Articolo metodologico

In-vitro Ricostituzione dell'ubiquitinazione batterica ed eliminazione mediata da VCP/p97

DOI:

10.3791/69454

⸱

2 gennaio 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Bombay

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive un metodo per ubiquitinare Streptococcus pneumoniae utilizzando lisato cellulare di mammifero o complesso enzimatico puro ubiquidina, seguito da un trattamento con complesso proteico purificato VCP/p97-UFD1-NPLOC4 per valutarne l'attività batteriolitica, consentendo lo studio degli effettori immunitari dipendenti da ubiquidina.

Abstract

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L'ubiquitinazione è una modifica post-traduzionale versatile che svolge un ruolo fondamentale nell'immunità citosolica. All'invasione delle cellule ospiti, i batteri patogeni vengono inizialmente racchiusi all'interno di un endosoma, dal quale si liberano e fuggono nel citosol per evitare la degradazione lisosomica. Una volta nel citosolo, i batteri vengono rapidamente marcati con catene di ubiquitina dalle ligasi E3 dell'ospite, segnandole per la liberazione tramite molteplici vie effettori, inclusi autofagia e proteosoma. Per delineare il contributo delle singole vie nell'eliminazione batterica, la ricostituzione in vitro offre un approccio controllato e inequivocabile. Qui, utilizzando Streptococcus pneumoniae (SPN) come patogeno batterico modello, presentiamo un protocollo dettagliato per la sua ubiquitinazione utilizzando lisati cellulari di mammiferi o un complesso enzimatico puro di ubiquitine, seguito dal trattamento con complesso purificato VCP/p97-UFD1-NPLOC4 per valutarne l'attività batteriolitica indipendentemente da altri fattori cellulari. Nel complesso, questa procedura ha il potenziale di illuminare la funzione delle ligasi e degli effettori di ubiquitina legate all'immunità in un contesto privo di cellule, dove dissezionare tali meccanismi può essere difficile in cellule intate.

Introduzione

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L'ubiquitina (Ub) è una piccola proteina da 8,6 kDa che modifica i substrati target attaccandosi covalentemente a essi nella sua glicina C-terminale, creando un legame isopeptidico con il gruppo ammino-ε dei residui della lisina in un processo chiamatoubiquitinazione 1. Questo fenomeno è governato da una serie di passaggi orchestrati che coinvolgono un enzima attivante dell'ubiquitina E1, un enzima coniugante dell'ubiquitina E2 e una ligasi E3 dell'ubiquitina 1,2,3. Ub può essere attaccato come monomero o come catene di diverse lunghezze attraverso i suoi sette residui di lisina (Lineare/M1, K6, K11, K27, K29, K33, K48 e K63)4. Queste catene uniche di Ub agiscono come marcatori molecolari per varie funzioni cellulari, come la degradazione proteasomicale, il traffico cellulare, la riparazione del DNA e l'autofagiaselettiva 3.

Sebbene il ruolo canonico dell'ubiquitinazione sia da tempo associato al mantenimento dell'omeostasi cellulare, come degradare proteine mal ripiegate tramite proteassomi o indirizzare carichi specifici verso l'autofagiaselettiva 5,6, ora è evidente che l'ubiquitina funziona anche come meccanismo di rilevamento cruciale del sistema immunitario citosolico contro le infezioni batteriche. I batteri intracellulari infiltrano frequentemente le cellule ospiti per evitare di essere individuati dalla risposta immunitaria extracellulare e si riproducono in un ambiente protetto 7,8. Molti patogeni utilizzano sistemi secretori e tossine per danneggiare irreparabilmente le vacuole che li trasportano, permettendo la fuga nel citosolo per ottenerenutrienti 9,10. Una volta nel citosol, questi batteri sono decorati con catene poliubiquitine da specifiche ligasi E3, che agiscono come un "tag della morte" molecolare, che li indirizza verso l'eliminazione selettiva. Ad esempio, la ligasi E3 SMURF1 coinvolge Mycobacterium tuberculosis avviando la poliubiquitinazione K48-legata direttamente sulla sua superficie, che porta alla sua degradazione tramite ilproteosoma 11. La parkin si accumula nelle vacuole contenenti batteri e forma catene di ubiquitinalegate a K63 12, mentre ARIH1 e LRSAM1 modificano le superfici dei batteri con catene K48 e K6, inibindo così la crescitabatterica 13,14. Sebbene la maggior parte delle ligasi E3 si concentri principalmente sui substrati proteici dell'ospite, alcune lagassi mostrano una specificità notevole per i componenti microbici. RNF213 identifica e ubiquitina lipopolisaccaridi (LPS) presenti su Salmonella enterica serovarTyphimurium 15, e il complesso SCFFBXO2 riconosce i glicani batterici presenti nello Streptococco del Gruppo A come substrato per l'ubiquitinazione16, facilitando la xenofagia. Il complessoSCF FBXW7, invece, riconosce motivi degron all'interno delle proteine di superficie di Streptococcus pneumoniae (SPN). Queste includono β-galactosidasi A (BgaA) e la proteina di superficie pneumococcica A (PspA), che, dopo il marcataggio con catene di poliubiquitina legate a K48, sono state confermate usando anticorpi specifici Ub legati a K48, presumibilmente attraggono il sistema proteasomosale, consentendo un'efficace eliminazionebatterica 17.

