Articolo metodologico

Imaging su cellule vive della permeabilizzazione della membrana lisosomiale durante la necroptosi

DOI:

10.3791/69495

⸱

14 novembre 2025

 ,  ,  , 
1Center for Regenerative Medicine, Heart Institute, Department of Internal Medicine, Morsani College of Medicine, University of South Florida

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive un metodo di imaging su cellule vive per monitorare la permeabilizzazione della membrana lisosomiale durante la necroptosi, utilizzando sonde fluorescenti che rilevano cambiamenti nell'integrità e nell'acidificazione della membrana lisosomiale.

Abstract

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La necroptosi, una forma di necrosi regolata, culmina nella rottura della membrana cellulare. Il nostro laboratorio e altri hanno scoperto che la permeabilizzazione della membrana lisosomiale (LMP) è un evento precoce e cruciale in questo processo, che precede la rottura della membrana. La LMP rapida rilascia potenti enzimi lisosomiali, in particolare proteasi, nel citosol, promuovendo attivamente la morte cellulare. L'imaging su cellule vive fornisce uno strumento prezioso per rilevare la LMP durante la necroptosi in tempo reale. Diversi coloranti fluorescenti sono altamente efficaci: (1) i coloranti LysoTracker sensibili al pH tengono traccia delle variazioni del pH lisosomiale. Una diminuzione del segnale di fluorescenza indica una perdita del gradiente di pH lisosomiale, un segno primario di disfunzione lisosomiale, che può essere un precursore o una conseguenza diretta della LMP. (2) Le perle di destrano marcate con fluoresceina vengono internalizzate e si accumulano nei lisosomi. Il loro rilascio nel citosol segnala la completa LMP e la perdita del carico. Qui, abbiamo osservato una progressiva perdita della fluorescenza del Lysotracker, con diffusione della fluorescenza del destrano nel citosol dopo l'induzione della necroptosi. Pertanto, la metodologia di imaging su cellule vive consente ai ricercatori di tracciare con precisione i tempi e l'entità della disfunzione lisosomiale, contribuendo a una comprensione più completa dei meccanismi di necroptosi e illuminando potenziali interventi terapeutici.

Introduzione

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La necroptosi è una forma di morte cellulare regolata indipendente dalla caspasi implicata in molte malattie infiammatorie, malattie neurodegenerative, malattie polmonari, epatiche e cardiache 1,2,3. Questa via è mediata da una complessa cascata di reazioni che culminano nell'attivazione della proteina chinasi 1 (RIPK1) che interagisce con la proteina chinasi 3 (RIPK3) attraverso i domini 4,5,6 del motivo di interazione omotipica RIP (RHIM). RIPK3, a sua volta, recluta la proteina chinasi-simile a lignaggio misto (MLKL) per formare il necrosoma 7,8. La fosforilazione di MLKL da parte di RIPK3 porta alla sua oligomerizzazione e successiva polimerizzazione. I polimeri MLKL si traslocano quindi nelle membrane cellulari, portando infine alla rottura della membrana cellulare e alla morte cellulare 9,10,11. Tuttavia, i meccanismi attraverso i quali i polimeri MLKL traslocano nei compartimenti di membrana e inducono la rottura della membrana non sono completamente compresi.

I lisosomi sono organelli responsabili della degradazione e del riciclaggio dei materiali cellulari. Nel suo lume sono presenti proteasi, lipasi, nucleasi e idrolasi che sono responsabili della digestione delle macromolecole, mantenendo così l'omeostasi cellulare12,13. Pertanto, il mantenimento dell'integrità lisosomiale e della corretta funzione è essenziale per garantire un'efficace clearance cellulare, adattamenti allo stress e sopravvivenza cellulare globale 14,15,16. Studi recenti indicano un'associazione tra necroptosi e permeabilizzazione della membrana lisosomiale (LMP)17,18,19.

Le nostre recenti osservazioni hanno dimostrato che la LMP è un evento precoce e significativo nel processo di necroptosi, che precede la rottura finale della membrana cellulare19. In particolare, la polimerizzazione di MLKL sulla membrana lisosomiale induce una rapida LMP a rilasciare potenti enzimi lisosomiali, in particolare proteasi, inclusa la catepsina B, nel citosol. Queste proteasi poi scindono le proteine vitali per promuovere la morte cellulare. È importante sottolineare che l'inibizione dell'attività di CTSB protegge fortemente dalla morte cellulare19,20. Questi dati suggeriscono che la LMP è un modulatore cruciale della via della necroptosi. Pertanto, il monitoraggio della tempistica della LMP durante la necroptosi è essenziale per comprendere i meccanismi molecolari e identificare potenziali bersagli terapeutici.

