Articolo metodologico

Microfabbricazione di substrati con gradienti di rigidità su microscala per guidare la migrazione delle cellule stromali del midollo osseo

DOI:

10.3791/69473

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14 novembre 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration, Key Laboratory of Oral Biomedicine Ministry of Education, Hubei Key Laboratory of Stomatology, School & Hospital of Stomatology, Wuhan University, 2School of Power and Mechanical Engineering, The Institute of Technological Science, Wuhan University, 3Department of Oral Implantology, School and Hospital of Stomatology, Wuhan University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive in dettaglio la fabbricazione di un substrato di polidimetilsilossano (PDMS) a doppio strato tramite litografia morbida. Il metodo utilizza microstrutture geometricamente modulate in uno strato inferiore rigido combinato con uno strato superiore piatto e morbido per generare gradienti di rigidità efficaci su microscala, consentendo studi di meccanobiologia cellulare senza interferenze topografiche.

Abstract

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Comprendere come le cellule rispondono ai segnali meccanici è fondamentale per chiarire i meccanismi coinvolti nello sviluppo dei tessuti e nella progressione della malattia. Tuttavia, i substrati esistenti di colture cellulari in vitro spesso non riescono a replicare i gradienti di rigidità fisiologica su scala cellulare, eliminando anche i segnali topografici confondenti. In questo studio, presentiamo un modello di rigidità disaccoppiata che utilizza un substrato di polidimetilsilossano (PDMS) a doppio strato. Questo substrato è costituito da un film sommito morbido e piatto sospeso su un sottostrato rigido caratterizzato da microstrutture a cresta e scanalatura. Lo strato superiore trasmette efficacemente le variazioni di rigidità nella struttura sottostante, mantenendo una topografia e una chimica uniformi sulla superficie di contatto della cellula. La modulazione della rigidezza si ottiene variando la larghezza delle creste e delle scanalature alternate, che sono equidistanti. La microscopia elettronica a scansione ha confermato la morfologia della superficie piatta e la topografia a contatto coerente. La microscopia a forza atomica ha dimostrato che le variazioni di rigidità dipendevano dalla microstruttura: per modelli di 20 μm, i moduli elastici erano di circa 950 kPa per le creste e 850 kPa per le scanalature; per i modelli da 50 μm, questi valori erano rispettivamente di circa 1070 kPa e 950 kPa. Le cellule primarie del midollo osseo di topo hanno aderito bene e si sono diffuse sul substrato, mostrando una preferenza per la localizzazione nucleare verso le regioni della cresta più rigide nel pattern di 50 μm (61,49%, p < 0,05), confermando così l'efficace percezione cellulare del gradiente meccanico. In sintesi, questo protocollo offre un metodo riproducibile per costruire un substrato di coltura cellulare con gradienti di rigidità su microscala, riducendo al minimo l'interferenza chimica o topografica, consentendo indagini sulla meccanotrasduzione cellulare.

Introduzione

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Le cellule hanno la capacità di percepire e rispondere agli stimoli meccanici all'interno del loro microambiente esterno 1,2,3, che sono cruciali per regolare vari processi cellulari, tra cui l'adesione, la migrazione, la proliferazione e la differenziazione4. In vivo, le proprietà meccaniche del microambiente tissutale mostrano una significativa eterogeneità spaziale, con variazioni nella rigidità della matrice osservate sia in contesti fisiologici - come nelle giunzioni tra osso e muscolo - sia in condizioni patologiche, come all'interno dei tumori 5,6,7. Un'indagine completa di questi fattori meccanici è essenziale per comprendere i meccanismi regolatori che regolano il comportamento cellulare. Questi meccanismi sono fondamentali in processi come lo sviluppo dei tessuti, la progressione della malattia e il processo di rigenerazione e riparazione 8,9.