Sebbene il processo di marcatura di questi invasori citosolici con ubiquitina sia ben compreso, il meccanismo successivo con cui il sistema proteasomologico rimuove tali grandi entità microbiche rimane dubbio. Ricerche recenti hanno rivelato che l'ATPasi dell'ospite, VCP/p97 (proteina contenente Valosina), svolge un ruolo cruciale in questo processo. In collaborazione con cofattori come UFD1 e NPLOC4, il VCP può identificare batteri marchiati con poliubiquitina ed estrarre fisicamente proteine ubiquitinate dalla membrana batterica, rompendole e facilitando la loro eliminazione dal mezzo citosolico senza dipendere dal meccanismoproteasomico 18.

Il citosolo ospite contiene una complessa rete di vie immunitarie che funzionano in parallelo e in modo infallibile per garantire la rimozione dei patogeni. Questa ridondanza è cruciale per una difesa solida, ma complica gli sforzi per identificare ed esaminare il ruolo dei singoli fattoriimmunitari 19. A tal proposito, i sistemi di ricostituzione in vitro offrono una piattaforma utile per analizzare vie specifiche in condizioni controllate. Qui introduciamo un sistema cellulare che ricapitola il processo di ubiquitinazione e perdita di vitalità dello SPN utilizzando lisati cellulari di mammiferi o enzimi E1-E2-E3-Ub insieme a complessi di fettori dell'ospite purificati. In questo protocollo in due fasi, facilitiamo innanzitutto la coniugazione delle catene di poliubiquitina sui batteri, seguita dalla valutazione della loro eliminazione tramite VCP/p97 in associazione con UFD1 e NPLOC4. Ricostituendo questa via in vitro, bypassiamo le complessità cellulari e indagiamo specificamente la capacità del VCP di neutralizzare il patogeno. Questa configurazione precisa consente un'esplorazione dettagliata del riconoscimento del substrato, della specificità della catena, della modalità d'azione dell'effettore e dei componenti essenziali necessari per avviare una risposta efficace.

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Protocollo

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1. Preparazione della coltura cellulare e del lisato

  1. Scongelare le cellule di A549 e farle crescere in una fiaschetta di T25 utilizzando DMEM completo con siero bovino fetale al 10% (FBS). Incubare a 37 °C in un ambiente umidificato con il 5% diCO2. Fai passare le celle attraverso tre passaggi per la manutenzione, poi trasferisci 2 × 106 celle in una fiaschetta T75. Continuare la coltura finché la densità cellulare non raggiunge 8-10 ×10,6 cellule.
  2. Raschiare le cellule dalla fiaschetta T75 a 4 °C utilizzando un buffer di reazione che contiene 200 mM di HEPES, 100 mM diMgCl 2, 1 M di KCl e glicerolo al 5% a pH 7,4. Centrifugare le celle raschiate a 120 × g per 10 minuti per pellettarle, poi risospese nel tampone di reazione per ottenere un volume finale di circa 0,6 mL in un tubo centrifuga da 1,5 mL.
    NOTA: L'intero campione deve essere lavorato nel ghiaccio.
  3. Sonicare la sospensione della cella utilizzando una sonda stretta (punta di diametro, 2 mm) a un'ampiezza di 40 μm con 2 secondi di impulsi on/off per una durata di 2-2,5 minuti, mantenendo la miscela sul ghiaccio. Centrifugare i campioni sonicati a 21.000 × g per 45 minuti, raccogliere il surnatante risultante e aggiungere 2-3 volte il cocktail di inibitori della proteasi 50x.
    NOTA: O usare immediatamente il lisato per la reazione di ubiquitinazione lo stesso giorno oppure congelarlo rapidamente usando azoto liquido e conservarlo a -80 °C; Tuttavia, assicurati di usarlo entro al massimo 3 giorni per un'ubiquitinazione efficace. La concentrazione di lisato, compresa tra 2 e 4 mg/mL, è adatta all'ubiquitinazione.