Molti metodi convenzionali di rilevazione LMP, come l'immunocolorazione, la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) o la citometria a flusso, richiedono campioni fissi o forniscono comunque solo informazioni sull'endpoint 21,22,23, non riuscendo a catturare il processo dinamico di disgregazione lisosomiale, in particolare nel contesto di una rapida progressione della necroptosi. Al contrario, il metodo di imaging su cellule vive consente la visualizzazione ad alta risoluzione e in tempo reale della LMP durante la necroptosi. In questo protocollo, abbiamo combinato due marcatori lisosomiali complementari e la necroptosi indotta in cellule HT-29 per analizzare l'integrità della membrana lisosomiale in tempo reale19. Questa tecnica fornisce una piattaforma robusta e adattabile per lo studio della LMP non solo nella necroptosi, ma anche potenzialmente in altre forme di stress cellulare in cui l'integrità lisosomiale è compromessa, in particolare nel contesto di malattie o nell'uso di terapie mirate ai lisosomi 24,25,26.

Protocollo

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1. Coltura cellulare - giorno 0

  1. Piastra 5.000 cellule in 2 mL di DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) integrata con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina e streptomicina (P/S) in un piatto sterile con fondo di vetro.
  2. Incubare le cellule a 37 °C con CO2 al 5% per una notte.

2. Caricamento delle perle di destrano - giorno 1

  1. Diluire le perle di destrano verde a 25 μg/mL in DMEM fresco integrato con il 10% di FBS e l'1% di P/S aggiungendo 20 μL della soluzione madre da 2,5 mg/mL.
  2. Rimuovere il vecchio terreno e sostituirlo con 2 mL di DMEM contenente perle integrato con il 10% di FBS e l'1% di P/S.
  3. Incubare la cellula per 24 ore a 37 °C con CO2 al 5% per consentire l'internalizzazione delle perle nei lisosomi.

3. Colorazione Lysotracker - giorno 2 (giorno dell'esperimento)

  1. Preparare il terreno di colorazione aggiungendo 2 μL di soluzione madre Lysotracker da 1 mM a 2 mL di DMEM fresco integrato con il 10% di FBS e l'1% di P/S per ottenere una concentrazione finale di 1 μM. Sostituire il vecchio terreno con questa soluzione colorante.
  2. Incubare a 37 °C con il 5% di CO2 per 2 ore, seguendo il tempo di incubazione raccomandato (da 30 minuti a 2 ore) fornito nelle Linee guida per l'uso delle sonde molecolari di Life Technologies27. Nei nostri esperimenti, 2 ore di incubazione in cellule HT-29 hanno portato a una robusta colorazione dei puncta con una forte colocalizzazione con perle di destrano, indicando una fluorescenza stabile del colorante.
    NOTA: Accendere il microscopio confocale 30 minuti prima dell'imaging di cellule vive.

4. Configurazione del microscopio confocale

  1. Accendere i componenti del sistema confocale nel seguente ordine: microscopio PC; potenza dello scanner; potenza laser; emissione laser; Potenza Leica.
  2. Attiva i controlli ambientali: The Cube - regolatore di temperatura; Il Brick - Regolatore del miscelatore di gas CO2 . Alimentazione aperta di CO2 e O2 .
  3. Imposta i parametri del gas:
    1. Impostare il regolatore di temperatura (il cubo) su 37 °C.
    2. Impostare il regolatore di gas e umidità (il mattone) al 5% di CO2 e al 95% di umidità.
  4. Assemblare la camera di imaging come mostrato nella Figura 1.
  5. Impostare l'obiettivo confocale:
    1. Utilizzare un obiettivo a immersione in olio 63x/1,40 NA.
    2. Impostare i laser di eccitazione su 488 nm (fluoroforo verde) e 555 nm (fluoroforo rosso).
    3. Per il laser a 488 nm, selezionare un rivelatore ibrido (HyD) e per il laser a 555 nm, selezionare un rivelatore PMT.
      NOTA: La diafonia della fluorescenza è stata ridotta al minimo utilizzando gate predefiniti nel software confocale, che ha confermato l'assenza di diafonia tra i canali.