Per simulare questo complesso microambiente meccanico in vitro, gli idrogel o gli elastomeri sono ampiamente utilizzati per creare substrati con rigidità variabile regolando il grado di reticolazione o il rapporto dei componenti 3,10,11,12,13. Tuttavia, questi metodi spesso provocano variazioni di rigidità discrete che non riescono a riprodurre i gradienti di rigidità continui su microscala che imitano accuratamente le condizioni fisiologiche 13,14,15,16,17. Studi recenti hanno esplorato tecniche come la reticolazione ottica (ad esempio, l'utilizzo di una fotomaschera per regolare l'esposizione ai raggi UV)18, la miscelazione multicanale microfluidica19,20 e le medie guidate dalla diffusione21 per costruire gradienti di rigidità. Sfortunatamente, questi approcci possono essere tecnicamente complessi e introdurre variabili aggiuntive, come la dimensione della maglia22, il rigonfiamento23,24 e la topografia25. L'introduzione di fattori di disturbo complica l'interpretazione delle risposte cellulari alla rigidità. Un sistema PDMS a doppio strato, che utilizza array di micropilastri o modelli a scacchiera come struttura di supporto, è stato adottato per creare substrati di coltura cellulare con gradienti di rigidità26,27. Questi approcci si basano su supporti sottostanti discreti sotto una membrana chimicamente omogenea per ottenere la modulazione della rigidità isotropa, fornendo preziose piattaforme per studiare l'adesione e la diffusione cellulare. Tuttavia, il microambiente cellulare nativo in vivo è spesso altamente anisotropo nelle sue proprietà meccaniche28,29. Si ipotizza che questa segnalazione meccanica direzionale influenzi profondamente gli eventi biologici fondamentali. Pertanto, le attuali strategie di biofabbricazione sono limitate nella loro capacità di replicare le sottili interazioni cellula-rigidità osservate in vivo, che dipendono dall'imitazione accurata dei gradienti di rigidità su microscala e dell'eterogeneità spaziale all'interno di substrati caricati con cellule.

Ricerche precedenti hanno dimostrato che le cellule possono percepire l'effettiva rigidità degli oggetti rigidi anche quando non sono in contatto cellulare diretto30. Sulla base di questo studio, introduciamo un nuovo substrato di coltura cellulare di polidimetilsilossano (PDMS) a doppio strato che genera gradienti di rigidità controllati su scale spaziali che vanno da 5 a 50 μm, allineandosi con l'intervallo di dimensioni rilevante per il meccanosensing subcellulare e a singola cellula. Il substrato è costituito da due strati distinti: un sottostrato PDMS rigido con microstrutture geometriche regolabili e un sovrastrato PDMS morbido uniforme e piatto che funge da superficie di contatto con le cellule. Questo design consente la modulazione meccanica esclusivamente attraverso variazioni nella geometria della sottostruttura, mantenendo la chimica e la topografia della superficie coerenti. Di conseguenza, disaccoppia efficacemente il segnale di rigidità da altri segnali fisici e chimici, offrendo un sistema biologicamente più rilevante per la modulazione della rigidità.

A differenza dei tradizionali substrati a base di idrogel, il nostro approccio consente studi meccanici a variabile singola senza interferenze dovute a rigonfiamenti, dimensioni della mesh o topologia della superficie. Il substrato è semplice da fabbricare utilizzando la litografia morbida standard ed è altamente riproducibile31. È inoltre compatibile con la microscopia ad alta risoluzione, il che lo rende particolarmente adatto per l'imaging in tempo reale e gli studi quantitativi delle risposte cellulari ai segnali di rigidità su microscala. Questo manoscritto presenta il protocollo di fabbricazione completo, descrive in dettaglio la strategia di controllo dei parametri e dimostra l'utilità del substrato con esperimenti di coltura cellulare rappresentativi. In definitiva, questo approccio fornisce uno strumento in vitro robusto e accessibile per esplorare le risposte cellulari a un gradiente di rigidità su microscala.

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Protocollo

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Le cellule stromali primarie del midollo osseo di topo (mBMSC) sono state isolate dalla tibia e dal femore dei topi (n. WP20230204, approvato dal Comitato Etico del Centro per la Sperimentazione Animale dell'Università di Wuhan).

