Method Article

Procedura di campionamento basata su filo rosso di fenolo per lipidomi di fluidi lacrimali non mirati nella scoperta di biomarcatori

DOI:

10.3791/69474

⸱

December 12th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Myopia Research, School of Optometry, The Hong Kong Polytechnic University, 2Centre for Eye and Vision Research (CEVR), 3Department of Food Science and Nutrition, The Hong Kong Polytechnic University, 4Research Centre for SHARP Vision (RCSV), The Hong Kong Polytechnic University, 5Department of Applied Biology and Chemical Technology, The Hong Kong Polytechnic University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive un protocollo clinico unico per la raccolta di campioni di fluido lacrimale umano utilizzando filetti rosso fenolico e un flusso di lavoro basato su cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) per scoprire il profilo lipidomico delle lacrime. Il semplice metodo di separazione biphasic tra metil-tert-butil etere (MTBE)/metanolo consente un'estrazione rapida dei lipidi lacrimali con un alto recupero per la scoperta dei biomarcatori lacrimali.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I lipidi lacrimali sono fondamentali per la stabilità del film lacrimale e per la salute della superficie oculare. I cambiamenti nella composizione lacrimale potrebbero essere associati a malattie oculari e sistemiche come la disfunzione delle ghiandole di Meibomio e la dislipidemia. Il profilaggio dei lipidi lacrimali può aiutare nella scoperta di biomarcatori per la diagnosi e la gestione della malattia. Tuttavia, i metodi comuni di campionamento lacrimale presentano limitazioni nette: le strisce di Schirmer causano frequentemente irritazione e disagio oculare a causa della loro ampia area di contatto con la superficie oculare, mentre la raccolta del tubo microcapillare può garantire una bassa riproducibilità dovuta alla variabilità dell'operatore, specialmente se eseguita da personale diverso. Queste limitazioni potrebbero compromettere l'accuratezza e la coerenza dei dati lipidomici. Questo studio introduce un metodo di campionamento basato su filo rosso di fenolo (PRT) minimamente invasivo, ottimizzato per la lipidomica lacrimale. La struttura sottile della PRT minimizza il rischio di irritazione oculare e permette una raccolta rapida e delicata delle lacrime. Questo metodo facile da usare e facile da eseguire è adatto a soggetti con volume lacrimale ridotto o minore tolleranza alla sensazione di corpi estranei, e consente una raccolta di campioni più riproducibile riducendo la variabilità dipendente dall'operatore. I lipidi lacrimali raccolti dalla PRT sono stati estratti utilizzando un protocollo ottimizzato di separazione di fase metanolo/metil-tert-butil etere (MTBE) e analizzati tramite LC-Orbitrap-IQX MS/MS ad alta risoluzione con il software LipidSearch. Il flusso di lavoro ha identificato più di 700 specie uniche di lipidi lacrimali, ciascuna caratterizzata da specifici ioni prodotto derivati da acidi grassi. Questi risultati indicano che il campionamento basato su PRT fornisce un robusto recupero lipidico per l'analisi lipidomica delle lacrime. Questo approccio minimamente invasivo e riproducibile offre una piattaforma pratica per la ricerca clinica e sperimentale sui lipidi lacrimali. In definitiva, ciò potrebbe anche facilitare la scoperta di biomarcatori e il monitoraggio delle malattie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il film lacrimale è la barriera più esterna che protegge la superficie oculare dai patogeni e mantiene l'omeostasioculare 1,2, mentre lo strato lipidico nel film lacrimale è il componente chiave per prevenire l'evaporazione lacrimale e mantenere la stabilità del filmlacrimale 3,4. La disregolazione della composizione dei lipidi lacrimali è stata collegata a varie malattie oculari, tra cui la malattia dell'occhio secco (DED), la disfunzione delle ghiandole di Meibomio (MGD) e la congiuntiviteallergica 5,6,7,8. Di conseguenza, la caratterizzazione dettagliata dei lipidomici lacrimali è diventata una direzione di ricerca critica e in tendenza per una comprensione più completa delle patologie molecolari alla base di queste condizionioculari.

