Generazione di organoidi alveolari A549/MRC-5 incorporati in collagene 3D utilizzando un bioreattore meccanico a stiramento cellulare

Sommario

Questo protocollo delinea la generazione di organoidi da cellule epiteliali alveolari A549 e fibroblasti polmonari MRC-5 su un impalcatura idrogel a matrice extracellulare, seguita dall'inserimento in gel di collagene 3D e dall'esposizione a sforzi meccanici tramite un bioreattore di allungamento cellulare per indagare la meccanobiologia alveolare.

Abstract

Sebbene la dinamica respiratoria e lo sforzo meccanico abbiano ruoli fondamentali nella biologia alveolare, i loro contributi alla patogenesi delle malattie respiratorie sono spesso trascurati. Per colmare questa lacuna, abbiamo sviluppato un modello organoide in cui organoidi fibroteliali epiteliali alveolari sono sottoposti a una tensione meccanica controllata tramite un bioreattore a stretching cellulare. Questa piattaforma replica l'organizzazione spaziale e la complessità multicellulare del tessuto alveolare e consente di indagare come la comunicazione cellula-cellula e la meccanotrasduzione influenzino la struttura e la funzione tissutale in ambito sanitario e malattio. In questo protocollo, descriviamo metodi per generare e coltivare organoidi epiteliali-fibroblastici utilizzando linee cellulari epiteliali alveolari A549 e fibroblasti polmonari MRC-5 in un idrogel extracellulare a matrice della membrana basale. Gli organoidi vengono quindi isolati non enzimaticamente e inseriti in gel di collagene 3D in placche specializzate nel bioreattore. Descriviamo procedure per applicare lo sforzo equibiaxiale per imitare i modelli respiratori patologici osservati nelle esacerbazioni respiratorie. Infine, presentiamo un flusso di lavoro standard di caratterizzazione, che include immunocolorazione per marcatori specifici cellulari e immunoanalisi per profilare il rilascio dei mediatori immunitari. Insieme, queste analisi supportano la valutazione della struttura e funzione degli organoidi. Questo protocollo fornisce una piattaforma intuitiva, riproducibile e adattabile per lo studio della biologia alveolare sotto stress meccanico, con parametri facilmente modificabili per soddisfare diversi obiettivi sperimentali e far progredire la ricerca sui meccanismi delle malattie polmonari.

Introduzione

Gli alveoli sono i sacchi terminali del sistema respiratorio e fungono da principale sito di scambio gasso. Sono composti principalmente da cellule epiteliali alveolari di tipo I e II, responsabili dello scambio gasso, delle funzioni immunitarie e del mantenimento dell'integrità strutturale, e di fibroblasti all'interno delle pareti, che mantengono l'omeostasi della matrice^{extracellulare 1}. Queste e altre cellule residenti sono continuamente esposte a tensione ciclica di allungamento e taglio durante la^{respirazione 2}. Tali segnali meccanici vengono trasdotti in segnali biochimici che influenzano la struttura cellulare, la differenziazione e la comunicazione³.

Lo sforzo meccanico patologico è osservato nelle malattie polmonari come la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO). La BPCO è una condizione progressiva caratterizzata da distruzione parenchimante, infiammazione cronica e restringimento delle piccole vie^aeree. In questa malattia, la distruzione delle pareti alveolari, la perdita di elastina, la rimodellazione della matrice extracellulare (ECM) che porta alla fibrosi e l'infiammazione cronica compromettono collettivamente la capacità del polmone di resistere ai danni^{strutturali 5,6}. Questo provoca deformazioni alveolari eterogenee e anomale durante la respirazione, che si aggravano^{ulteriormente durante} le riacutizzazioni ^7,8.

Sebbene siano stati utilizzati diversi approcci in vitro per studiare la biologia alveolare, ciascuno presenta limitazioni notevoli. I sistemi di co-coltura 2D facilitano l'indagine delle interazioni cellula-cellula ma non riescono a catturare l'architettura tissutale o la dinamica della matrice extracellulare, riducendo la rilevanza fisiologica. Le culture 3D statiche preservano meglio l'organizzazione strutturale e le interazioni matriciali, ma non incorporano segnali meccanici dinamici presenti in vivo. Le piattaforme microfluidiche e organ-on-chip possono imitare il flusso dei fluidi e la tensione meccanica, fornendo un'elevata fedeltà fisiologica, ma spesso sono tecnicamente complesse, a basso rendimento e^{costose 9}. Al contrario, il modello organoide 3D a deformazione meccanica presentato qui combina complessità strutturale, eterogeneità cellulare e stimolazione meccanica controllata, un aspetto spesso trascurato nei modelli esistenti, all'interno di una piattaforma riproducibile e scalabile che offre un equilibrio tra rilevanza fisiologica e accessibilità^{sperimentale 10,11}.