1. Preparazione dello stampo master

NOTA: I nostri protocolli sono specifici per i fotoresist negativi a base epossidica utilizzati durante questa ricerca.

  1. Posizionare due wafer di silicone puliti (50,8 ± 0,2 mm, orientati <100>, 525 ± 25 μm) sulla piastra riscaldante per alcuni minuti per disidratarli.
  2. Prelevare un wafer di silicone dalla piastra riscaldante e raffreddarlo a temperatura ambiente prima di procedere con il rivestimento di rotazione. Applicare 3-5 mL di fotoresist al centro del wafer.
  3. Per ottenere un'altezza della funzione di 20 μm, applicare il seguente protocollo di rotazione: rotazione per 10 s a 7,1 × g, seguita da rotazione a 410 × g per 30 s. Per ottenere un'altezza della funzione di 30 μm, applicare il seguente protocollo di rotazione: rotazione per 10 s a 7,1 × g, seguita da rotazione a 170 × g per 30 s. Utilizzare con cautela un bisturi per rimuovere eventuali perline di bordo che potrebbero formarsi durante la centrifuga.
  4. Cuocere delicatamente nel modo seguente: impostare la piastra a 95 °C, lasciare riposare la cialda sulla piastra calda per 13 minuti. Togliete la cialda dalla piastra e lasciatela raffreddare naturalmente a temperatura ambiente, evitando un improvviso calo di temperatura.
  5. Allineare la fotomaschera sul wafer rivestito di fotoresist ed esporla alla luce UV con una dose totale di 120 mJ/cm2.
  6. Cuocere in post-esposizione nel modo seguente: utilizzando due piastre riscaldanti (65 °C e 95 °C), lasciare riposare il wafer rivestito di fotoresist sulla piastra riscaldante a 65 °C per 1 minuto prima di trasferirlo sulla piastra riscaldante a 95 °C e lasciarlo lì per 5 minuti. Sposta il wafer su una pila di fazzoletti in microfibra e lascialo raffreddare a temperatura ambiente.
  7. Sviluppa il wafer trasferendolo in una capsula di Petri riempita con PGMEA e immergi l'intero wafer nello sviluppatore. Accelera lo sviluppo con l'agitazione manuale.
    NOTA: Il PGMEA è infiammabile e irritante per gli occhi e le vie respiratorie. Smaltirlo come "rifiuto organico infiammabile" in appositi contenitori.
  8. Dopo lo sviluppo, estrarre il wafer dallo sviluppatore e lavarlo in isopropanolo. Se si forma un flusso bianco lattiginoso nell'isopropanolo vicino alla superficie del campione (lo sviluppo non è completo), immergere nuovamente il campione nello sviluppatore per completare il processo di sviluppo. Lavare il campione sviluppato in isopropanolo fino a quando non si forma un flusso bianco lattiginoso vicino alla superficie del campione. Una volta completamente sviluppato, cuocere il fotoresist posizionando il wafer su una piastra a 150 °C per 15 minuti.
  9. Fluorurare il wafer per i seguenti processi di litografia morbida: esporre il wafer al plasma di ossigeno sotto vuoto per 30 s (100 W) per attivare la superficie, quindi posizionarlo in un essiccatore sottovuoto. Far cadere 30 μl di tricloro(1H,1H,2H,2H-tridecafluoro-n-ottil) silano su un vetrino posto all'interno dell'essiccatore sottovuoto. Evacuare l'essiccatore per 2 minuti e mantenere la condizione di vuoto per 30 minuti. Infornare la cialda a 90 °C per 1 ora per completare il processo di silanizzazione.
    NOTA: Controllare rigorosamente l'umidità relativa dell'ambiente al di sotto del 60% durante tutto il processo. L'eccessiva umidità può indurre una rapida idrolisi del silano, che genera precipitati bianchi non volatili di polisilossano. I precipitati compromettono l'uniformità della distribuzione del vapore di silano, con conseguente mancata silanizzazione. Effettuare il trattamento in cappa in quanto il tricloro(1H,1H,2H,2H-tridecafluoro-n-ottil) silano reagisce violentemente con l'acqua, rilasciando fumi tossici di HCl. Neutralizzare con alcali diluiti prima dello smaltimento come rifiuto organico fluorurato/clorurato. Il processo di silanizzazione raggiunge un tasso di successo del 90%.