2. Coltura batterica

  1. Coltivare il batterio Streptococcus pneumoniae (SPN) ceppo R6 (Serotipo II) durante la notte a 37 °C con il 5% di CO2 in un mezzo THY composto da polvere di brodo Todd Hewitt (3,7 g/100 mL) ed estratto di lievito (1,5 g/100 mL).
    NOTA: Evita di inoculare i batteri se il substrato è diventato di colore marrone scuro. Streptococcus pneumoniae è classificato come patogeno di Biosicurezza di Livello 2 (BSL-2); adottare precauzioni e seguire i corretti protocolli di contenimento BSL-2, incluso l'uso di un armadietto di biosicurezza certificato.
  2. Il giorno successivo, inoculare dalla coltura notturna in un substrato THY fresco (1:10) a 37 °C con il 5% di CO2 e far crescere la SPN fino a raggiungere la densità ottica a 600 nm (OD600 nm). Prepara una riserva di glicerolo di SPN (900 μL di coltura SPN e 600 μL di glicerolo (50%) e conservalo a -80 °C.
  3. Il giorno dell'esperimento di ubiquitinazione, si scongela un nuovo stock di SPN da -80 °C e lo inoculi completamente in un mezzo THY da 5 mL e lascialo crescere fino a raggiungere0,4 a 600 nm OD.
    NOTA: La coltura batterica è stata cresciuta fino a un ODdi 600 nm di 0,4, che corrisponde a circa 108 cellule SPN per mL. Questa correlazione è stata stabilita enumerando le unità formanti colonie (CFU), determinate diluendo serialmente la coltura in 1x PBS per diminuire la concentrazione cellulare batterica in modo da ottenere colonie numerabili e spotting sulle piastre agar BHI, un mezzo più arricchito rispetto al THY.

3. Saggio di ubiquitinazione in vitro da lisato di mammiferi

  1. Prendi circa10 7 cellule SPN e lava accuratamente almeno tre volte con il tampone di reazione (200 mM HEPES, 100 mMMgCl 2, 1 M KCl e 5% glicerolo a pH 7,4) risospendendo i batteri nel tampone successivo, seguita da centrifugazione a 21.000 × g per 5 minuti, per poi granularli infine tramite centrifugazione a 21.000 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
  2. Sospendere il pellet SPN con lisato di cellule mammiferiche A549 insieme a ubiquitina purificata (350 μM) e 1 mM di ATP e incubare per 1-2 ore a 27 °C.
    NOTA: Evitare di congelare e scongelare il lisato cellulare dei mammiferi. È meglio se il lisato viene preparato lo stesso giorno del test di ubiquitinazione.
  3. Dopo l'incubazione, lavare i batteri con un tampone di reazione contenente 1 M di urea, seguita da due lavaggi con solo tampone di reazione, seguita da fissazione con paraformaldeide (PFA) all'1%. Dopo la fissazione, incubare le cellule con PBS contenente glicina (1 mg/mL) per 15 minuti, seguite da due lavaggi 1x PBS.
    NOTA: Un lavaggio con urea da 1 M viene utilizzato per interrompere leggermente le interazioni non covalenti, assicurando che rimangano solo batteri ubiquitinati covalentmente. Successivamente, è importante lavare accuratamente con un tampone di reazione per rimuovere l'urea residua, poiché la sua presenza può interferire con il test di uccisione in vitro .
    Come controllo negativo, prepara l'intera miscela di reazione e incubala con batteri su ghiaccio per inibire l'attività enzimatica. Subito dopo l'incubazione, risciacqua il campione e poi fissalo usando PFA all'1% per mantenere la condizione della reazione.