Per comprendere i complessi meccanismi che contribuiscono a malattie come la BPCO e scoprire bersagli terapeutici, sono stati stabiliti modelli di malattia. Nonostante la sua importanza, lo sforzo meccanico viene spesso trascurato nei modelli alveolari in vitro utilizzati per studiare i meccanismi e la patogenesi delle malattie polmonari come la BPCO. Per colmare questa lacuna, presentiamo un metodo per la coltivazione di organoidi fibroteliali epiteliali alveolari in una matrice basale, recuperandoli e incorporandoli in gel di collagene 3D, applicando la tensione meccanica ciclica utilizzando un bioreattore a stretching cellulare e valutando i principali risultati strutturali e funzionali. Questi modelli organoidi meccanici 3D catturano meglio le interazioni cellulari e il microambiente della nicchia alveolare umana, permettendo lo studio della diafonia epiteliale-mesenchimale¹².

Il bioreattore applica la deformazione equibiaxiale con parametri configurabili, permettendo fino al 30% di allungamento e frequenze fino a 5 Hz per modellare sia condizioni fisiologiche che patologiche. In questo studio, abbiamo generato modelli organoidi incorporati in idrogel di collagene-I sottoposti a uno sforzo del 18% a 0,4 Hz per 24 ore per simulare la respirazione patologica. Abbiamo stabilito un flusso di lavoro standardizzato di caratterizzazione che include immunocolorazione per marcatori cellulari specifici e immunosaggi per quantificare il rilascio del mediatore immunitario dopo lo sforzo meccanico. L'obiettivo di questo studio è fornire una piattaforma fisiologicamente rilevante, facile da usare e adattabile per indagare la biologia alveolare sotto stress meccanico.

Protocollo

Tutte le fasi richiedono tecniche asettiche, materiali sterili e reagenti, e vengono eseguite in un armadietto di biosicurezza per ridurre l'esposizione del personale a materiali biopericolosi e la contaminazione delle colture. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Coltura cellulare e creazione di stock cellulari

1. Prima della formazione dell'organoide, si sono coltivate le cellule A549 e MRC-5 su fiaschette plastiche trattate con coltura tissutale standard (T75^{cm 2}) fino a una confluenza di circa il 70%-80% utilizzando il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco, integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina, d'ora in cui denominato "DMEM completo".
2. Per entrambi A549 e MRC-5, seminare a 2 x 10⁴ cellule/cm², in un volume totale di 10 mL di DMEM completo. Coltivare cellule a 37 °C con il 5% di_CO2 in un ambiente umidificato fino a raggiungere una confluenza di circa il 70%-80%.
3. Sostituire il substrato di coltura ogni 48 ore per garantire condizioni ottimali di crescita.
4. Subcoltura aspirando tutto il materiale dalla fiaschetta una volta che è confluente al 70%-80%, lava una volta con soluzione fisiologica calda tamponata con fosfato (PBS), poi aggiungi 4 mL di tripsina-EDTA.
5. Incubare a 37 °C per 5 minuti e visualizzare le fiaschette con un microscopio a campo chiaro per garantire il completo distacco. Neutralizza aggiungendo 4 mL di DMEM completo.
6. Contare le cellule utilizzando la tecnica preferita, come il conteggio di esclusione del tripano blu.
7. Centrifuga la sospensione a celle a 200 x g per 5 minuti.
8. Aspirare il sovrandanante lasciando un pellet cellulare sul fondo del tubo conico. Risospendere la pellet cellulare in un volume appropriato di DMEM completo triturando delicatamente.
9. Per il congelamento, risospendere in un mezzo completo contenente il 10% di DMSO per ottenere un 1 x 10⁶ celle/mL. Per la formazione dell'organoide, risospendere per ottenere 1 x 10⁶ cellule/mL.