2. Fabbricazione

NOTA: Il processo di litografia morbida utilizzato per fabbricare il substrato di polidimetilsilossano a doppio strato (PDMS) può essere suddiviso in due fasi distinte: 1) la preparazione sia dello strato inferiore strutturato che dello strato superiore, 2) l'incollaggio dei due strati PDMS. La resa produttiva complessiva è superiore all'80%.

  1. Preparazione PDMS
    1. Per il sottostrato strutturato, preparare il precursore PDMS mescolando il prepolimero e l'agente indurente in un rapporto di 10:1 in peso, seguito da degasaggio sotto vuoto. Versare 1,5 mL del precursore PDMS (10:1) sullo stampo master SU8, coprendo l'intera superficie, quindi degasare sotto vuoto e riposare per 30 min. Spostarlo con cautela in forno e polimerizzare a 90 °C per 1 ora. Sformare lo strato inferiore PDMS strutturato dallo stampo master.
    2. Per lo strato superiore, preparare il precursore PDMS mescolando il prepolimero e l'agente indurente in un rapporto di 30:1 in peso e degassando sotto vuoto. Versare il precursore PDMS su un wafer di silicio fluorurato. Per ottenere uno spessore di 9 μm, applicare il seguente protocollo di spin coating: centrifuga a 7,1 × g per 10 s, seguita da centrifuga a 2.300 × g per 60 s.
    3. Dopo lo spin coating, ispezionare visivamente il film PDMS alla luce ambientale per verificarne l'uniformità, esaminando in particolare eventuali difetti visibili come striature, bolle o accumulo di bordi irregolari. Se la pellicola appare uniformemente trasparente con una riflettività costante su tutta la superficie del wafer, procedere al passaggio successivo; In caso contrario, ripetere il processo di centrifuga con un nuovo wafer. Posizionare il wafer rivestito su una superficie piana per garantire uno spessore omogeneo del film PDMS. Trasferirlo con cautela in forno e polimerizzare a 90 °C per 3 ore.
      NOTA: Sono stati ottenuti film con uno spessore di 9,11 ± 0,34 μm.
  2. Legame
    1. Posizionare lo strato inferiore PDMS strutturato (10:1) con il lato modellato rivolto verso il basso sulla pellicola dello strato superiore PDMS, garantendo un buon contatto tra i due strati senza bolle all'interfaccia.
    2. Trasferire il gruppo nel forno e polimerizzare a 90 °C per 3 ore.
    3. Lasciare raffreddare l'assemblaggio a temperatura ambiente su una pila di fazzoletti in microfibra. Staccare la struttura finale a doppio strato dal wafer e conservarla in una capsula di Petri per un ulteriore utilizzo.
      NOTA: Se durante la desquamazione si formano bolle tra lo strato superiore e lo strato inferiore, in genere indica un'adesione incompleta tra i due strati. Assicurarsi che il precursore PDMS sia completamente degasato prima della centrifuga e verificare che la superficie del film sia priva di polvere o contaminanti prima dell'applicazione del sottostrato PDMS per un contatto completo. Assicurarsi che il wafer di silicio sia a livello durante la centrifuga, l'assemblaggio e l'indurimento. La lacerazione del film può verificarsi a causa della silanizzazione irregolare del wafer o dello spessore non uniforme del PDMS. Per risolvere il problema, controllare rigorosamente l'umidità ambientale durante la silanizzazione al di sotto del 60% di umidità relativa. Il processo di silanizzazione raggiunge un tasso di successo del 90%.