4. Saggio di ubiquitinazione in vitro dal complesso enzimatico E1-E2-E3

  1. Preparare prima una miscela di reazione composta da ubiquitina (350 μM), UBE1 (400-800 nM), UbE2C (3-5 μM), complesso Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 (500 nM) e 2 mM ATP in buffer di reazione (200 mM HEPES, 100 mMMgCl2, 1 M KCl e glicerolo al 5% a pH 7,4), per ottenere il volume totale di reazione di 100-150 μL.
    NOTA: conservare tutti gli enzimi a -80 °C. Per evitare la perdita di attività dovuta a più cicli di congelamento-disgelo, crea piccole aliquote e utilizzane nuove per ogni reazione di ubiquitinazione.
  2. Risospendere i batteri (10,7 CFU) in questa miscela di reazione contenente enzimi ubiquitina e incubare per 2 ore a 27 °C. Successivamente, lavare i batteri con un tampone di reazione contenente 1 M urea per almeno 3 volte, seguita da fissazione con paraformaldeide (PFA) all'1%. Dopo la fissazione, incubare le cellule con PBS contenente glicina (1 mg/mL) per 15 minuti, seguite da due lavaggi 1x PBS.
    NOTA: Se c'è una perdita cellulare eccessiva, si può ridurre il numero di lavaggi.

5. Visualizzazione dei batteri ubiquitinati

  1. Dopo aver fissato il campione con PFA all'1%, incubarlo in BSA al 3% per 1 ora a 27 °C, poi eseguire due lavaggi con 1x PBS.
  2. Risospendere i batteri ubiquitinati utilizzando un anticorpo primario a concentrazioni superiori a quelle tipicamente utilizzate nei saghi di immunofluorescenza. Utilizzare un anticorpo specifico per batteri insieme a un anticorpo anti-ubiquitina (1:100), diluito in PBS contenente l'1% di BSA, per la colorazione a 27 °C per 1 ora.
    NOTA: Per una colorazione ottimale degli anticorpi, utilizzare un tubo centrifugo a basso legame proteico per minimizzare la perdita di anticorpi oppure una concentrazione di anticorpi più alta per ottenere i migliori risultati.
  3. Successivamente, lavare i batteri due volte con 1x PBS e poi risospenderli con l'anticorpo secondario corrispondente coniugato rispettivamente con Alexa Fluor 488 e 555, per 1 ora a 27 °C.
  4. Applicare circa 10-20 μL del campione batterico etichettato tramite drop casting e mescolare 5-10 μL di mezzo di montaggio con o senza DAPI, poi applicare un copertino sopra e utilizzare carta velina per assorbire eventuali liquidi in eccesso. Infine, osserva il campione al microscopio confocale lo stesso giorno.