2. Stabilire e caratterizzare la maturazione di un modello organoide 3D di fibroblasti epiteliali alveolari

NOTA: La matrice del seminterrato deve essere scongelata sul ghiaccio durante la notte e mantenuta sul ghiaccio durante questi passaggi. Temperature più alte possono causare la solidificazione della matrice.

1. Prepara una miscela 2:3 di matrice di seminterrato e DMEM avanzato. Aggiungere 300 μL di questa soluzione a ciascun pozzo di una piastra a 24 pozzi, assicurando che il fondo di ogni pozzo sia rivestito in modo uniforme. Incubare la piastra a 37 °C in un incubatore umidificato per 1 ora per permettere alla matrice di solidificarsi.
2. Prepara una soluzione a matrice basale al 5% in DMEM completo, che sarà il mezzo di coltura per gli organoidi. Per ogni pozzo, si ottiene 1,2 mL di questa soluzione diluendo 60 μL di matrice basale in 1.140 μL di DMEM completo.
3. Durante il tempo in cui la miscela della matrice basale si sta solidificando, miscela 300.000 celle A549 con 30.000 celle MRC-5 in 200 μL della soluzione della matrice basale al 5% prodotta in DMEM completo descritta nello Passo 2.2.
4. Una volta che la miscela basale 2:3 si è solidificata, pipettare 200 μL della miscela A549/MRC-5 sulla matrice gelificata, quindi riportare la piastra a 24 pozzi a incubare a 37 °C, 5% di CO₂ per 21 giorni per consentire la crescita e la differenziazione degli organoidi alveolari.
5. Visualizza le colture al microscopio lucico per le successive 48 ore. Le cellule dovrebbero aggregarsi entro questo periodo di tempo.
6. Sostituire la matrice basale/soluzione DMEM al 5% ogni 48 ore con 200 μL di mezzo fresco al 5%. Per evitare di disturbare gli organoidi incorporati nell'idrogel, inclina delicatamente la lastra in modo che la vecchia soluzione si accumuli lungo la parete del pozzo prima dell'aspirazione.
7. Ai giorni 3, 9 e 21 di maturazione, si possono visualizzare gli organoidi con un ingrandimento obiettivo di 10 volte e scattano quattro immagini rappresentative o campi visivi di ciascun pozzo. Immagini rappresentative della morfologia organoide precoce ai giorni 3, 9 e 21 sono mostrate nella Figura 1.
8. Per ogni campo visivo, contare tutti gli organoidi con un diametro superiore a 50 μm. Utilizzando l'area nota del campo visivo, estrapolare il numero medio totale di organoidi per pozzo dal conteggio medio per campo, assumendo una superficie di 24 pozzi di 1,9 cm².
   NOTA: Queste analisi possono essere effettuate utilizzando software di analisi delle immagini come Fiji¹³.
9. Il diametro medio e l'area degli organoidi possono anche essere misurati per ottenere informazioni quantitative sulle caratteristiche di crescita degli organoidi in coltura.

3. Prelievo di organoidi alveolari fibroblastici epitelari 3D

NOTA: Tutti i passaggi per prelevare gli organoidi devono essere eseguiti sul ghiaccio.

1. Dopo 21 giorni di maturazione, aspirare il soprandanante e lavare delicatamente con circa 1-2 mL di PBS gelato.
2. Aggiungi 1-2 mL di soluzione fredda per la raccolta organoide e incuba la piastra a 2-8 °C per 30-90 minuti con una moderata agitazione.
   NOTA: Fermare l'incubazione quando si vedono gli organoidi galleggiare sul fondo del pozzo.
3. Monitorare la dissociazione usando microscopia a campo chiaro. La dissociazione è considerata completa una volta che la matrice basale sul fondo del pozzo non è più visibile e gli organoidi sono in sospensione. Un raschiatore cellulare può essere utilizzato per spostare delicatamente l'idrogel della matrice organoide-basamento per accelerare il processo.
4. Raccogli il contenuto di tutti i pozzi in un tubo conico da 50 mL su ghiaccio.
5. Centrifuga a 500 × g per 5 minuti a 2-8 °C. Aspirare il sovrandante, lavare il pellet organoide con 1-2 mL di PBS gelato, poi centrifugare di nuovo per ottenere un pellet. Aspira il PBS.

4. Stabilimento di organoidi alveolari-fibroblasti incorporati in collagene 3D e applicazione dello sforzo meccanico

NOTA: Utilizzare piastre circolari di schiuma con ancoraggi in schiuma compatibili con un bioreattore a stiramento cellulare. La piastra di coltura utilizzata in questo protocollo ha un'area di crescita di ~6,6^{cm 2}.