3. Caratterizzazione

  1. Microscopia elettronica a scansione (SEM)
    1. Tagliare il campione con una lama affilata per ottenere bordi puliti.
    2. Montare i campioni su stadi SEM a 90° e 0° utilizzando nastro di carbonio conduttivo per consentire rispettivamente la caratterizzazione della sezione trasversale e della superficie.
    3. Rivestire i campioni con oro per 120 s per migliorare la qualità dell'imaging SEM e raccogliere immagini SEM dei campioni.
  2. Microscopia a Forza Atomica (AFM)
    NOTA: Selezionare la sonda ScanAsyst-Air per la mappatura nanomeccanica quantitativa del modulo.
    1. Posizionare la punta del cantilever AFM al centro del campo visivo. Posizionare il punto laser all'estremità del cantilever allineando il sistema di leve ottiche.
    2. Prima delle misurazioni PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PeakForce QNM), calibrare il cantilever AFM per determinare i seguenti parametri essenziali: Costante della molla a sbalzo: 0,40135 N/m; Sensibilità alla deflessione: 28,993 nm/V (determinata eseguendo una curva di forza su un campione di riferimento rigido); Raggio della punta: ~21 nm (calibrato utilizzando il metodo relativo rispetto a un campione di riferimento con modulo noto).
    3. All'interno del pannello Scansione dell'elenco dei parametri di scansione, configurare le seguenti impostazioni di scansione iniziali: Impostare la dimensione di scansione su 70 μm per i campioni con strisce periodiche con spaziatura di 50 μm. Impostare la dimensione della scansione su 50 μm per i campioni con strisce periodiche con spaziatura di 20 μm. Impostate Campioni/Linea e Linee su 256 (ottenendo un'immagine di 256 x 256 pixel).
    4. Aprire le impostazioni di innesto nel microscopio e impostare il setpoint di innesto della forza di picco predefinito dello strumento in Parametri di innesto.
    5. Fare clic sull'icona Attiva nella barra degli strumenti del flusso di lavoro e continuare a monitorare i segnali in tempo reale durante l'approccio automatizzato.
    6. Assicurarsi che ScanAsyst Auto Control sia impostato sulla modalità Individuale. Regolare il setpoint PeakForce su un valore appropriato per ottenere l'intervallo di deformazione desiderato: per lo strato superiore, il setpoint PeakForce è 0,020 nN; per il sottostrato strutturato, il setpoint PeakForce è di 5 nN.
    7. Avviare la scansione facendo clic sui pulsanti dall'alto verso il basso o dal basso verso l'alto .
    8. Monitoraggio e correzione della curva di forza: se le curve di forza appaiono distorte o si osservano problemi di sincronizzazione (ad esempio, forme irregolari, linee di base incoerenti), fare clic con il pulsante destro del mouse nella finestra Monitoraggio forza e selezionare Configurazione automatica per correggere automaticamente l'allineamento e la sensibilità della curva di forza.
    9. All'interno delle impostazioni del canale di calcolo del modulo , selezionare il modello DMT per adattare la parte di retrazione della curva di forza per il calcolo del modulo elastico.
    10. Fare clic sul pulsante di acquisizione per acquisire e salvare la topografia ad alta risoluzione e la mappa delle proprietà nanomeccaniche.
    11. Esegui l'analisi post-acquisizione utilizzando il software di elaborazione e analisi delle immagini AFM. Apri i file di dati AFM salvati ed estrai i valori del modulo selezionando le regioni sulla superficie del campione; Calcola il modulo medio, la deviazione standard e i profili di distribuzione sia per lo strato superiore che per quello inferiore utilizzando gli strumenti di analisi statistica integrati nel software. Esportazione di mappe del modulo elaborate e dati quantitativi.
    12. Numero di scansioni AFM per campione: Eseguire tre scansioni indipendenti dell'intera area per ciascun campione. Assicurarsi che ogni scansione copra una regione che corrisponda alle dimensioni delle caratteristiche strutturali del campione, 70 μm × 70 μm per i campioni con strisce periodiche distanziate di 50 μm e 50 μm × 50 μm per quelli con strisce distanziate di 20 μm. Per le misure del modulo della struttura sottostante (PDMS 10:1) e del film dello strato superiore (PDMS 30:1), implementare la seguente strategia di campionamento per garantire l'affidabilità dei dati.
      1. Pellicola dello strato superiore (PDMS 30:1): misurare il modulo 2 volte in modo indipendente con ogni misurazione composta da due scansioni non sovrapposte da 5 μm × 5 μm.
      2. Struttura sottostante (PDMS 10:1): date le sue due distinte configurazioni di strisce periodiche (20 μm e 50 μm di spaziatura), misurare il modulo 2x in modo indipendente per ciascuna configurazione.