6. Espressione e purificazione proteica

  1. Per l'espressione del VCP/p97 di tipo wild, si trasforma il plasmide contenente VCP pET28a nello ceppo BL21-DE3 di E. coli tramite un protocollo di trasformazione standard di E. coli 20. Le colonie di incubazione si sono formate dopo la trasformazione durante la notte nel brodo di Luria (LB) a 37 °C. Il giorno seguente, inoculare la coltura 1:50 in una fiaschetta ben aerata contenente LB e lasciarla crescere fino a raggiungere 0,7-0,8 dal diametrodiametro 600 nm. Aggiungere 200 μM di IPTG alla coltura e incubare per 5 ore a 37 °C con agitazione a 180 giri/min; confermare l'espressione proteica utilizzando una SDS-PAGE.
    NOTA: Per l'intera fase di crescita ed espressione batterica, la Kanamicina (50 μg/mL) è stata utilizzata come pressione di selezione.
  2. Per l'espressione di UFD1 di tipo selvatico, si trasforma il plasmide contenente UFD1 pET41b in ceppo BL21-Rosetta di E. coli tramite il protocollo standard di trasformazione di E. coli 20. Le colonie di incubazione si sono formate dopo la trasformazione durante la notte nel brodo di Luria (LB) a 37 °C. Il giorno seguente, inoculare la coltura 1:50 in una fiaschetta ben aerata contenente LB e lasciarla crescere fino a raggiungere 0,7-0,8 dal diametrodiametro 600 nm. Aggiungere 1 mM di IPTG alla coltura e incubare per 5 ore a 37 °C con scuotimento a 180 giri/min; confermare l'espressione proteica utilizzando una SDS-PAGE.
  3. Per esprimere NPLOC4 di tipo selvatico, si introduce il plasmide contenente NPLOC41b nel ceppo BL21-Rosetta di E. coli utilizzando il metodo standard di trasformazione di E. coli 20. Incubare le colonie che nascono dalla trasformazione nel brodo Luria (LB) durante la notte a 37 °C. Il giorno successivo, trasferire una diluizione 1:50 della coltura in una fiaschetta ben aerata riempita di LB, e lasciarla crescere fino a raggiungere la densità otticaa OD 600 nm tra 0,7 e 0,8. Dopodiché, aggiungere 1 mM di IPTG alla coltura e continuare l'incubazione per 16 ore a 18 °C scuotendo a 180 giri/min; verificare l'espressione proteica effettuando un'analisi SDS-PAGE.
    NOTA: Per l'intera fase di crescita ed espressione batterica effettuata nel ceppo E. coli BL21-Rosetta, sono stati utilizzati Kanamicina (50 μg/mL) e Cloranfenicolo (20 μg/mL) come pressione di selezione. Le sequenze di pET28a-p97 e pET41b-NPLOC4 sono fornite nel File Supplementare 1.
  4. Dopo l'espressione proteica, centrifugare le cellule batteriche a 21.000 × g per 10 minuti e risospendere la pellet in un tampone di lisi contenente 50 mM di Tris-Cl, 300 mM di NaCl, 5 mM β-mercaptoetanolo, 1 mM PMSF, 5% glicerolo e pH 8.
  5. Sonicare le celle per 1 ora usando una sonda stretta (diametro della punta, 6 mm) a un'ampiezza di 50 μm e con un impulso di 20 secondi on/off a 4 °C. Svuota i detriti usando 15.000 × g per 1 ora e raccogli il soprandante.
    NOTA: La sonicazione totale è stata eseguita per 1 ora (30 min ON e 30 min OFF come impulsi da 20 s), e il processo è continuato fino a quando la sospensione a celle torbide è diventata traslucida a trasparente. È necessaria una centrifugazione ad alta velocità per garantire che i detriti cellulari rimangano in pellet e non si stacchino durante il caricamento del lisato sulla colonna di purificazione proteica.
  6. Far passare il soprantantante attraverso un filtro da 0,4 μm e caricarlo sulla colonna piena di perle Ni-NTA per la purificazione dell'affinità, pre-bilanciato con tampone di purificazione (50 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoetanolo, 5% glicerolo, pH 8).
  7. Risciacquare la colonna ricca di proteine usando un tampone di lavaggio che contiene 50 mM di Tris-Cl, 300 mM di NaCl, 5 mM β-mercaptoetanolo, 5% glicerolo, pH 8 e 30-60 mM imidazolo di circa 400 mL, poi eludi la proteina con un tampone di eluzione che include 50 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoetanolo, 5% glicerolo, pH 8 e 250 mM imidazolo.
    NOTA: La concentrazione di imidazolo e il volume del lavaggio possono variare in base alla specifica proteina analizzata. Per valutare la purezza, è necessario eseguire SDS-PAGE. È essenziale lavare accuratamente la colonna finché l'eluente non mostra una reazione negativa con il reagente di Bradford. La frazione eluzionata mostra una banda prominente e concentrata della proteina bersaglio, che dovrebbe rappresentare prevalentemente il campione, con solo tracce minori, se presenti, di altre proteine.
  8. Raccogli varie frazioni, analizzale con SDS PAGE per identificare quali frazioni contengono proteine pure, e poi effettua uno scambio di tampone nel tampone di reazione (200 mM HEPES, 100 mMMgCl 2, 1 M KCl e 5% glicerolo a pH 7,4) utilizzando una colonna PD-10.
    NOTA: Misurare la concentrazione proteica usando il reagente di Bradford (Coomassie Brilliant Blue G-250). Tutte le proteine devono essere congelate rapidamente in azoto liquido e conservate a -80 °C.