5. Preparazione post-colorazione (dopo l'incubazione di LysoTracker)

  1. Lavare accuratamente le cellule tre volte con 2 ml di PBS.
  2. Aggiungere 2 ml di DMEM fresco integrato con il 10% di FBS e l'1% di P/S.
  3. Applicare una goccia di olio da immersione sulla lente dell'obiettivo prima dell'imaging.
  4. Montare il piatto sul tavolino del microscopio.
  5. Regola l'intensità e lo sfondo del laser.
    1. Regolare l'intensità del laser fino al 3%, ma non più del 5%.
    2. Regolare il guadagno del rivelatore nel software del microscopio per ottimizzare il segnale.
    3. Per ridurre a icona lo sfondo, regolare la barra del contrasto.
  6. Acquisire immagini di base di cellule non trattate (prima dell'aggiunta di T/S/Z), che fungono da condizione di controllo.
  7. Rimettere la piastra nella cappa a flusso laminare e aggiungere 1 mL di DMEM integrato con il 10% di FBS e l'1% di P/S, contenente 100 ng/mL di TNF-α (T), 500 nM di SMAC mimetico (S) e 100 μM di Z-VAD-FMK (Z).
  8. Continuare l'imaging al microscopio confocale.
    NOTA: T/S/Z sono stati aggiunti intenzionalmente a concentrazioni più elevate rispetto ai protocolli standard. Questa scelta è stata fatta per accelerare la LMP e la morte cellulare, consentendo di catturare gli eventi precoci in modo più affidabile nell'imaging in tempo reale.

6. Impostazioni di acquisizione delle immagini

  1. Nel software di acquisizione, impostare i parametri come segue: modalità: xyt; formato: 512 x 512; velocità: 400; zoom: 3; media delle linee: 1; accumulo di linee: 3; accumulo di frame: 1; intervallo di tempo: 3 min; durata: 8 ore; Abilita la messa a fuoco automatica.
  2. Fare clic su Avvia per avviare l'acquisizione time-lapse.

Risultati

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Le procedure descritte in questo protocollo consentono l'acquisizione di immagini di cellule vive utilizzando la microscopia confocale per monitorare la LMP in tempo reale. La Figura 1 illustra una rappresentazione schematica del protocollo sperimentale, dalla placcatura cellulare all'acquisizione delle immagini. Il giorno 0, 5.000 cellule HT-29 sono state piastrate e incubate per 24 ore a 37 °C e 5% di CO2. Dopo 24 ore (Giorno 1), le cellule sono state incubate con perle di destrano marcate con fluoresceina (25 μg/mL) per altre 24 ore nelle stesse condizioni. Queste perle vengono internalizzate dall'endocitosi e dal traffico verso i lisosomi, dove si accumulano e appaiono come punti luminosi. Il giorno 2 (giorno dell'esperimento), le cellule sono state trattate con il colorante LysoTracker sensibile al pH (1 μM) per 2 ore a 37 °C e 5% di CO2. LysoTracker si concentra e mostra una forte fluorescenza all'interno di compartimenti acidi, come gli endosomi tardivi e i lisosomi. Trenta minuti prima dell'imaging, il sistema di microscopio confocale è stato acceso e stabilizzato, compresi i regolatori di temperatura, gas e umidità, come descritto nel passaggio 4 del protocollo. La camera di imaging è stata assemblata, come dimostrato nella Figura 2. Sono stati utilizzati i laser da 488 nm (verde) e 555 nm (rosso).

Dopo l'incubazione con LysoTracker, le cellule sono state accuratamente lavate tre volte con PBS e sono stati aggiunti 2 mL di DMEM fresco integrato con il 10% di FBS e l'1% di P/S. La lastra è stata trasferita al microscopio e una goccia di olio da immersione è stata applicata sull'obiettivo da immersione in olio 63x/1,40 NA. L'intensità del laser e i livelli di fondo sono stati quindi regolati per ottimizzare le condizioni di imaging, come descritto nel passaggio 5.5. del protocollo. Le nostre immagini iniziali hanno confermato la presenza di puncta stabili del Lysotracker e del destrano marcato con fluoresceina, indicando lisosomi intatti (Figura 3). Le immagini di base sono state acquisite prima di T/S/Z e utilizzate come controllo. Non è stato utilizzato alcun veicolo.