Sebbene l'approccio lipidomico delle lacrime abbia un'importanza clinica significativa, una sfida cruciale nella lipidomica lacrimale è stabilire un flusso di lavoro standardizzato e riproducibile per la raccolta e l'analisi. I metodi attuali di campionamento per lacrime, le strisce di Schirmer e il tubo microcapillare, presentano ciascuno limitazioni distinte. Le strisce di Schirmer hanno una grande area di contatto con la superficie oculare che spesso provoca irritazione oculare e lacerazione riflessa 9,10. In confronto, la raccolta del tubo microcapillare dipende fortemente dalla tecnica dell'operatore e può produrre risultati incoerenti quando eseguita da diversi operatori11. Inoltre, un uso improprio di questi strumenti di campionamento può comportare anche il rischio di lesioni alla superficie oculare. Queste limitazioni potrebbero compromettere l'accuratezza e la riproducibilità dei dati avalle 12,13. Inoltre, i metodi di raccolta lacrime che richiedono procedure complesse di gestione possono limitarne l'accessibilità e la standardizzazione tra laboratori e contesti clinici diversi. Pertanto, è urgente stabilire un flusso di lavoro di raccolta e elaborazione delle lacrime non invasivo, robusto e riproducibile che possa preservare il profilo lipidico delle lacrime native.

Studi recenti hanno evidenziato l'utilità del filo rosso di fenolo (PRT) per le analisi dei flussi di lavoro LC-MS/MS a valle in applicazioni proteomiche emetabolomiche 14,15. Il PRT offre vantaggi intrinseci come strumento per la raccolta delle lacrime. La sua struttura sottile, la natura minimamente invasiva e la procedura di campionamento semplice potrebbero minimizzare la complessità tecnica e ridurre la variabilità dipendente dall'operatore, pur essendo ben tollerati dalla maggior parte dei soggetti14,16. Tuttavia, non è ancora stato stabilito un flusso di lavoro standardizzato specificamente per l'analisi lipidomica delle lacrime basata su PRT.

Questo protocollo introduce un flusso di lavoro integrato per la lipidomica delle lacrime riproducibili: un metodo di raccolta lacrime PRT facile da usare adattato all'analisi lipidica, un protocollo ottimizzato di estrazione metil-tert-butil etere (MTBE)/metanolo con rapporti solvente/campione definiti e controllidi stoccaggio 17,18, e un metodo modificato di identificazione lipidica utilizzando LC-MS/MS AD ALTA RISOLUZIONE. Questo approccio standardizzato consente una profilazione lipidomica delle lacrime coerente per la scoperta a valle dei biomarcatori e la caratterizzazione della malattia. Inoltre, è particolarmente adatto a soggetti con basso volume lacrimale o minore tolleranza alla sensazione di corpi estranei (Figura 1).

figure-introduction-1
Figura 1: Panoramica schematica del flusso di lavoro basato sul Phenol Red Thread (PRT) per la lipidomica lacrimale umana. Il liquido lacrimale viene raccolto dai soggetti che utilizzano l'approccio PRT, che consente un'acquisizione costante di campioni con minimo disagio. Il trattamento del campione prevede l'estrazione biphasica sequenziale MTBE/metanolo, la concentrazione mediata da SpeedVac e la ricostituzione di estratti di lipidi lacrimali per cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS). I profili lipidomici vengono successivamente acquisiti tramite LC-MS/MS e sottoposti ad annotazione e identificazione tramite il software LipidSearch. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lo studio è stato approvato dall'Institutional Review Board (IRB) della Hong Kong Polytechnic University. I soggetti hanno fornito un consenso informato scritto prima della partecipazione allo studio. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Raccolta di fluido lacrimale umano a base di filo rosso di fenolo (PRT)

  1. Indossa i guanti e disinfetta la postazione per prevenire la contaminazione del campione.
  2. Assicurati che il pacchetto PRT sia sigillato e non scaduto prima di aprirlo.
  3. Tieni il filo all'estremità opposta al gancio piegato. Evita sempre di toccare la metà del PRT con uncino piegato.
  4. Chiedi al soggetto di guardare la direzione nasale superiore.
  5. Abbassare delicatamente la palpebra inferiore del soggetto e inserire il PRT con il gancio piegato posizionato nella congiuntiva palpebrale temporale inferiore vicino al canto esterno dell'occhio del soggetto (Figura 2).