7. Saggio di uccisione batterica in vitro

  1. Combina 6 μM di VCP/p97 con 1 μM ciascuno di NPLOC4 e UFD1, poi riempi il volume con il buffer di reazione a circa 90 μL. Lascia incubare questa miscela di reazione sul ghiaccio per 2 ore.
  2. Aggiungi 1-2 mM di ATP nella miscela di reazione che include p97-UFD1-NPLOC4, e poi combinalo con lo SPN ubiquitinizzato (107 cellule) per una durata di 2 ore a 37 °C.
  3. Per valutare la vitalità batterica, subito dopo il trattamento, si preleva un'aliquota di 1 μl della miscela reazionale, si effettua una diluizione seriale (1:1, 1:10, 1:100 e 1:1000) e si pongono 10-2 μL di ciascuna diluizione sulle piastre di agar Brain Heart Infusion (BHI). Ripete questa procedura utilizzando un'aliquota di 1 μL dalla reazione dopo 2 ore di incubazione.
    NOTA: Individua tutte le diluizioni per risultati migliori.
  4. Valutare le unità formative di colonie (CFU) tra i punti temporali di 0 e 2 ore. Calcola la vitalità batterica (%) dividendo il conteggio di CFU a 2 ore per quello a 0 ore, poi moltiplicando il risultato per 100.
    NOTA: Per ottenere risultati più affidabili, utilizzare VCP/p97 denaturato termicamente, VCP/p97 privi del complesso di cofattori UFD1-NPLOC4, oppure una variante carente di ATPasi di VCP/p97 per il confronto come controllo negativo.

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Risultati

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Il nostro protocollo dettaglia l'utilizzo di cellule A549 di mammiferi per produrre un lisato cellulare ricco dei componenti necessari per avviare un processo di ubiquitinazione (Figura 1A). Questo lisse, sia in stato concentrato sia sostituito da componenti purificati come UBE1 (l'enzima attivante dell'ubiquitina E1), UbE2C (un enzima coniugante dell'ubiquitina E2) e il complesso Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 (la ligasi E3 dell'ubiquitina), viene miscelato con ubiqui...

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Discussione

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Sebbene il sistema di ricostituzione in vitro descritto qui offra un quadro solido per esplorare le complessità molecolari dell'ubiquitinazione e dell'eliminazione batterica, devono essere considerate diverse limitazioni significative. La dipendenza dalle concentrazioni suprafisiologiche di proteine purificate, che comprendono la macchina di ubiquitinazione (ligasi E1, E2, E3, ubiquitina) e il complesso degli effettori dell'ospite (VCP/p97, UFD1, NPLOC4), offre intuizioni meccan...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

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Esprimiamo la nostra gratitudine alla Bio-safety Level 2 Facility e alla Confocal Microscopy Facility dell'IIT Bombay. Sourav Ghosh. (17/06/2018(i) EU-V), Sumit Rakshit (221610197857) e Udit Kumar Das (24D0061) hanno ricevuto borse di studio rispettivamente da CSIR, UGC, Governo dell'India e IIT Bombay. Anirban Banerjee ha ricevuto finanziamenti per la ricerca dal Science and Engineering Research Board del Governo dell'India (Grant numero SPR/2019/000808) e dalla Ignite Life Science Foundation (Grant numero IGNITE/FG-OC/2021/004). Gli enti finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cocktail di inibitori della proteasi 50XPromega G6521
6x-His-UbiquitinUBPBioE1100
Linea cellulare A549  ATCCATCC CCL-185
Alexa Fluor 488InvitrogenA21202 
Alexa Fluor 555InvitrogenA-31572   
Anticorpo anti-ubiquitinaEnzoBML-PW8810-0100
Anti-Ubiquitina K48-specifico, clone dell'anticorpo Apu2Sigma AldrichZRB2150
ATPSigma AldrichA6419
BHIHiMedia M210
DMEM (glucosio alto)HiMedia AL251
FBSGibco (origine statunitense)38220090
GliceroloPureSynth PSR37325
HEPESSigma AldrichH4034-100G
KClSigma AldrichP3911
MgCl2Sigma AldrichTC006
Paraformaldeide Sigma AldrichE6148
Plasmide pET28a-p97Il nostro laboratorioPlasmide disponibile su richiesta
Plasmide pET41b-NPLOC4Il nostro laboratorioPlasmide disponibile su richiesta
Plasmide pET41b-UFD1AddgenePlasmide #117107
Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 Sigma Aldrich23-030
Ceppo R6 di Streptococcus pneumoniaeATCCATCC BAA-255Patogeno del Gruppo di Rischio -2, da gestire nella struttura BSL-2
Polvere di brodo Todd HewittHiMedia M313
UBE1UBPBioB1100
UbE2CUBPBioC1300
UreaHiMedia MB032
Polvere di estratto di lievito  HiMedia RM027

Riferimenti

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