1. Prepara una soluzione funzionante di 2 mg/mL di gel collagene I. La soluzione dovrebbe contenere 1× PBS, 11,4 mM di NaOH e 2 mg/mL di collagene I, con il volume finale regolato con acqua sterile. Prepara 2 mL di questa soluzione di collagene I per ogni pozzetto della piastra circolare in schiuma a 6 pozzetti.
2. Aggiungi 1 mL della soluzione di collagene I da 2 mg/mL agli ancoraggi in schiuma ai margini della placca, assicurando una saturazione completa.
   NOTA: Gli ancoraggi in schiuma devono essere completamente saturi con la soluzione di collagene I per garantire una corretta adesione. Una saturazione incompleta può causare distacco del gel di collagene durante l'applicazione della tensione meccanica, portando a una riduzione dello sforzo effettivo rispetto al bersaglio previsto.
3. Risospendere il pellet organoide in 6 mL di 2 mg/mL di collagene di coda di ratto e pipettare 1 mL della sospensione al centro di una piastra circolare in schiuma a 6 pozzi, assicurandosi che la miscela di collagene infusa con organoidi si mescoli con il collagene iniziale senza organoidi aggiunto agli ancoraggi circolari in schiuma.
   NOTA: Evitare di generare bolle quando si aggiungono la sospensione organoide in ogni pozzo.
4. Polimerizzare il collagene-I per 1 ora lasciando le placche in un incubatore (37 °C, 5% CO_2). Dopo la polimerizzazione, il gel dovrebbe apparire torbido.
5. Aggiungi 2 mL di DMEM completo sopra organoidi A549/MRC5 incorporati in 3D e riporta la piastra nell'incubatrice per 24 ore.
6. Sostituisci il mezzo di coltura con DMEM + FBS all'1% e incuba durante la notte prima dell'esposizione alla tensione meccanica.

5. Configurazione del bioreattore a allungamento delle celle ed esposizione a deformazione meccanica

1. Inserire stazioni di carico in ogni pozzo della piastra di base. Questi contengono sei pilastri di carico di 25 mm di diametro, che permettono alla membrana flessibile delle piastre del Tissue Train di deformarsi intorno a loro ed esporre la coltura 3D a deformazione equibiaxiale.
2. Applica uno strato sottile di grasso al silicone sulla parte superiore dei pilastri di carico.
3. Posiziona guarnizioni rosse sul fondo di ogni piastra a 6 pozzi.
4. Inserire i piatti preparati nella piastra di base sopra i pali di carico.
5. Sposta questo apparato in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di_CO2 e collega i raccordi a scollegamento rapido alla piastra di base. Ripeti i passaggi da 5.1 a 5.6, ma omettendo le connessioni per creare un controllo non forzato.
   NOTA: Opzionalmente, si può applicare un tappo di sigillatura per tubi, che impedisce l'applicazione di pressione di vuoto sul fondo di un singolo pozzo BioFlex, permettendo la generazione di una coltura di controllo non deformata sulla stessa placca.
6. Copri con un foglio di Plexiglas e aggiungi ~5-10 libbre di peso per garantire una tenuta ermetica.
7. Accendi il compressore d'aria e apri la valvola di uscita dal compressore d'aria.
8. Accendi la pompa di pressione a vuoto e apri la valvola del serbatoio di pressione collegata all'uscita del serbatoio di vuoto. Assicurati che la pressione del vuoto sia intorno a 90 kPa.
9. Apri la valvola di ingresso dal compressore d'aria situato vicino al controllore del bioreattore. Regola la pressione in modo che non superi i 15 PSI alla porta di ventilazione.
10. Avvia il software di bordo e imposta i parametri di deformazione meccanica ciclica desiderati. Per questo studio, è stato utilizzato un regime di ampiezza di deformazione del 18% a 0,4 Hz per 24 ore. Per configurarlo, crea un nuovo regime, imposta l'allungamento minimo a 0%, il massimo allungamento al 18% e avvia il protocollo.
11. Osserva la piastra e la membrana per assicurarti che il movimento sia visibile durante tutta la sessione di sforzo. La membrana dovrebbe deformarsi intorno ai pali di carico.
12. Controlla periodicamente la trappola d'acqua per l'umidità e osserva lo schermo del computer per verificare la durata di lavoro, i progressi e la morfologia appropriata del regime di delineazione.
13. Scollegare l'assemblaggio della base al completamento del regime di ceppo e riportare le colture filtrate a incubare per 24 ore prima delle analisi di caratterizzazione a valle.
14. Spegni e smonta il sistema in ordine inverso di avviamento: chiudi o spegni la valvola di ingresso del compressore d'aria, poi la valvola del serbatoio di pressione, la pompa di depressione, la valvola di uscita del compressore d'aria e infine il compressore d'aria, in quest'ordine.
15. Raccogliere il soprantantante dopo 24 ore di incubazione dopo l'esposizione a stirpe meccanica. Conserva a -80 °C fino all'uso.