Dopo aver stabilito le impostazioni iniziali di imaging e microscopia, la piastra è stata rimessa nella cappa a flusso laminare ed è stato aggiunto 1 mL di DMEM integrato con il 10% di FBS e l'1% di P/S, contenente 100 ng/mL di TNF-α (T), 500 nM di SMAC mimetico (S) e 100 μM Z-VAD-FMK (Z). L'imaging è proseguito al microscopio confocale utilizzando il parametro di acquisizione dell'imaging descritto nella fase 6 del protocollo. Come mostrato nella Figura 3, nel filmato supplementare S1 e nel filmato supplementare S2, la progressiva diminuzione della fluorescenza di LysoTracker nelle cellule trattate con T/S/Z è servita come indicatore precoce della variazione lisosomiale. Questa perdita è stata seguita da, e occasionalmente si è verificata contemporaneamente, all'efflusso di destrano marcato con fluoresceina dai lisosomi al citosol (spostamento da puntato a diffuso), indicando LMP. A 8 ore, quasi tutto il segnale del Lysotracker è scomparso, tuttavia, molte cellule conservavano ancora i punti verdi con il segnale verde citosolico, suggerendo che la perdita del gradiente di pH lisosomiale precede la LMP completa e il rilascio del carico.

Figura 1
Figura 1: Rappresentazione schematica del protocollo sperimentale. (Creato nel BioRender.com) Inizialmente, 5.000 cellule sono state piastrate (0 h) e incubate per 24 h; successivamente, sono state aggiunte perle di destrano (25 μg/mL) e incubate per altre 24 ore. A 48 ore, è stato aggiunto LysoTracker (1 μM) e incubato per 2 ore. Le cellule sono state lavate tre volte con PBS (fase 1), seguite dall'aggiunta di 2 mL di DMEM fresco integrato con il 10% di FBS e l'1% di P/S (fase 2). Le impostazioni della microscopia sono state regolate (fase 3) e le cellule sono state trattate con TNF-α (T), SMAC mimetico (S) e inibitore della pan-caspasi Z-VAD-FMZ (Z) (fase 4), prima dell'acquisizione dell'immagine della cellula viva (fase 5). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2: Schema della configurazione della camera di imaging. (A) Il supporto del campione, (B) la camera di incubazione del gas e (C) il coperchio superiore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Immagini rappresentative delle cellule HT29 prima e dopo il trattamento T/S/Z. Le cellule sono state colorate con perle di Lysotracker rosso e destrano verde e trattate con TNF-α (T), SMAC mimetico (S) e inibitore della pan-caspasi Z-VAD-FMZ (Z). Barra della scala: 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Filmato supplementare S1: Time-lapse di cellule HT29 incubate con perle verdi di destrano e trattate con T/S/Z. Le cellule sono state monitorate per oltre 6 ore per valutare la risposta cellulare. Clicca qui per scaricare questo filmato.

Filmato supplementare S2: Time-lapse di cellule HT29 incubate con LysoTracker red e trattate con T/S/Z. Le cellule sono state monitorate per oltre 6 ore per valutare la risposta cellulare. Clicca qui per scaricare questo filmato.

Discussione

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Questo protocollo ha dimostrato che la combinazione di LysoTracker e perle di destrano marcate con fluoresceina consente il monitoraggio simultaneo del pH lisosomiale e del rilascio di carico in tempo reale. I risultati rappresentativi (Figura 3, film supplementare S1 e film supplementare S2) confermano che le cellule non trattate mantengono un segnale puncta stabile per entrambi i marcatori. Al contrario, il trattamento T/S/Z indica una progressiva perdita dell'intensità del Lysotracker e uno spostamento del destrano dalla distribuzione puncta a quella citosolica diffusa, coerente con la LMP.

Un primo passo fondamentale in questo protocollo è la selezione delle cellule per l'acquisizione delle immagini. I nostri dati precedenti dimostrano che il trattamento T/S/Z causa la morte di circa l'80% delle cellule HT-29 entro 24 ore, mentre il restante 20% sopravvivea 19. Poiché la LMP non è presente all'inizio dell'esperimento, le cellule vengono inizialmente selezionate in base alla morfologia e al loro doppio segnale positivo sia per il LysoTracker che per le perle di destrano. Sebbene questo metodo non sia in grado di prevedere quali cellule specifiche saranno sottoposte a LMP, abbiamo costantemente osservato che circa il 60% della popolazione monitorata alla fine mostra LMP durante il periodo di imaging di 8 ore. Un'altra sfida deriva dalla natura intrinseca dell'imaging sequenziale. Una leggera deriva nella posizione Z della cella, che si verifica durante l'acquisizione dell'immagine ogni 3 minuti, impedisce il tracciamento continuo dello stesso segnale puncta durante l'intero esperimento. Inoltre, le cellule migrano e subiscono cambiamenti morfologici in risposta al trattamento T/S/Z28. Di conseguenza, è impossibile seguire la dinamica dei singoli lisosomi durante il periodo di imaging. Nell'imaging a lungo termine di cellule vive, il potenziale contributo della fototossicità come mediatore della morte cellulare è una considerazione importante. L'eccitazione continua durante sessioni prolungate può generare specie reattive dell'ossigeno e compromettere la vitalità cellulare29, interferendo potenzialmente con la risposta necroptotica genuina. Per ridurre al minimo questo effetto, abbiamo applicato una bassa potenza del laser e tempi di esposizione brevi. Inoltre, è stata somministrata una concentrazione cinque volte di T/S/Z per accelerare il processo di morte cellulare. Tuttavia, non possiamo escludere del tutto il contributo dello stress indotto dalla luce alle modificazioni lisosomiali osservate.

