione di sintonia tra campioni abbinati e non abbinati, e sono state determinate soglie per la selezione permissiva e rigorosa dei casi non corrispondenti. Sono stati messi in mostra gli effetti della modifica di questi parametri sulla selezione delle coppie di campioni e sulla loro applicabilità all'interno e tra le diverse modalità omiciche. Una regolazione efficace di questi parametri permetterà agli utenti di regolare la stringenza delle loro interpretazioni. Il flusso di lavoro è stato applicato a un insieme di set di dati clinici su larga scala con diverse migliaia di campioni.

Protocollo

Dichiarazione etica: Questa analisi della contaminazione tra individui è stata effettuata retrospettivamente utilizzando dati a livello di singolo paziente provenienti da studi clinici di fase I e II completati, in conformità con il processo responsabile di riutilizzo dei dati di Roche e in conformità con il modulo master di consenso informato per ciascun studio. Le approvazioni del Comitato Etico/Comitato di Revisione Istituzionale sono state ottenute per ogni studio prima della sua conduzione. I partecipanti hanno dato e firmato il consenso informato per partecipare a questi studi.

Flusso di lavoro in bioinformatica
NOTA: L'implementazione del flusso di lavoro bioinformatica parte da file grezzi fastq derivati da dati di sequenziamento di nuova generazione, ad esempio sequenziamento del genoma completo, dell'esoma intero o del trascritoma. I singoli passaggi descritti qui sono integrati nel flusso di lavoro CWL.

1. Materiali di riferimento richiesti

1. Per il flusso di lavoro della bioinformatica, fornire quanto segue:
   1. Genoma di riferimento umano (GRCh38) in . Formato fasta .
   2. File di indicizzazione corrispondente come .fasta.fai.
   3. Dizionario corrispondente in formato .dict .
   4. Una mappa aplotipica che corrisponde alle regioni genomiche di interesse per SNP e blocchi di squilibrio di collegamento (ad esempio, Picard build_fingerprint_maps, SCR_006525).
2. Assicurati che l'intestazione della mappa dell'aplotipo corrisponda al genoma di riferimento.

2. Allineamento al genoma di riferimento, ordinamento e indicizzazione

1. Esegui il flusso di lavoro CWL per fornire gli output dei seguenti passaggi descritti di seguito (elenco degli strumenti nella Tabella dei Materiali) (Figura 2).
2. Avvia il flusso di lavoro CWL fornendo una directory di file fastq accoppiati o file bam allineati.
3. Fornire il pattern, ad esempio R1/R2, come pattern di espressione regolare in input nel comando CWL.
4. Inoltre, fornisci la posizione per l'esecuzione del flusso di lavoro, il riferimento genomico e i file di mappatura dell'aplotipo.
   NOTA: Per un confronto all-to-all, si utilizza la directory di input completa. Se si deve confrontare un sottoinsieme di file, fornire un file separato da virgole contenente i nomi dei file per il confronto. L'opzione avanzata consente la selezione della memoria ad accesso casuale e del numero di unità di elaborazione centrali per eseguire il processo.
5. Mappare i file fastq al genoma di riferimento umano usando un algoritmo di mappatura.
   NOTA: A seconda della modalità di sequenziamento, BWA-MEM viene utilizzato per i risultati del sequenziamento del DNA²³, mentre il mapper consapevole dello splice-aware STAR è utilizzato per i risultati del sequenziamento^{RNA 24}. Di seguito è fornito un codice esemplare per l'allineamento STAR:
   STAR \
   --readFilesCommand zcat \
   --runThreadN 8 \
   --outSAMmapqUnique 60 \
   --outSAMattributes Tutti \
   --outReadsUnmapped Fastx \
   --outTmpDir /tmp/STARtmp/ \
   --runDirPerm All_RWX \
   --outSAMtype BAM Non smistata \
   --outFileNamePrefisso /FILENAME_ \
   --outSAMattrRGline ID:FILEID. L001 SM:CAMPIONE \
   --genomeDir /REF/GENOME/DIR \
   --readFilesIn /path/to/FILENAME. R1.fastq.gz /path/to/FILENAME. R2.fastq.gz
6. Ordina i file di matrice di allineamento binario (BAM) allineati risultanti per coordinate di lettura usando SAMtools sort (samtools sort -o FILENAME_OUT.bam FILENAME_IN.bam).
7. Indicizza i file BAM ordinati usando l'indice SAMtools (samtools index FILENAME_OUT.bam).
8. Segna e rimuovi i duplicati usando Picard MarkDuplicates.
9. Riindicizza i file BAM e include i gruppi di lettura (RG) utilizzando SAMtools.
   NOTA: I file BAM devono avere tag RG affinché il flusso di lavoro possa funzionare.