4. Esperimento di coltura cellulare in vitro

NOTA: Il PDMS è un materiale idrofobo che deve essere rivestito per promuovere l'adesione cellulare prima della coltura cellulare e il metodo di rivestimento appropriato deve essere selezionato in base al tipo di cellula. L'approvazione etica deve essere ottenuta se le cellule primarie vengono utilizzate per l'esperimento cellulare.

  1. Rivestimento in poli-D-lisina (PDL)
    1. Sterilizzare il substrato mediante immersione in alcool per 10 min; quindi lavare per 3 x 5 minuti con PBS.
    2. Sciogliere la PDL (peso molecolare da 150.000 a 300.000 Da) utilizzando PBS a una concentrazione di 0,1 mg/mL. Per il substrato della piastra a 24 pozzetti, aggiungere 1 mL di soluzione di lavoro PDL e metterlo in un incubatore a 37 °C per 4 ore per rivestire completamente la superficie del substrato.
    3. Al termine del rivestimento, rimuovere la soluzione di lavoro PDL e rimuovere eventuali residui di PDL lavando 3 volte con PBS. Utilizzare il substrato per i successivi esperimenti cellulari. Se il rivestimento non viene utilizzato immediatamente, asciugarlo e conservarlo a 4 °C.
      NOTA: Un rivestimento di successo ha presentato una superficie omogenea e priva di caratteristiche al microscopio a contrasto di fase, senza precipitati cristallini visibili o artefatti di essiccazione. I substrati con segni di cristallizzazione o rivestimento non uniforme sono stati scartati.
  2. Isolamento e coltura di cellule stromali primarie del midollo osseo di topo (mBMSC)
    1. Isolare le cellule stromali primarie del midollo osseo di topo (mBMSC) dalla tibia e dal femore dei topi.
    2. Coltiva le cellule in un terreno di coltura costituito da α-MEM integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), l'1% di antibiotico-antimicotico e l'1% di piruvato di sodio.
    3. Cellule seme al passaggio 3 sui substrati ottenuti nel passaggio 4.1.3 a una densità di 5.000 cellule/cm2 per ridurre al minimo i potenziali effetti confondenti derivanti dal contatto cellula-cellula.
  3. Colorazione e imaging in immunofluorescenza
    1. Dopo 16 ore di coltura (37 °C, 5% CO2), fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 10 minuti a temperatura ambiente e lavare 3 volte con PBS. Quindi, permeabilizzare le celle con Triton X-100 allo 0,1% per 15 minuti a temperatura ambiente e lavare 3 volte con PBS.
    2. Per la visualizzazione del citoscheletro, colorare la F-actina con falloidina (diluizione 1:500) per 20 minuti a temperatura ambiente e lavare 3 volte con abbondante PBS per rimuovere eventuali residui di colorante.
    3. Montare il substrato con colorazione simultanea dei nuclei cellulari. Applicare una goccia di glicerina con DAPI per coprire le cellule. Successivamente, posizionare con cura un vetrino coprioggetti sopra il substrato e sigillare i margini con lo smalto per unghie. Evita il più possibile le bolle.
    4. Acquisisci immagini a fluorescenza che catturano la morfologia cellulare e il posizionamento nucleare utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita.