figure-protocol-1
Figura 2: Posizione del filo rosso fenolico durante la raccolta delle lacrime. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Chiedi al soggetto di chiudere delicatamente gli occhi e inclinare leggermente la testa in avanti per impedire al PRT di toccare la sua pelle facciale.
    NOTA: L'assorbimento della lacrima indurrebbe gradualmente un fronte di colorante rosso, indicando la regione campionata della PRT dovuta al fenolo rosso sensibile al pH. Per garantire un fluido lacrimale sufficiente per l'analisi lipidomica, si preferisce raccogliere un volume lacrimale equivalente a 50 mm di PRT, tipicamente completato entro 2 minuti.
  2. Abbassa delicatamente la palpebra inferiore del soggetto e tira fuori il PRT campionato. Evita di toccare la regione campionata.
  3. Registra la lunghezza della regione campionata del PRT e trasferisci il PRT in un nuovo tubo campione con l'aiuto di pinze sterili.
    NOTA: Se la lunghezza del PRT campionato è <50 mm, chiedi gentilmente al soggetto di riposare per 1-3 minuti e ripeti la raccolta con lo stesso occhio. Trasferire ogni PRT campionato su un tubo campione separato.
  4. Etichetta e tappuccia correttamente i tubi del campione.
  5. Pulisci accuratamente guanti e pinze con metanolo e pulisci salviette di carta per rimuovere eventuali residui di lacrime o contaminanti, poi lasciali asciugare.
  6. Ripeti i passaggi 1.2-1.10 per l'altro occhio.
  7. Sigilla i tubetti del campione con parafilm e conserva immediatamente il campione a -20°C per una conservazione temporanea o -80°C per una conservazione a lungo termine. Evita cicli di congelamento e scongelamento inutili e proteggi il PRT campionato dalla luce.

2. Elaborazione del PRT campionato

  1. Prelava le microforbici con metanolo prima di lavorare i PRT.
  2. Scartare l'estremità del gancio piegato (cioè i primi 3 mm) dei PRT (Figura 3).

figure-protocol-2
Figura 3: Aspetto fisico del filo rosso fenolico (PRT). (A) PRT inutilizzato con estremità dell'uncino piegata. (B) Utilizzava PRT con la sezione indicata tagliata e raccolta per l'estrazione dei lipidi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Tagliare la regione campionata del PRT (cioè la regione sopra la parte anteriore del colorante rosso fenolico) in pezzi da 2 mm e trasferire questi pezzi in un tubo microcentrifuga pulito di 1,5 mL tollerante ai solventi organici.

3. Separazione bifasica MTBE/metanolo per l'estrazione lipidica da PRT campionato

ATTENZIONE: MTBE e metanolo sono infiammabili e volatili. Da usare in un'area ben ventilata o in una campana a pompa. Evita fiamme aperte e scintille. Indossa guanti e camice da laboratorio. Lava le mani dopo aver maneggiato.

  1. Metti i campioni sul ghiaccio.
  2. Aggiungere 232 μL di metanolo gelato (grado MS) a ogni campione e a un vortice per 15 secondi.
  3. Sonica i campioni in un detergente a ultrasuoni pre-raffreddato per 15 minuti.
  4. Aggiungere 774 μL di MTBE (grado HPLC) e 194 μL di acqua deionizzata a ciascun campione e vortice per 15 secondi. Il rapporto volumetrico risultante di MTBE:metanolo:acqua nel campione dovrebbe essere di 4:1,2:1 (v/v/v).
  5. Sonica di nuovo i campioni in un detergente ultrasonico pre-raffreddato per 15 minuti.
  6. Incubare il campione nel termomiscelatore per 8 ore a 4 °C, con agitazione a 1.200 giri/min.
  7. Lascia riposare la miscela a temperatura ambiente per 10 minuti.
  8. Centrifugare le miscele risultanti a 10.000 × g per 10 minuti a 4 °C.
  9. Dopo la centrifugazione, le miscele vengono separate in due fasi (Figura 4).
    NOTA: Al termine della separazione di fase, ispezionare il campione per due strati distinti: la fase organica superiore (ricca di MTBE) dovrebbe apparire trasparente con una leggera opacità lattiginosa, mentre la fase acquosa inferiore presenta una colorazione gialla attribuibile alla presenza di indicatore rosso fenolico. Procedere solo se queste caratteristiche di fase sono osservate, come mostrato nella Figura 4.