3. Estrazione delle impronte digitali

1. Usa i file BAM ordinati e indicizzati per identificare le impronte digitali SNP utilizzando Picard ExtractFingerprints.
2. Utilizzare la memoria intermedia dei file risultanti in formato di chiamata variante (VCF) esclusivamente per il confronto tra campioni.

4. Calcolo dei punteggi di somiglianza

1. Usa Picard CrossCheckFingerprints per calcolare i punteggi logaritarimi del rapporto di probabilità (LOD) di somiglianza basati sui blocchi di squilibrio di collegamento, che sono forniti in un formato di file crosscheck_metrics come crosscheck_metrics.txt.
   NOTA: L'implementazione del flusso di lavoro consente un confronto incrociato di tutte le possibili combinazioni di coppie di campioni o un confronto selezionato tra campioni da una lista predefinita.
2. Elimina i file VCF intermedi.
3. Il file crosscheck_metrics fornisce quattro confronti per ogni coppia di campioni testati. L'interpretazione dei punteggi LOD è la seguente:
   Punteggio LOD > 0: i campioni probabilmente provengono dallo stesso individuo (corrispondenza campionaria)
   Punteggio LOD ≤ 0: i campioni probabilmente provengono da individui diversi
4. Valida il valore di taglio per le corrispondenze campionarie visualizzando la distribuzione del punteggio LOD come un istogramma, ad esempio in R o Python (Figura 3).
5. Si suggerisce un team collaborativo con competenze esperte in bioinformatica per determinare se le prove siano sufficienti per un'identificazione inequivocabile delle identità dei campioni e un possibile aggiustamento delle soglie utilizzate, ad esempio includendo tutti e tre i punteggi LOD o confrontando la distribuzione dei punteggi LOD di campioni noti per derivare da individui diversi.
   NOTA: I miscor-up del campione possono portare a più corrispondenze impreviste (punteggio LOD < 0 per campioni dello stesso donatore) e discorrispondenze (punteggio LOD > 0 per campioni provenienti da donatori diversi). Interpretazioni complesse richiedono uno scambio stretto tra il team trasversale e l'esperto di bioinformatica.

5. Disponibilità del codice

Il flusso di lavoro computazionale sarà reso disponibile su Github: https://github.com/Roche/sample-matching-workflow.

Risultati

Implementazione del flusso di lavoro CWL
Un flusso di lavoro per l'identificazione delle corrispondenze dei campioni, basato su un approccio precedentemente consolidato che utilizza blocchi di squilibrio di collegamento di polimorfismi a singolo nucleotide per l'identificazione degli scambi di campioni, è stato^{implementato 15}. Gli autori hanno mostrato tassi di classificazione di 0% FMR e 0,01% FFR per questo metodo. Un confronto con altri approcci ha mostrato prestazioni simili a NGSCheckmate a copertura alta e intermedia e prestazioni migliorate rispetto a NGSCheckmate a bassa copertura e per una minima sovrapposizione genomica regionale. Risultati inconcludenti sono stati ottenuti confrontando con Conpair e BAMixChecker 13,15,25. Qui, il flusso di lavoro è stato implementato in CWL, sono state investigate e ottimizzate le soglie LOD, e applicato per il confronto tra coppie di sequenziamento RNA e DNA o tra modalità all'interno di campioni estratti dal tessuto e tra campioni di tessuto e sangue periferico (Figura 3, Tabella 1). L'implementazione del flusso di lavoro permetteva un confronto incrociato di tutte le possibili combinazioni di coppie di campioni o un confronto selezionato tra campioni da una lista predefinita.

L'input del flusso di lavoro utilizza un insieme selezionato di aplotipi. Questi vengono utilizzati per calcolare polimorfismi a singolo nucleotide nei blocchi di disequilibrio di collegamento. Il calcolo dei punteggi log-odds ratio (LOD) di questi blocchi di SNP tra coppie di campioni permette di differenziare tra campioni abbinati e non corrispondenti. In precedenza, i punteggi LOD nell'intervallo LOD < -5 e LOD > 5 hanno dimostrato di classificare correttamente coppie di campioni^{corrispondenti 15}. Punteggi LOD aggiuntivi (LOD_SCORE_TUMOR_NORMAL, LOD_SCORE_NORMAL_TUMOR) vengono calcolati tenendo conto di una possibile perdita di eterozigotità nel campione tumorale per uno dei due campioni (regioni eterozigoti in un campione rilevate come omozigoti nell'altro).