6. Caratterizzazione morfologica degli organoidi tramite immunofluorescenza

1. Lava il modello organoide-collagene per tre volte con PBS aggiungendo delicatamente 1 mL di PBS, incubando per 5 minuti a temperatura ambiente.
2. Aspira con cura il PBS e ripeti il lavaggio un totale di tre volte.
3. Fissare il modello incubando 2 mL di paraformaldeide al 4% per 1 ora a 4 °C.
4. Lava i modelli tre volte con PBS come descritto sopra.
5. Usa un bisturi per tagliare delicatamente le ancore circolari in schiuma nei pozzi flessibili con il gel di collagene attaccato e mettili in una piastra di Petri.
6. Permeabilizzare gli organoidi incubandoli con 2 mL di Triton X-100 allo 0,1% in PBS per 5 minuti a temperatura ambiente.
7. Lava i modelli tre volte con PBS.
8. Bloccare il legame non specifico incubando i modelli con 3 mL di albumina sirica bovina (BSA) al 5% in PBS per 1 ora a temperatura ambiente. Rimuovi la soluzione bloccante e procedi al passo successivo.
9. Incubare i modelli durante la notte a 4 °C con un cocktail di colorazione contenente occludens-1 di zonula anti-umana (ZO-1) coniugato con Alexa Fluor 594 a diluizione 1:100, falloidina coniugata con Alexa Fluor 488 a diluizione 1:1000 per la valutazione della F-actina, e la colorazione nucleare, DAPI, diluizione 1:4000. Il diluente è di 1 mL di BSA all'1% nel PBS. Fissa i bordi della piastra prima dell'incubazione a 4 °C.
10. Aspira la soluzione di cocktail per le macchie il giorno dopo e lava i modelli tre volte con PBS.
11. Immagini utilizzando un microscopio confocale e scatta Z-stack a 5 μm di organoidi rappresentativi con ingrandimento obiettivo di 40x.
12. Analizza l'intensità della fluorescenza utilizzando software di analisi delle immagini Fiji. Normalizzare l'intensità media della fluorescenza con l'area dell'organoide per garantire un confronto accurato tra diverse condizioni ambientali.

7. Caratterizzazione funzionale degli organoidi tramite ELISA e test di citotossicità della lattato deidrogenasi (LDH)

1. Scongelare i soprantatori sul ghiaccio e valutare la secrezione di interleuchina-6 (IL-6) e interleuchina-8 (IL-8) utilizzando kit ELISA disponibili in commercio secondo il protocollo del produttore.
2. Valutare il rilascio di LDH, un marcatore di citotossicità, utilizzando un saggio di assorbimento LDH disponibile in commercio.
3. Genera una curva standard usando proteina LDH ricombinante a concentrazioni di metà logaritmic da 0,5 μg a 0,5 ng. Interpola le concentrazioni di LDH da ciascun campione usando la curva standard.

8. Opzionale: Isolamento di campioni per analisi di RNA o proteine

1. Invece di aggiungere il 4% di paraformaldeide per la colorazione immunofluorescenza, si aggiunge un tampone RLT preparato contenente β-mercaptoetanolo a 10 μL per 1 mL di RLT.
2. Usa 300 μL per modello e pipetta su e giù per staccare e lisare completamente le celle.
3. Trasferisci il lisato in un tubo per microcentrifuga privo di RNasi e posiziona i tubi su ghiaccio secco per congelarli rapidamente. Trasferire a -80 °C per la conservazione a lungo termine.
   NOTA: In alternativa, si può utilizzare il tampone RIPA per l'estrazione proteica preparando: 50 mM Tris-HCl, pH 7,4-7,5; 150 mM NaCl; 1% NP-40 o Triton X-100; 0,5% di desossicolato di sodio; 0,1% SDS in acqua deionizzata. Il buffer RIPA prefabbricato è disponibile anche commercialmente.
4. Aggiungi 200 μL per modello, roccia sul ghiaccio per 5 minuti, poi raccogli il lisato.
5. Centrifugare a 15.000 x g per 10 minuti a 4 °C per mettere i detriti cellulari a galla e trasferire a -80 °C per la conservazione a lungo termine.