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Figura 4: Separazione delle fasi dell'estrazione lipidica usando MTBE-metanolo-acqua: fase organica superiore e fase acquosa inferiore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Raccogliere con cura 700 μL della frazione organica superiore contenente i lipidi e trasferirla in un nuovo tubo microcentrifuga pre-raffreddato da 1,5 mL.
  2. Scartare la fase acquosa inferiore contenente MTBE residuo e metanolo come rifiuti chimici pericolosi. Raccogliere i rifiuti in contenitori etichettati e sigillati e smaltirli secondo i protocolli istituzionali sui rifiuti pericolosi e le normative locali. Non versare solventi nello scarico.
  3. Asciuga gli estratti lipidici utilizzando un concentratore SpeedVac refrigerato per 4 ore a 4 °C.
    NOTA: Per garantire l'asciugatura completa, controllare periodicamente la siccità del campione a partire da 2 ore. Estendi il tempo di asciugatura se necessario finché i campioni non sono completamente essiccati.
  4. Conservare gli estratti lipidici essiccati a -20 °C per la conservazione a breve termine o a -80 °C per la conservazione a lungo termine.

4. Ricostituzione del lipide lacrimale estratto per l'analisi LC-MS/MS

  1. Ricostituire gli estratti lipidici essiccati con 50 μL della miscela metanolo gelato (grado MS)/cloroformio (grado HPLC) (1:1, v/v) come solvente (1 μL di solvente per 1 mm di PRT utilizzato) e seguire con una sonicazione in un detersivo ultrasonico pre-raffreddato per 15 minuti.
  2. Centrifugare gli estratti lipidici ricostituiti a 14.000 × g e 4 °C per 10 minuti.
  3. Trasferire con attenzione 40 μL del sovrantante in una fiala di vetro autocampionatore con un inserto di vetro installato.
  4. Coprire strettamente la fiala con un tappo aperto del setto setto, pronta per l'analisi LC-MS/MS.