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Risultati

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La fotolitografia è stata utilizzata per fabbricare stampi master in silicio riutilizzabili con microstrutture parallele a cresta e scanalatura. Sono stati creati due design, con una larghezza della scanalatura (la larghezza della cresta è identica alla larghezza della scanalatura) rispettivamente di 20 e 50 μm. Ogni area modellata misurava 7 mm × 7 mm. La precisione e la riutilizzabilità degli stampi in silicone hanno semplificato notevolmente il processo di fabbricazione ripetuta del substrato. Lo stampo master è stato...

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Discussione

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Questo studio presenta un nuovo approccio per progettare un substrato a doppio strato basato su PDMS progettato per introdurre variazioni di rigidità localizzate mantenendo una superficie topograficamente uniforme e priva di caratteristiche. Questo approccio consente la modulazione meccanica esclusivamente attraverso variazioni nella geometria della sottostruttura, mantenendo coerenti la chimica e la topografia della superficie. Di conseguenza, disaccoppia efficacemente il segnale di rig...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato sostenuto finanziariamente dai Fondi per la Ricerca di Base per le Università Centrali della Cina (n. 2042024YXB018 a W. Ji).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
  4% di paraformaldeideTecnologia ServicebioG1101
AcetoneShanghai Aladdin10000418
Anti-AntiGibco15240-062Antibiotico-Antimicotici
Mezzo di montaggio antifade con DAPIBeyotime BiotechnologyP0131glicerina con DAPI e nbsp;
Piastra di coltura cellulareNIDO70200124 pozzi
EssiccatoreSichuan Shubo (Group) Co., Ltd913354-30SNDiametro interno=180mm
Siero bovino fetaleHyCloneSV30208.02
Microscopio a fluorescenza invertitaOlimpoDP74
IsopropanoloShanghai Aladdin80109218GC&GE; 99.7%
Allineatore per mascheraSichuan Nanguang Vacuum Technology Co., LtdH94-37
Modifica MEM AlphaHyCloneSH30265.01
Analisi del nanoscopioBrukerVersione 3.0Software di elaborazione e analisi di immagini AFM.
Sistema di imaging ad alto contenuto Opera Phenix PlusPerkin Elmer2400L23248 Equipaggiato con 10x obiettivo aereo
PGMEASuzhou NanoMicro Technology Co., Ltd171011-1Sviluppatore Fotoresist Negativo; SPEC: UL; Percentuale: minimo 99,7%
FalloidinaUelandy YP0052L594-Faloidina
Soluzione salina tamponata con fosfatoHyCloneSH30256.01
Purificatore al plasmaTecnologia del plasma (Germania)Flecto 10 
Poli-D-lisinaBeyotime BiotechnologyST508Numero CAS 27964-99-4
Microscopio a sonda a scansioneBrukerIcona DimensionaleUtilizza software di controllo Nanoscopio, inclusi spazi di lavoro sperimentali PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PF-QNM) e Point-and-Shoot Ramping.
Punta in silicone sulla leva a nitruroBrukerSCANASYST-AIRLa sonda presenta un singolo sbalzo a forma di V rivestito in Al reflex; k = 0,4 N/m (nominale), f0 = 70 kHz.
Lamine di silicioShenzhen Rigorous Technology Co., Ltd-50,8 e più; 0,3 mm di diametro, orientato a (100), 525 e più; 25 & mu; Spessore m
Piruvato di sodioGibco11360-070
Rivestimento a filaturaIstituto di Microelettronica dell'Accademia Cinese delle ScienzeKW-4A
SU-8 3025Suzhou NanoMicro Technology Co., Ltd-Fotoresist negativo; 72,3% di solidi; Viscosità 4400; Densità 1,143g/ml
Kit di elastomeri in silicone SYLGARD 184La Dow Chemical Company01673921
Tricloro(1H,1H,2H,2H-tridecafluoro-n-octil)silanoShanghai Aladdin78560-45-9
Triton X-100BioFroxx1139ML1000,1% Triton X-100 per la permeabilizzazione
Tripsina-EDTAGibco25200-0720,25% Tripsina-EDTA (1x)
Forno a vuotoMemmert (Germania) VO 200 

Riferimenti

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