Influenza dei parametri di input e delle soglie sui tassi di corrispondenza/disadattamento
La valutazione di questo flusso di lavoro ha evidenziato tre aspetti critici che ne influenzano le prestazioni e la precisione. Innanzitutto, la selezione delle regioni genomiche coperte dalla mappa dell'aplotipo si è rivelata un passo cruciale. La scelta di queste regioni influenza direttamente il potere discriminatorio del processo di abbinamento. In secondo luogo, la combinazione delle strategie di allineamento delle letture e delle mappe haplotype specifiche utilizzate per l'estrazione delle impronte digitali ha influenzato significativamente i risultati finali dell'analisi. Le variazioni in questi passaggi di elaborazione a monte possono introdurre sottili bias che si propagano ai punteggi corrispondenti (Figura 4A–B). In terzo luogo, una valutazione attenta e la selezione delle soglie per determinare una corrispondenza campionaria erano essenziali. I valori di soglia ottimali possono variare notevolmente a seconda della specifica modalità dei dati (ad esempio, sequenziamento dell'intero esoma vs. sequenziamento dell'intero trascrittoma) e delle regioni genomiche valutate. Soglie diverse possono regolare la rigore dell'approccio (alto tasso di falsi positivi vs. alto tasso di falsi negativi) (Figura 4C). Per affrontare questo problema su un ampio gruppo di campioni clinici, il metodo è stato adattato per definire sia combinazioni permissive che rigorose di punteggi di abbinamento campionistico basate sulla combinazione dei punteggi LOD utilizzati e del comparatore. Un primo approccio di soglia (I) è stato raggiunto considerando qualsiasi valore positivo tra i tre punteggi LOD (LOD_SCORE, LOD_SCORE_TUMOR_NORMAL, LOD_SCORE_NORMAL_TUMOR). Includendo informazioni sui punteggi TUMOR_NORMAL e NORMAL_TUMOR, si possono mitigare gli effetti della perdita di eterozigosità, che si verifica a causa delle alterazioni del numero di copie dei campioni di cancro. Al contrario, è stata implementata una soglia più rigida per le discorrispondenze (II) applicando due criteri di filtraggio alternativi, pensati per ridurre i falsi positivi: (a) categorizzazione solo come corrispondenza, se LOD_SCORE è positiva, b) categorizzazione come corrispondenza, se, per un dato campione, LOD_SCORE è superiore al punteggio massimo dell'altro LOD_SCOREs a coppie di quel campione tra campioni che non ci si aspetta corrisponda (basandosi sul paziente di origine documentato), Anche se la LOD_SCORE stessa è negativa.

In questa domanda, per generare una soglia permissiva, qualsiasi coppia di campioni designata come corrispondenza da uno qualsiasi dei criteri sopra indicati (I, IIa, IIb) veniva considerata corrispondente. Questo forniva alta fiducia in tutte le discorrispondenze identificate, a scapito di alcune potenziali vere discorrispondenze designate come corrispondenze (cioè falsi negativi). Un confronto tra la soglia permissiva e le soglie più rigide ha mostrato uno spostamento nella percentuale di coppie classificate come disadattate. La differenza tra gli approcci, in tutti gli studi analizzati, variava dal 3,9% (uno dei tre punteggi LOD positivo (I)), 13,3% (LOD_SCORE deve essere positivo (IIa)), 9,2% (LOD_SCORE rispetto alle coppie non corrispondenti di un campione (IIb)) e 3,6% (tenendo conto se uno dei due sopra per designare una corrispondenza) (Figura 4C).

Influenza della copertura delle regioni genomiche
La differenza tra i punteggi LOD negativi e positivi per campioni abbinati e non corrispondenti è più alta quando si copre un'ampia gamma di regioni genomiche (sequenziamento del genoma completo (WGS) o confronto di campioni WGS con altre modalità), facilitando così la selezione della soglia (Figura 5A). Per il sequenziamento dell'intero esoma e il confronto con RNA, i punteggi LOD si avvicinano a zero con approcci di soglia che influenzano i risultati, evidenziando l'importanza di valutare la stringenza delle soglie per modalità con copertura genomica inferiore. Una distribuzione dei risultati da campioni accoppiati noti con punteggi LOD positivi è mostrata nella Figura 5B. Javed et al. (2020) hanno dimostrato che anche solo lo 0,02% di sovrapposizione genomica è sufficiente per distinguere tra campioni abbinati e non abbinati quando si utilizzano blocchi di disequilibrio^{di collegamento 15}.