5. Acquisizione di campioni tramite LC-MS/MS

  1. Per la Cromatografia Liquida, impostare la camera della colonna e la temperatura del campionatore rispettivamente a 50 °C e 4 °C.
  2. Per ogni iniezione, carica 5 μL del campione su una colonna LC a fase inversa (C18; 1,7 μm, 100 mm × 2,1 mm) e fraziona i lipidi a una portata di 0,3 mL/min in un gradiente di separazione di 24 minuti.
    1. Utilizzare la fase mobile A composta da una miscela di acetonitrile 60:40 (grado MS):acqua (v/v) con 5 mM di formatiato ammoniaco (grado MS) e acido formico allo 0,1% (v/v) (grado MS) e fase mobile B contenente 90:10 di isopropanolo (grado MS):acetonitrile (v/v) con 5 mM di formatiato ammoniaco e acido formico allo 0,1% (v/v).
    2. Usa il seguente gradiente: 0-2 min: 40% B; 2-2,5 min: 40% B; 2,5-3 min: 58% B; 3-18 min: 99% B; 18-20 min: 99% B; 20-20,1 min: 40% B; 20,1-24 min: 40% B.
  3. Per lo Spettrometro di Massa Orbitrap, imposta la tensione di spruzzatura a +3,5 kV per la modalità positiva o -2,5 kV per la modalità negativa.
  4. Regolare la portata del gas della guaina a 45 Arb e la portata ausiliaria del gas a 10 Arb.
  5. Imposta la portata del gas di sweep a 2 Arb.
  6. Imposta la temperatura del tubo di trasferimento ionico a 300 °C e quella del vaporizzatore a 320 °C.
  7. Utilizzare la modalità acquisizione dipendente dai dati (DDA).
  8. Per MS1, imposta la risoluzione a 120.000, intervallo di scansione a 100-2000 m/z, target AGC standard, tempo di iniezione automatica, esclusione dinamica a 6 s e soglia di intensità a 5,0e4.
  9. Per MS2, imposta la risoluzione a 15.000, portata di scansione automatica, target AGC standard, tempo di iniezione dinamica, finestra di isolamento a 1,6 m/z, tipo di energia di collisione come dissociazione collisionale ad energia più alta (HCD) e energia di collisione normalizzata (NCE) a valori a gradini di 15, 30 e 40.
  10. Analizza i dati grezzi con il software LipidSearch o altre piattaforme compatibili.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sono stati raccolti campioni compositi di lacrime da 16 volontari sani in tre visite indipendenti distanziate due settimane di distanza (R1, lotto più vecchio; R2, R3 raccolti in sequenza due settimane dopo ciascuno). Utilizzando LipidSearch con criteri rigorosi (cioè rapporto segnale-rumore ≥100, grado C o superiore, e intensità ionica ≥30.000), abbiamo identificato rispettivamente 773, 890 e 1.025 specie lipidiche uniche in R1-R3 (Figura 5A). La modalità i...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vantaggi del campionamento di strappo e dell'estrazione dei lipidi basati su PRT
Il flusso di lavoro dei lipidomici lacrimali basato su PRT presentato qui offre un metodo di campionamento minimamente invasivo e pratico per una profilazione completa dei lipidi lacrimali. Rispetto alle strisce di Schirmer, che richiedono un contatto prolungato e volumi di campione maggiori, il campionamento PRT è rapido, può essere completato in 2 minuti, ben tollerato da popolazioni di...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato supportato dall'iniziativa InnoHK, dal Governo della Regione Amministrativa Speciale di Hong Kong e dal Centro di Ricerca per la Visione SHARP presso la Hong Kong Polytechnic University. Gli autori riconoscono inoltre con gratitudine il supporto tecnico dell'University Research Facility in Chemical and Environmental Analysis (UCEA) e dell'University Research Facility in Life Sciences (ULS) della Hong Kong Polytechnic University.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Acetonitrile (ACN), grado LC-MSRCI LabscanLM1005
Colonna C18 DI ACQUITY UPLC CSHWaters Corporation186005297130Å, 1.7 µ m, 2,1 mm X 100 mm
Formiato di ammonio, grado LC-MSSigma-Aldrich55674
Fiala di vetro autocampionatoreWell Rich Scientific2ML-9-V1002Fiala a filettatura a vite 9-425 in vetro trasparente da 2mL 12*32mm con filettatura a vite 9-425 (CON blocco da scrittura)
Aperto 9-425 coperchio a vite a costolature aperte e blu  Well Rich Scientific9-SP1003con 9mm, PTFE bianco/Silicone rosso Septa 1mm
Cloroformio, grado HPLCReagenti di Duksan1271
Tubi Eppendorf Safe-Lock, 1,5 mLEppendorf30120086
Acido Formico (FA),   Grado LC-MSThermoFisher ScientificA117-50
Micro-inserto in vetroWell Rich Scientific2ML-N2002250 & micro; Inserto L, vetro trasparente, base conica con polimolla, dimensioni: 5,8*28,5mm
Isopropanolo, grado LC-MSRCI LabscanLM1162
LipidSearch SoftwareThermoFisher ScientificOPTON-30879Versione 5
Metanolo,   Grado LC-MSRCI LabscanLM1115
Filo rosso di fenolo  (PRT)Tianjin Jingming New Technology Development Co., Ltd20192160086
Centrifuga refrigerataThermoFisher Scientific75007200
Concentratore centrifugo refrigerato CentriVap e trappole fredde CentriVapLabconco16108335
Tubi Microscopici a VittaThermoFisher Scientific3488
Etere metilico tert-butil (MTBE), grado HPLCReagenti di Duksan1070
Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 HPLCThermoFisher ScientificULTIM3000RSLCNANO
Thermo Scientific Orbitrap IQ-X Tribrid MSThermoFisher ScientificFSN05-10001
ThermoMixer CEppendorf5382000015
Purificatore a ultrasuoniCrest UltrasonicP500D-45
Miscelatore a vorticeBenchmarkBV1003

References

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