Un importante vantaggio di questo protocollo di imaging su cellule vive è la sua capacità di monitorare la variazione del pH lisosomiale e la LMP in tempo reale, catturando eventi dinamici che non vengono rilevati dalle analisi degli endpoint, come la TEM, la citometria a flusso e l'immunocolorazione. Sebbene la TEM offra informazioni strutturali ad alta risoluzione, non è in grado di catturare la progressione temporale della LMP. Anche i metodi alternativi su cellule vive, come i saggi di riposizionamento dell'arancia acridina30 o la formazione di galectina-puncta31, sono strumenti preziosi per monitorare l'integrità lisosomiale, ma ciascuno di essi presenta dei limiti se utilizzati isolatamente. Il test dell'arancia acridina riporta la ridistribuzione del colorante dagli organelli acidi al citosol, che è influenzata sia dalle variazioni di pH lisosomiale che dalla permeabilizzazione della membrana, e quindi non è direttamente correlata con il rilascio di carico. Allo stesso modo, la formazione di galectina-puncta riflette l'esposizione dei glicani luminali al citosol e quindi segna il danno alla membrana lisosomiale31,32, ma non discrimina tra permeabilizzazione parziale e rottura lisosomiale completa.

Il punto di forza di questo protocollo risiede nella combinazione di LysoTracker e perle di destrano, che consente l'indagine simultanea dell'acidificazione lisosomiale e delle perdite di carico. Ciò fornisce un'esclusiva doppia lettura sia della funzionalità lisosomiale che dell'integrità strutturale. Lo sbiadimento di LysoTracker funge da indicatore di una variazione del pH lisosomiale, mentre il rilascio di destrano segnala direttamente la perdita fisica del contenuto lisosomiale. Utilizzando questi due marcatori insieme, miglioriamo significativamente il rilevamento di LMP sia parziale che completo. Pertanto, questa strategia di imaging su cellule vive è ampiamente applicabile. I ricercatori possono adattarlo per l'uso con altri tipi di cellule e diverse sonde fluorescenti per studiare l'integrità lisosomiale in varie condizioni sperimentali, comprese le perturbazioni farmacologiche o genetiche. Questa capacità è fondamentale per far progredire la nostra comprensione dei meccanismi della necroptosi e identificare potenziali interventi terapeutici.

Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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La ricerca nel laboratorio del Dr. Zhigao Wang è supportata da sovvenzioni NIH R35GM158455 e R01GM147474.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Celle HT-29ATCCHTB-38Cellule del cancro al colon
Vasto da 35 mm con fondo di vetroMatTek CorporationP35G-1.5-14-C-GRD
Incubatore CO2PHCBIMCO-170AICUVL
Microscopio ConfocaleLeicaSP8WLL
Perle verdi DextranoThermoFisherD1820Dextran, Fluoresceina, 10.000 MW, Anionico, Lisina Risolvibile
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Corning 10-013-CV
Siero Fetale Bovino (FBS)Cytiva & nbsp;SH30910.03
LysoTracker Red DND-99InvitrogenL7528
Tipo HF a immersione in olioScienze della microscopia elettronica16915-01
Penicillina e Streptomicina (P/S) Sigma-AldrichP4333
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Corning21-040-CV
Mimetico Smac (S)BV6, ApexBio, CatalogoB4653Concentrazione finale, 1 mM
The Brick Servizi di imaging biologico13685Regolatore di CO2 a miscelatore di gas
Il CuboServizi di imaging biologicoCBO2AMicroscopi da camera di controllo della temperatura
Fattore di Necrosi Tumorale alfa (TNF-&alfa; - T)Peprotech30001A100UGConcentrazione finale, 20 ng/ml
z-VAD-FMK (Z)ApexBioA1902Concentrazione finale, 20 mM

Riferimenti

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