Risultati

Organoidi alveolari fibrolastici epitelari derivati da linee cellulari sono stati stabiliti e coltivati per oltre 21 giorni. Sono stati osservati cambiamenti morfologici in tutto questo periodo, con numero, area e diametro organoidi valutati nei giorni 3, 9 e 21 per monitorare crescita e sviluppo. Il numero medio di organoidi per pozzo è diminuito significativamente nei giorni 9 e 21 rispetto al giorno 3 (Figura 2A). Al contrario, l'area e il diametro medio ...

Discussione

Gli organoidi alveolari fibroblastici epiteliali tridimensionali (3D) rappresentano una piattaforma altamente rilevante dal punto di vista fisiologico per modellare la struttura e la funzione polmonare sotto sforzo meccanico. A differenza dei sistemi di co-coltura 2D o addirittura 3D, gli organoidi preservano caratteristiche critiche del microambiente polmonare in vivo, tra cui l'organizzazione spaziale, la diafonia epiteliale-mesenchimale e le interazioni con la matrice extrace...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tubo microcentrifuga da 1,5 mL	Eppendorf	0030 125.215
Valvola conica da 15 mL	Fisher Scientific	14-959-53A
16% paraformaldeide	Thermo Fisher Scientific	28908
2-mercaptoetanolo	Millipore Sigma	M3148
Tubo conico da 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22
Piastra circolare in schiuma Tissue Train a 6 pozzi (membrana flessibile)	Flexcell International	TTCF-5001
Celle A549	Collezione di Cultura di Tipo Americano (ATCC)	CCL-171
Compressore d'aria	Utensili ad aria California	10020DSPCAD
Albumina sierica bovina	Millipore Sigma	A9418
Buffer RLT	Qiagen	79216
Incubatore CO2	PHCBI	MCO-170AICUVL-PA
Soluzione di raccolta organoidi Cultrex	Bio-Techne	3700-100-01
Kit per il test di citotossicità CyQUANT LDH	Thermo Fisher Scientific	C20300
DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindolo)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Dimetilsolfossido	Sigma Aldrich	D2650-100ML
Dulbecco' s Eagle modificata s medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	11965092
Microscopio EVOS XL Core	Thermo Fisher Scientific	AMEX1200
Siero fetale bovino (FBS)	Thermo Fisher Scientific	A5209501
Software per l'analisi delle immagini delle Figi	Istituti Nazionali di Salute
Sistema Flexcell FX-6000 Tension e Tissue (include controllore di tensione Flexlink FX-6000, serbatoio di pressione, piastra di base, finestra in acrilico, stazioni di carico cilindriche di 25 mm di diametro, sifone d'acqua, software FlexSoft FX-6000 V1.0 e vari tubi)	Flexcell International	FX6000T
Duoset Umano Interleucina-6 ELISA	Bio-Techne	DY206
Duoset Umano Interleucina-8 ELISA	Bio-Techne	DY208
Microscopio confocale Leica DMi8	Leica Microsystems	11889122
Matrice di membrana basale Matrigel	Corning	356237
Celle MRC-5	ATCC	CCL-185
Parafilm	Millipore Sigma	P7793
Penicillina/streptomicina (Pen/PTREP)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Sonde di marcatura con faloida, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A12379
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Thermo Fisher Scientific	14190-144
Collagene della coda di topo I	Sigma-Aldrich	C3867
Proteina ricombinante di lattato deidrogenasi umano (attiva)	Abcam	Ab93699
Buffer di lisi RIPA	Thermo Fisher Scientific	89901
Tubi microfuge senza RNasi	Thermo Fisher Scientific	AM12400
Fiaschetta di coltura T75 cm2 fiaschetta di coltura	Greiner	658175
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-5ML
Anticorpo monoclonale ZO-1 (ZO1-1A12), Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	339194