Validazione
L'approccio è stato validato su ulteriori dataset di sequenziamento dell'intero esoma (WES) e RNA-sequencing per tumori al seno, cancro colorettale e polmonare, per i quali si prevedeva che un insieme noto di campioni provenisse dagli stessi individui (Figura 6A). Le coppie di campioni dello stesso individuo hanno mostrato un tasso di corrispondenza del 100% (Figura 6B), mentre confronti aggiuntivi con altri campioni noti per provenire da individui diversi hanno mostrato un tasso di discorrispondenza del 100%. Non sono stati osservati né falsi positivi né falsi negativi in nessuno di questi dataset.

In sintesi, implementare il flusso di lavoro di controllo qualità facilita confronti interindividuali di coppie di campioni di sequenziamento di nuova generazione, fornendo un approccio standardizzato e riproducibile. Le soglie risultanti per i punteggi LOD producono bassi tassi di falsi positivi e falsi negativi per campioni con ampia sovrapposizione regionale genomica, e può essere applicata un'ottimizzazione aggiuntiva delle soglie per campioni con bassa profondità di sequenziamento o per i quali è presente poca sovrapposizione genomica.

Figura 1: Rappresentazione schematica dell'occorrenza di scambi di campioni e etichettatura errata. (A) Scambio di campioni di un campione ciascuno tra due individui. (B) Rappresentazione dei passaggi di elaborazione del campione dall'estrazione della biopsia all'analisi dei dati di sequenziamento. Creato in BioRender. Voith von Voithenberg, L. (2026) https://BioRender.com/xhbp178. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Rappresentazione dell'interfaccia utente per file di input e parametri necessari per eseguire il flusso di lavoro di controllo qualità per l'abbinamento dei campioni in CWL. Interfaccia grafica utente per l'inserimento di file e parametri. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Risultati ottenuti dal flusso di lavoro di abbinamento campione. Distribuzione dei punteggi LOD per un insieme esemplare di campioni di sequenziamento del DNA (sequenziamento del genoma completo e dell'esoma completo) (a sinistra), per un confronto tra sequenziamento del DNA e sequenziamento dell'RNA (al centro) per mostrare quanto pochissimi campioni disadattati si comportino rispetto alla distribuzione dei campioni abbinati, e per una coorte esemplare più ampia di coppie di sequenziamento dell'RNA (a destra) con dati noti provenire da individui diversi (discorrispondenze, rosso chiaro) e dello stesso individuo (fiammiferi, verde chiaro). Abbreviazioni; LOD = log odds ratio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Differenze esemplari nel punteggio LOD osservate. (A) quando si combinano diversi approcci di allineamento di sequenza e mappe di aplotipi per un insieme di campioni noti non corrispondenti e corrispondenti, e (B) per la valutazione tramite integrazione di informazioni tumorali e normali. (C) Occorrenza del numero di corrispondenze e disadattamenti di campione definiti da approcci di soglia di diversa stringenza. Abbreviazioni; LOD = log odds ratio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Distribuzione esemplare dei punteggi LOD per il confronto tra diverse modalità di sequenziamento di nuova generazione. (A) Distribuzione dei punteggi LOD di campioni attesi non corrispondenti e corrispondenti tra sequenziamento del DNA dal sangue e tessuto tumorale e sequenziamento dell'RNA dal tessuto tumorale. (B) Distribuzione dei punteggi LOD dei campioni abbinati per combinazioni di diverse modalità. Abbreviazioni; LOD = log odds ratio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Distribuzione dei punteggi LOD per l'analisi di un dataset di sequenziamento WES e RNA per il cancro al seno. Il dataset deidentificato sul tumore al seno è stato ottenuto da Caris Life Sciences ed è derivato da una profilazione tumorale completa. (A) Occorrenza logaritmica dei punteggi LOD per confronti tra campioni WES tumorali (a sinistra) e tra campioni di sequenziamento RNA (a destra). (B) distribuzioni dei punteggi LOD per coppie attese di campioni dagli stessi individui (fila superiore WES, fila inferiore sequenziata con RNA). Abbreviazioni; LOD = log odds ratio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

LEFT_GROUP_VALUE	RIGHT_GROUP_VALUE	RISULTATO	LOD_SCORE	LOD_SCORE_ TUMOR_NORMAL	LOD_SCORE_ NORMAL_TUMOR
Esempio 1	Esempio 1	EXPECTED_MATCH	38.119266	29.649485	29.649485
Esempio 1	Esempio 2	EXPECTED_MISMATCH	-2.552644	-4.57422	5.283698
Esempio 2	Esempio 1	EXPECTED_MISMATCH	-2.552644	5.283698	-4.57422
Esempio 2	Esempio 2	EXPECTED_MATCH	12.328737	8.796457	8.796457

Tabella 1: Risultati esemplari ottenuti dall'esecuzione delle impronte digitali Crosscheck. La tabella mostra risultati esemplari di una coppia di campioni confrontati tramite l'approccio di abbinamento campione.

Discussione

Sono disponibili vari metodi per identificare le corrispondenze^campionarie 1,4,13,14,15,16. Qui, l'implementazione di un approccio utilizzando blocchi di squilibrio di collegamento SNP applicabili su più modalità omic, con bassi tassi di falsi positivi e falsi negativi, è^{stata descritta 15}. L'implementazione è stata effettuata in CWL per facilitare l'elaborazione ad alta velocità tra dataset all'interno di un ambiente di workflow standardizzato. La valutazione del flusso di lavoro ha identificato tre aspetti chiave da considerare nell'applicazione dell'approccio. Un passaggio chiave nel processo è la selezione delle regioni genomiche coperte dalla mappa dell'aplotipo. Inoltre, combinare l'allineamento delle letture con l'estrazione delle impronte digitali utilizzando diverse mappe di aplotipi può influenzare i risultati dell'analisi. Inoltre, la valutazione e la selezione attente delle soglie, che possono dipendere dalla modalità dei dati e dalle regioni coperte, sono essenziali e possono portare a una chiamata di abbinamento più o meno permissiva.

Per la valutazione di ampi set di campioni clinici, il metodo è stato adattato per definire combinazioni di soglie per punteggi di abbinamento campionistico permissivi e rigorosi. Il metodo è stato modificato per includere un approccio di soglia permissivo considerando un punteggio combinato che comprenda uno qualsiasi dei punteggi LOD (LOD_SCORE, LOD_SCORE_TUMOR_NORMAL, LOD_SCORE_NORMAL_TUMOR) oppure due criteri alternativi di filtraggio, risultando in una selezione più rigorosa dei campioni. L'applicabilità dell'approccio è limitata ai campioni per i quali sono disponibili informazioni SNP su una gamma di regioni genomiche, ad esempio dati di sequenziamento di nuova generazione. Inoltre, sono necessarie almeno coppie di campioni dello stesso individuo per l'analisi comparativa e il matching dei campioni. Ulteriori informazioni cliniche, come lo stato della mutazione ottenuto tramite metodi mirati o metadati del paziente, come il sesso, possono essere utilizzate per fornire ulteriori prove di corrispondenza tra dati molecolari ad alta dimensione e dati clinici a livello di paziente.

L'implementazione di questo approccio in un ambiente di gestione del flusso di lavoro, con la possibilità di archiviazione parallela dei dati, consente un'analisi di controllo qualità ad alto throughput dei campioni per la contaminazione tra individui. Così, aumenta l'accessibilità e la riproducibilità dell'approccio tra dataset e campioni. L'adattabilità dei criteri di soglia in questo approccio consente l'elaborazione e l'analisi di campioni di cancro con carico mutazionale tumorale basso o elevato e alterazioni del numero di copie che possono portare alla perdita di eterozigosità e quindi influenzare la probabilità del genotipo.

Il metodo può trovare ampia applicabilità su qualsiasi tipo di progetto che coinvolga dati di sequenziamento di nuova generazione provenienti da individui umani e per il quale è disponibile più di un singolo campione per persona. Questo può variare da approcci personalizzati per singoli pazienti a grandi studi clinici che raccolgono dati molecolari ad alta dimensione per diverse aree patologiche. Può essere combinato con flussi di lavoro di controllo qualità, indagine sulla contaminazione tra specie e approcci per collegare dataset molecolari ad alta dimensione con informazioni cliniche da integrare in qualsiasi pipeline di controllo qualità per dati di sequenziamento di nuova generazione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
FastQC	v0.11.9	SCR_014583
MultiQC	v1.8	SCR_014982
BWA-MEM	v0.7.17	SCR_010910
STAR	v2.7.9a	SCR_004463
SAMtools	V1.12, v1.19.2	SCR_005227
-  faidx
-  Ordina
-  Indice
- addreplacerg
Picard	V2.25.5, v3.0.0	SCR_006525
- CreateSequenceDictionary
- MarkDuplicates
- build_fingerprint_maps
- EstrattoImpronte
- Impronte digitali CrosscheckT
CWL	v1.2	SCR_015528
R	R v4.3.1	SCR_001905
DPLYR v1.1.4